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Artículo de método

Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

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DOI:

10.3791/63130

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1 de abril de 2022

 , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos el protocolo para la reconstitución escalonada de células presentadoras de antígenos sintéticos utilizando bicapas lipídicas soportadas por perlas y su uso para interrogar la salida sináptica de las células T activadas.

Resumen

Las células presentadoras de antígenos (APC) presentan tres señales activadoras a las células T que participan en contacto físico: 1) antígeno, 2) coestimulación/corepresión y 3) citoquinas solubles. Las células T liberan dos tipos de partículas efectoras en respuesta a la activación: vesículas transsinápticas (tSV) y partículas de ataque supramolecular, que transfieren mensajeros intercelulares y median la citotoxicidad, respectivamente. Estas entidades son rápidamente internalizadas por apces que participan en contacto físico con células T, lo que hace que su caracterización sea desalentadora. Este artículo presenta el protocolo para fabricar y utilizar bicapas lipídicas soportadas por perlas (BSLB) como miméticas de células presentadoras de antígenos (APC) para capturar y analizar estas partículas transsinápticas. También se describen los protocolos para las mediciones absolutas de densidades de proteínas en las superficies celulares, la reconstitución de BSLB con tales niveles fisiológicos y el procedimiento de citometría de flujo para rastrear la liberación de partículas sinápticas por las células T. Este protocolo se puede adaptar para estudiar los efectos de proteínas individuales, mezclas de ligandos complejos, determinantes de virulencia de patógenos y fármacos en la producción efectora de las células T, incluidas las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, las células T reguladoras y las células T que expresan el receptor de antígenos quiméricos (CART).

Introducción

La sinapsis inmunológica (IS) es una estructura molecular fundamental formada en la interfaz de las células que participan en contacto físico que facilita el intercambio regulado de información de yuxtracrina. Se han descrito diferentes IS en la literatura, y un creciente cuerpo de evidencia sugiere que estos centros moleculares son una característica conservada de las redes celulares. Varias células inmunes, incluidas las células B, las células asesinas naturales, las células dendríticas, los macrófagos y las células T, intercambian información a través del ensamblaje de contactos de corta duración1. Los estudios multiómicos están avanzando en la comprensión de nuevos subconjuntos de leucocitos y células estromales que impulsan las redes celulares patógenas y expresan proteínas de superficie con funciones desconocidas. Como APC sintéticos, los BSLB permiten la investigación directa del papel funcional de las proteínas individuales en la integración de señales activadoras, a saber, antígenos y coestimulación/ corepresión, por parte de las células T y la liberación resultante de partículas efectoras denominadas señal cuatro.

Este documento describe los protocolos y los puntos técnicos críticos a considerar al usar BSLB para imitar la composición superficial de los APC modelo. Los protocolos para la medición cuantitativa de los receptores inmunes y otras proteínas de superficie en los APC se presentan junto con el protocolo para la reconstitución de apces sintéticos que contienen estas cantidades medidas. Luego, se presentan los pasos necesarios para coculturizar células T y BSLB junto con el protocolo para la medición cuantitativa de la transferencia transsináptica de partículas mediante citometría de flujo. Lo más notable es que los BSLB facilitan el estudio de una población de tSV derivada de la membrana plasmática denominada ectosomas sinápticos (SE). Los SE enriquecidos con receptores de antígenos de células T (TCR+) se eliminan en respuesta a la activación de TCR2 y son capturados eficientemente por BSLBs3, lo que representa una excelente lectura para evaluar las propiedades agonísticas de los antígenos y la composición de la membrana modelada. Los exosomas CD63+ y las partículas de ataque supramolecular (SMAP) también son liberados por las células T estimuladas y capturados por los BSLB. Se pueden utilizar como lecturas adicionales de la activación y la secreción de gránulos exocíticos y líticos resultante por las células T. La movilización de vesículas exocitíticas al polo que interactúa de la célula T también facilita la liberación direccional de citoquinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 en respuesta a la activación4,5,6,7,8. Aunque las citoquinas liberadas por células T también se pueden detectar en BSLB, actualmente se está desarrollando un estudio más dedicado para validar el análisis cuantitativo de la liberación de citoquinas en la sinapsis inmunológica.

Para interrogar cómo las composiciones específicas de la membrana influyen en la producción sináptica de las células T se requiere definir la densidad fisiológica del componente de membrana objetivo. Las cuantificaciones basadas en citometría de flujo de proteínas de superficie celular son un paso esencial en este protocolo y requieren: 1) el uso de anticuerpos con números conocidos de fluorocromos por anticuerpo (F / P), y 2) perlas de referencia que proporcionen una referencia estándar para interpolar moléculas de fluorocromo a partir de intensidades de fluorescencia medias (IMF) medidas.

Estos estándares de referencia consisten en cinco poblaciones de perlas, cada una de las cuales contiene un número creciente de fluorocromos solubles equivalentes (MESF), que abarcan el rango dinámico de detección de fluorescencia arbitraria. Estas poblaciones estándar producen picos de fluorescencia discretos, lo que facilita la conversión de unidades de fluorescencia arbitrarias en MESF mediante regresión lineal simple. Los MESF resultantes se utilizan junto con los valores de anticuerpos F / P para calcular el número promedio de moléculas unidas por célula (o BSLB en pasos posteriores). La aplicación de las áreas de superficie celular estimadas al número promedio de moléculas detectadas permite el cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/μm2. Este protocolo de cuantificación también se puede adaptar a la medición de densidades de proteínas en células T y a la reconstitución bioquímica de composiciones de membrana que median la formación de sinapsis homotípicas de células T (es decir, sinapsis T-T9). Si es necesario, la valencia de la unión a anticuerpos se puede estimar aún más mediante el uso de objetivos recombinantes marcados con números conocidos de fluorocromos por molécula. Luego, la valencia de unión a anticuerpos se puede calcular para la misma población de BSLB comparando simultáneamente el número de proteínas fluorescentes unidas y anticuerpos de cuantificación (utilizando dos fluorocromos de cuantificación diferentes y estándares MESF).

La reconstitución de membranas APC requiere el ensamblaje de bicapas lipídicas soportadas (SLB) sobre perlas de sílice1. Las existencias de liposomas que contienen diferentes especies de fosfolípidos se pueden aprovechar para formar una matriz lipídica-bicapa versátil, lo que permite el anclaje de proteínas recombinantes con diferente química de unión (la preparación de los liposomas se detalla en 10). Una vez que se define la densidad fisiológica (o densidades) del ligando relevante "en las células", se adapta el mismo protocolo de citometría de flujo para estimar la concentración de proteína recombinante necesaria para recubrir los BSLB con la densidad fisiológica objetivo. Se pueden utilizar dos sistemas de anclaje diferentes en combinación o por separado.

En primer lugar, el SLB que contiene un 12,5 mol% final de fosfolípidos que contienen Ni2+ es suficiente para proporcionar aproximadamente 10.000 sitios de unión a la etiqueta His por micra cuadrada10 y funciona bien para decorar los BSLB con la mayoría de las proteínas disponibles comercialmente cuyas densidades fisiológicas no exceden esta capacidad de carga máxima. El segundo sistema de carga aprovecha los fosfolípidos que contienen biotina (como mol%) para cargar anti-CD3e Fab biotinilado (o monómeros HLA / MHC) a través de puentes de estreptavidina. La combinación de estos dos métodos de decoración BSLB permite la adaptación flexible de BSLB como APC sintéticos. Para composiciones superficiales de APC altamente complejas, el mol% de fosfolípidos y proteínas se puede aumentar para cargar tantas proteínas como la pregunta en cuestión requiera. Una vez que se definen las concentraciones de trabajo de proteínas y mol% de fosfolípidos biotinilados, los BSLB se pueden ensamblar para interrogar la salida sináptica de las células T con citometría de flujo multiparamétrica.

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Protocolo

1. Medición de densidades de proteínas de la superficie celular con citometría de flujo cuantitativa

  1. Preparar un tampón de citometría de flujo humano (hFCB) filtrado con 0,22 μm añadiendo EDTA (a una concentración final de 2 mM) y suero AB humano (hasta un 10% final) a solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 (ver Tabla 1). Filtre la solución con una unidad de filtro de poros de 0,22 μm para eliminar las impurezas séricas y almacenarla a 4 °C.
  2. Recuperar las células y sedimentarlas por centrifugación a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
  3. Lave las células dos veces con PBS. En cada paso de lavado, vuelva a suspender las células en PBS al volumen original (antes de la centrifugación) y gire hacia abajo a 300 × g durante 5 min en RT.
  4. Cuente las suspensiones de células teñidas de azul de tripano en un hemocitómetro11. Alternativamente, cuente las celdas utilizando la exclusión de corriente eléctrica. Para esto último, siga las instrucciones del fabricante de CASY-TT (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El contador de células CASY-TT permite la determinación del porcentaje de células viables, el tamaño de la célula y el volumen celular.
  5. Calcular el volumen de PBS que contiene una dilución 1:1.000 de colorante de viabilidad fijable eFluor 780 o similar (consulte la Tabla de materiales) necesario para resuspendir las células a una concentración de tinción de 107 células/ml.
  6. Resuspendir las células utilizando la solución de pbS de colorante de viabilidad e incubar en hielo durante 30 min.
  7. Retire el tinte de viabilidad agregando un volumen de hFCB helado. Girar hacia abajo a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: A partir de ahora, mantenga la cadena de frío intacta.
  8. Lave las células con hFCB que contenga una dilución 1:50 de la solución de bloqueo del receptor Fc (consulte la Tabla de materiales). Lleve el volumen a una concentración final de 107 células / ml e incube durante 15 minutos adicionales para lograr un bloqueo eficiente de FcgR.
  9. Distribuya 100 μL de la suspensión celular (es decir, 106 células) por pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U o con fondo en V. Mantenga las celdas en hielo y protegidas de la luz (cubra con papel de aluminio).
  10. Prepare una mezcla maestra de anticuerpos en hFCB definiendo las concentraciones óptimas de anticuerpos para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo y, lo que es más importante, para los anticuerpos utilizados para determinar las densidades de proteínas de superficie. Por ejemplo, para la cuantificación de la expresión de ICAM-1 en poblaciones de células amigdalares, como se muestra en la Figura 1, prepare una mezcla que contenga diluciones 1:200 de anti-CD4, anti-CD19 y anti-CXCR5 junto con concentraciones saturantes de un anticuerpo anti-ICAM-1 con fluorocromos AF647 conocidos por anticuerpo (es decir, 10 μg / ml, que se definió mediante experimentos independientes de titulación de anticuerpos).
  11. Como controles adicionales, prepare una mezcla maestra de anticuerpos que contenga los controles de isotipo de anticuerpos relevantes (a las mismas concentraciones efectivas que sus contrapartes conjugadas con los mismos fluorocromos para la sustracción de fondo), es decir, use 10 μg / ml de un control de isotipo AF647 relevante.
    NOTA: En el ejemplo anterior, dicho control de isotipo se utiliza para restar la fluorescencia de fondo de la verdadera señal ICAM-1 en las células.
  12. Al cuantificar las densidades de proteínas en subconjuntos celulares presentes a bajas frecuencias dentro de los tejidos, prepare controles de fluorescencia menos uno (FMO) que contengan todos los anticuerpos de tinción excepto los marcadores de interés (ver más detalles en 12).
  13. Gire hacia abajo la placa de 96 pocillos que contiene las células a 300 × g durante 5 min a 4 °C, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 50 μL de la mezcla maestra de anticuerpos de cuantificación o de la mezcla maestra de anticuerpos de isotipo.
  14. Incubar las células durante al menos 30 min a 4 °C y 400 rpm utilizando un agitador de placas. Proteja las placas de la luz (cubra con papel de aluminio).
  15. Lave las células tres veces con hFCB y centrífuga a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
  16. Resuspend el pellet celular usando 200 μL de PBS (es decir, a una concentración final de 5 × 106 células/ml).
  17. Para adquisición:
    1. Si utiliza un cargador BD FACS estándar, transfiera las muestras a tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml (consulte la Tabla de materiales).
    2. Si utiliza muestreadores de alto rendimiento (HTS, también conocidos como lectores de placas), continúe inmediatamente con el paso 1.19.
  18. Antes de proceder con la adquisición de datos para los estándares MESF, verifique los límites máximos y mínimos de linealidad de intensidad de fluorescencia para los canales de cuantificación.
  19. Antes de la compensación, adquiera datos para los estándares MESF, asegurando que tanto las poblaciones más tenues como las más brillantes caigan en el rango lineal de medición.
  20. Adquirir las muestras de compensación. Mantenga los valores de voltaje del tubo fotomultiplicador (PMT) para los canales de cuantificación sin cambios para preservar el rango dinámico de detección. Realice ligeros ajustes en el voltaje PMT de otros canales antes de calcular las matrices de compensación.
  21. Calcular y aplicar la compensación.
  22. Adquiera y guarde un mínimo de 2 × 104 cuentas MESF totales para cada uno de los canales de cuantificación.
  23. Seleccionar la población de células individuales en función de sus áreas de dispersión de luz lateral y delantera (SSC-A y FSC-A, respectivamente, como se muestra en la Figura 1A (i)), seguido de la selección de eventos dentro del continuo de tiempo (Figura 1A (ii)) y bajo para el tiempo de vuelo (W) tanto en FSC como en SSC en comparación con sus alturas (es decir, FSC-W/FSC-H, seguido de la compuerta SSC-W/SSC-H como se muestra en la Figura 1A (iii) y (iv), respectivamente). Defina una puerta final de evento único que contenga eventos con distribución proporcional FSC-A versus FSC-H (Figura 1A (v)).
  24. Adquirir muestras de control (controles isotipados y FMO).
  25. Adquirir muestras y registrar hasta que se hayan adquirido un mínimo de 10.000 células diana.
    NOTA: la determinación robusta de densidades moleculares promedio requiere el análisis de varios donantes a través de experimentos independientes. Esto es crucial cuando se analizan subconjuntos celulares encontrados en frecuencias reducidas o derivados de material biológico escaso (por ejemplo, de biopsias de tejidos humanos).
  26. Lave el citómetro durante 5 minutos con una solución de limpieza FACS seguida de 5 minutos de agua ultrapura antes de apagar el instrumento. Si utiliza el HTS, siga las opciones de la pestaña HTS y el programa Clean Plate.
    NOTA: Para reducir el arrastre de muestra a muestra, active las opciones de lavado de muestras de alto rendimiento o lavado de muestras de alto rendimiento , que lavarán automáticamente el citómetro entre tubos o pozos. Antes de comenzar la adquisición, ejecute agua ultrapura durante 10 minutos a una alta velocidad de flujo para eliminar cualquier contaminante biológico sin lavar de la línea de muestra del citómetro.
  27. Exporte los archivos del estándar de citometría de flujo (FCS).

2. Análisis de regresión de intensidad de fluorescencia (IMF) de media (o mediana) sobrecorregidas por mesF

  1. Abra el software de análisis de citometría de flujo y cargue los archivos FCS del experimento. Seleccione la población de perlas en función de sus áreas de dispersión de luz lateral y delantera (SSC-A versus FSC-A), como se muestra en la Figura 1A (i).
  2. Controle la calidad de los datos comprobando la distribución de eventos individuales a lo largo del tiempo, como se indica en el paso 1.24.
    NOTA: Las burbujas crean brechas en la distribución de eventos a lo largo del tiempo; esto suele aparecer al comienzo de la adquisición utilizando el HTS. Evite seleccionar eventos que flanqueen brechas en el tiempo de adquisición, ya que estos agregan errores de medición debido a aberraciones ópticas.
  3. Concéntrese en los eventos individuales.
    1. Células
      1. Identificar células individuales primero en función de su distribución SSC-A y FSC-A (Figura 1A (i)), seguido de eventos bajos para W en las puertas secuenciales FSC-W/FSC-H (singletes-1, Figura 1A panel (iii)) y SSC-W/SSC-H (singletes-2; Figura 1A panel (iv)). Defina una puerta singlets-3 adicional seleccionando eventos con FSC-A y FSC-H proporcionales (Figura 1A, panel (v)). Finalmente, identifique las células vivas como aquellas negativas para el colorante de viabilidad fijable.
    2. Cuentas MESF
      1. Siga la misma discriminación de singletes-1 a singlets-3 que en el paso 2.3.1.1 (Figura 1B, paneles (i) a (v)). Identifique cada una de las poblaciones de MESF (en blanco, 1, 2, 3 y 4) en función de sus niveles de intensidad de fluorescencia (ver Figura 1B, panel (vi)).
  4. Extraiga la IMF de fracciones MESF en blanco y 1 a 4.
  5. Genere valores corregidos de IMF (cMFI) para las fracciones MESF 1 a 4 restando las IMF de la población de cuentas en blanco de cada fracción.
  6. Calcular la línea de mejor ajuste para la relación entre cMFIs y los valores MESF proporcionados por el proveedor (variable independiente, siendo fracción en blanco igual a cero).
  7. Extraer la pendiente (b en la ecuación siguiente) de la regresión lineal de MESF sobre cMFI (El panel de la Figura 1B (viii) muestra una regresión en la que y = a + bx; con a = 0).
  8. Extraer las intensidades de fluorescencia medianas (para distribuciones de fluorescencia bimodal) o medias (para distribuciones de fluorescencia normales o logarítmicas) de las poblaciones de interés (TFH y células B en el panel (vii) de la Figura 1A).
  9. Al igual que en los pasos 2.5-2.7, extraiga los valores de MFI de las celdas de control marcadas con isotipos.
  10. Si el F/P de los controles de isotipo es el mismo que el de los anticuerpos de cuantificación, corrija las IMF de las células teñidas restando las IMF de las células marcadas con isotipo.
  11. Si el F/P de los isotipos difiere del de los anticuerpos de cuantificación, extraiga el MESF de los isotipos dividiendo las IMF de las células marcadas con isotipo con la pendiente calculada en el paso 2.7. Reste el isotipo MESF de la cuantificación MESF antes de estimar los anticuerpos de cuantificación unidos.
  12. Dividir el MESF por el F/P de los anticuerpos de cuantificación para estimar el número de moléculas unidas por célula (Molec. como se muestra en el diagrama de flujo de la Figura 1C).
  13. Divida el número de moléculas unidas con el área de superficie celular estimada (CSA (μm2)) para extraer la densidad de proteínas como molc./μm2 (Figura 1C). Consulte la sección de resultados representativos para obtener más detalles.

3. Especies de fosfolípidos funcionales para usar en la calibración de proteínas que recubren BSLBs

  1. Utilice 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) como el componente principal de la matriz lipídica que forma la bicapa lipídica soportada. Diluya todas las demás especies de lípidos en esta solución DOPC.
  2. Use entre 0.2 y 1 mol% de 0.4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) conjugado a colorantes, incluyendo ATTO 390, 488 o 565 (ver la Tabla de Materiales), para generar BSLB con fluorescencia intrínseca.
    NOTA: La fluorescencia intrínseca de los BSLB facilita la identificación de BSLB individuales y células individuales en experimentos de transferencia sináptica.
  3. Utilice 12,5 mol% de 0,4 mM de ácido iminodiacético DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil) succinil]) para anclar las proteínas marcadas con His. Mantenga constante el mol% de DGS-NTA(Ni) y realice 2 valoraciones de las proteínas marcadas con His a partir de 100 nM como la concentración más alta. Deje una condición sin proteína como control negativo para las cuantificaciones absolutas.
    NOTA: Las señales accesorias y las moléculas de adhesión, como ICAM-1, están diseñadas con una etiqueta de 12-His para aumentar la afinidad de la proteína por DGS-NTA(Ni).
  4. Use Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) para anclar proteínas biotiniladas a través de puentes biotin-streptavidin-biotin. Utilice una titulación en serie de 5 veces de 0,4 mM Biotinyl Cap PE que cubra entre 10 mol% y 0 mol% (como control negativo). Mantener constante la concentración de estreptavidina y proteínas biotiniladas (200 nM) tanto en experimentos de calibración como en la reconstitución de APC sintéticos para experimentos de transferencia sináptica.
    NOTA: Los análisis de regresión de densidades empíricas de proteínas biotiniladas sobre el mol% final de Biotinyl Cap PE en la matriz lipídica (que también contiene DGS-NTA(Ni) para anclar proteínas marcadas con His) definirán el mol% que se utilizará para reconstituir las densidades objetivo del antígeno.

4. Preparación de solución salina tamponada HEPES suplementada que contiene albúmina sérica al 1%

NOTA: Se requiere solución salina tamponada con HEPES suplementada que contenga 1% de albúmina sérica humana (HBS/HSA) o 1% de albúmina sérica bovina (HBS/BSA) en las etapas de lavado y carga de proteínas de BSLB (Tabla 1). Prepare una solución de stock de HBS 10x y el búfer de trabajo lo más fresco posible; mantener refrigerado y usar en el plazo de un mes. Si bien BSA es una alternativa más barata a HSA, proporciona un bloqueo eficiente de los lípidos quelantes de Ni13 y se recomienda para experimentos de alto rendimiento.

  1. Prepare una solución tampón madre 10x de HBS suplementado que contenga 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM de glucosa, 10 mM de CaCl2 y 20 mM de MgCl2.
    NOTA: Disolver MgCl2 es altamente exotérmico y un peligro de quemaduras. Agregue esta sal lentamente y sobre un gran volumen de disolvente. Evite preparar soluciones concentradas (es decir, 1 M) de estas sales, ya que tienden a precipitarse con el tiempo, lo que dificulta su adición precisa al tampón de trabajo.
  2. Filtre la solución 10x con una unidad de filtro de 0,22 μm y manténgala estéril a 4 °C.
  3. Para 500 ml de HBS/has, tome 50 ml de la solución suplementada de 10x HBS, ajuste el pH a 7.4 si es necesario y aumente el volumen a 483.4 ml con agua ultrapura.
  4. Agregue 16.6 ml de solución de HSA al 30% a los 483.4 ml de HBS, pH 7.4.
  5. Para 500 ml de HBS/BSA, disolver 5 g de BSA en HBS e incubar a 37 °C durante 30 min. Luego, mezcle suavemente en RT invirtiendo la botella periódicamente hasta que no haya cristales o grupos de proteínas visibles.
  6. Filtre la solución resultante del paso 4.5 utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm (consulte la Tabla de materiales) y guárdela a 4 °C.

5. Calibraciones de densidad de proteínas en BSLB

  1. Antes de tomar las perlas de sílice no funcionalizadas de 5,00 ±0,05 μm de diámetro, mezcle bien la solución madre y resuspenda cualquier grupo grande de cuentas sedimentadas en el fondo de los matraces.
    NOTA: Las cuentas de sílice tienden a sedimentarse rápidamente, lo que podría conducir a errores de conteo. Mezclar vigorosamente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen máximo de una micropipeta P1000.
  2. Diluya 1 μL de solución de perlas en 1.000 μL de PBS, cuente las perlas utilizando una cámara hemocitómetro y calcule su concentración por ml.
    NOTA: La tinción azul tripano no es necesaria para visualizar cuentas de sílice.
  3. Calcule el volumen de perlas de sílice necesarias para 5 × 105 BSLB finales por punto de la titulación.
  4. Transfiera el volumen requerido de perlas de sílice a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
  5. Lave las perlas de sílice tres veces con 1 ml de PBS estéril, centrifugue las perlas durante 15 s en una microcentrífuga de sobremesa a RT (a rpm fijas).
    NOTA: Al quitar la solución de lavado, evite molestar el pellet de perlas. Una pequeña columna tampón no afectará la propagación de los liposomas que componen la mezcla maestra de liposomas, ya que estos también están en PBS.
  6. Prepare tres volúmenes de la mezcla maestra de liposomas para ensamblar el BSLB en las perlas de sílice lavadas (por ejemplo, si el volumen total inicial de las perlas de sílice es de 20 μL, prepare un mínimo de 60 μL de la mezcla maestra de liposomas).
  7. Para valoraciones de Mol% de Biotinyl Cap PE
    1. Prepare las mezclas maestras de lípidos que contienen diluciones de 5 veces de Biotinyl Cap PE.
      1. Diluir el 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% en una matriz 100% DOPC.
      2. Mezcle cada punto de valoración de Biotinyl Cap PE mol% en una proporción de 1:1 (vol:vol) con una solución de 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) de tal manera que un 12,5 mol% final de lípidos que contienen Ni esté presente en todas las valoraciones.
        NOTA: El 12,5 mol% (vol:vol%) de lípidos que contienen Ni representa la composición lipídica mixta de BSLB en la que las proteínas marcadas con His también se pueden probar en calibraciones paralelas. Por ejemplo, dado que todas las existencias de liposomas se preparan a la misma concentración molar, para alcanzar la mezcla de mol% objetivo en 200 μL de mezcla final de liposomas, simplemente mezcle 100 μL de 25 mol% de DGS-NTA que contiene Ni con 100 μL de 100 mol% DOPC.
    2. Transfiera 5 × 105 perlas de sílice lavadas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, de modo que se ensamble un punto de valoración de mol% de Biotinyl Cap PE por tubo.
    3. Agregue las mezclas maestras de valoración de mol% biotinyl Cap PE a las perlas de sílice lavadas y mezcle suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Evite la formación de burbujas, que en exceso destruyen la bicapa lipídica.
    4. Agregue gas argón (o nitrógeno) en el tubo que contiene los BSLB ahora en formación para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.
    5. Añadir argón a las reservas de lípidos de 0,4 mM antes del almacenamiento y manipular mediante una técnica estéril.
      NOTA: Conecte un tubo pequeño al cilindro de gas Argón/Nitrógeno. Antes de agregar gas a los tubos, ajuste el regulador del cilindro de gas para que la presión no sea superior a 2 psi. Conecte una punta de pipeta estéril al tubo de salida para dirigir la corriente de gas dentro de la culata de liposomas durante 5 s y cierre rápidamente la tapa. En el caso de las existencias de lípidos, selle la tapa del tubo con una película de parafina antes de almacenarla a 4 °C.
    6. Mueva los BSLB a un mezclador de laboratorio vertical de ángulo variable (consulte la Tabla de materiales) y mezcle durante 30 minutos en RT utilizando una mezcla orbital de 10 rpm.
      NOTA: Este paso evitará la sedimentación de las perlas durante la formación de la bicapa lipídica soportada.
    7. Gire las perlas centrifugando durante 15 s en RT en una minicentrífuga de sobremesa, y luego lave tres veces con 1 ml de HBS / HSA (BSA) para eliminar el exceso de liposomas.
    8. Bloquee los BSLB formados agregando 1 ml de caseína al 5% o BSA al 5% que contenga 100 μM de NiSO4 para saturar los sitios de NTA y 200 nM de estreptavidina para recubrir todos los sitios de anclaje de biotina en los BSLB de manera uniforme. Mezclar suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total e incubar en el mezclador vertical durante no más de 20 min a RT y 10 rpm.
    9. Gire hacia abajo los BSLB centrifugando durante 15 s en RT en una minicentrífuga de sobremesa, y luego lave tres veces con 1 ml de tampón HBS / HSA (BSA).
      NOTA: Mantenga las perlas lavadas verticalmente con un pequeño volumen de tampón de lavado que cubra los BSLB. Evite la deshidratación de los BSLB, ya que el aire destruirá la bicapa lipídica.
  8. Para la titulación de proteínas marcadas con His en 12.5 mol% de BSLB que contienen DGS-(Ni) NTA
    1. Prepare tres volúmenes de mezcla maestra de liposomas que contengan un 12,5 mol% final de DGS-NTA(Ni).
    2. Use la mezcla maestra de liposomas para resuspendir las cuentas de sílice lavadas y mezcle suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Evite la formación de burbujas, que en exceso dañan la bicapa lipídica.
    3. Agregue gas argón (o nitrógeno) en el tubo que contiene los BSLB ahora en formación para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.
    4. Añadir argón a las reservas de lípidos de 0,4 mM antes del almacenamiento y manipular mediante una técnica estéril.
    5. Mueva los BSLB al mezclador vertical y mezcle durante 30 minutos en RT utilizando la mezcla orbital a 10 rpm.
    6. Gire las perlas centrifugando durante 15 s en RT en una minicentrífuga de sobremesa, y luego lave tres veces con 1 ml de HBS / HSA (BSA) para eliminar el exceso de liposomas.
    7. Bloquee los BSLB formados agregando 1 ml de caseína al 5% (o BSA al 5%) que contenga 100 μM de NiSO4 para saturar los sitios de NTA en los BSLB. Mezcle suavemente e incube en el mezclador vertical durante no más de 20 minutos a RT y 10 rpm.
    8. Lave tres veces con HBS/HSA (BSA) para eliminar el exceso de solución de bloqueo.
    9. En una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U, prepare diluciones en serie de 2 veces de las proteínas.
      1. Preparar una concentración inicial de 100 nM para la proteína de interés en un volumen total de 200 μL de tampón HBS/HSA (BSA), distribuir 100 μL de esta solución en la primera columna, y los 100 μL restantes en la parte superior de la columna #2 que contiene 100 μL de tampón HBS/HSA (BSA).
      2. Continúe transfiriendo en serie 100 μL de la columna #2 a la columna #3 y repita según sea necesario para cubrir todos los puntos de valoración. Deje la última columna de la serie sin proteína, ya que esta se utilizará como referencia en blanco para la cuantificación.
    10. Resuspender los BSLB preparados en un volumen tal que 5 × 105 BSLB estén contenidos en 100 μL de tampón HBS/HSA (BSA).
    11. Transfiera 100 μL de la suspensión BSLB a los pozos de una segunda placa de 96 pocillos con fondo en U, de modo que cada pozo reciba 5 × 105 BSLB.
    12. Gire hacia abajo la segunda placa que contiene BSLB durante 2 minutos a 300 × g y RT y deseche el sobrenadante.
    13. Transfiera los volúmenes de 100 μL de la placa de titulación de proteínas a la placa que contiene los BSLB sedimentados. Mezcle suavemente, evite el exceso de generación de burbujas durante el pipeteo e incube durante 30 min a RT y 1.000 rpm utilizando un agitador de placas. Proteger de la luz con papel de aluminio.
    14. Lave la placa tres veces con tampón HBS/HSA (BSA) utilizando pasos de sedimentación de 300 × g durante 2 min a RT.
    15. Si la proteína recombinante utilizada en la calibración está directamente conjugada con fluorocromos y tiene valores conocidos de F/P, continúe con el paso 5.8.20.
    16. Si la proteína recombinante utilizada en la calibración no está etiquetada o conjugada con fluorocromos o no hay disponible un estándar de perla MESF, use anticuerpos conjugados Alexa Fluor 488 o 647 con valores conocidos de F / P para teñir el BSLB recubierto de proteína.
    17. Tinción con concentraciones saturantes de anticuerpos de cuantificación.
      NOTA: Dependiendo del nivel de expresión objetivo, estos oscilan entre 5 y 10 μg/mL.
    18. Mancha durante 30 min a RT y 1.000 rpm usando un agitador de placas. Proteger de la luz con papel de aluminio.
    19. Lavar dos veces con tampón HBS/HSA (BSA) y una vez con PBS utilizando pasos de sedimentación de 300 × g durante 2 min a RT.
      NOTA: Use PBS, pH 7.4 para resuspendir los BSLB lavados antes de la adquisición. No utilice tampones que contengan proteínas, ya que esto conduce a la formación de burbujas durante la mezcla automática de muestras con muestreadores de alto rendimiento.
    20. Adquirir los estándares MESF, asegurándose de que los picos más brillantes permanezcan en el rango de detección lineal para el detector de cuantificación (canal), como se muestra en la Figura 1B (vii).
    21. Adquiera las muestras manualmente o utilizando HTS. Si se utiliza este último, resuspenda BSLB en 100 μL de PBS y adquiere 80 μL utilizando un caudal entre 2,5 y 3,0 μL/s, un volumen de mezcla de 100 μL (o el 50% del volumen total si el volumen de resuspensión es menor), una velocidad de mezcla de 150 μL/s y cinco mezclas para garantizar que los BSLB sean monodispersados.
    22. Exporte los archivos FCS.
    23. Concéntrese en eventos individuales para los análisis (Figura 2A), ya que los dobletes o trillizos introducirán errores en la determinación. Utilice la identificación anidada de eventos individuales como se indica en el paso 1.2.3 del protocolo.
    24. Mida la IMF de cada fracción MESF (1-4) y reste la IMF de cuentas en blanco para extraer las IMF corregidas (cMFI).
    25. Realizar un análisis de regresión lineal para extraer la pendiente (b) de MESF sobre el cMFI calculado para los estándares MESF, que se utilizará en el paso 5.33.
    26. Extrae la IMF de cada punto de titulación y resta la IMF de perlas sin proteína para obtener cMFIs.
    27. Divida los cMFIs con la pendiente calculada en el paso 5.31 para extraer el MESF unido a BSLBs para cada punto de titulación.
    28. Divida mesF unido a BSLBs por el valor F/P del anticuerpo de cuantificación para extraer el número promedio de moléculas unidas por BSLB.
    29. Utilizando el diámetro de los BSLB (5,00 ± 0,05 μm), extraiga el área de superficie de la perla (SA = 4pr2) para calcular las densidades finales de proteína (molc./μm2) por punto de titulación (concentración de proteína).
    30. Realizar un nuevo análisis de regresión de la concentración de proteínas sobre la densidad de proteínas para calcular la pendiente (b) de la línea de mejor ajuste.
      NOTA: La concentración de 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni) confiere una capacidad máxima de anclaje de aproximadamente 10.000 molc./μm210 sin inducir la activación inespecífica de las células T ni afectar a la movilidad lateral de los SLB.

6. Realización de experimentos de transferencia sináptica entre células T y BSLB

  1. Antes de ejecutar el experimento de transferencia sináptica
    1. Adquirir BSLB no fluorescentes, BSLB con lípidos fluorescentes, células no teñidas (o perlas de compensación; consulte la Tabla de materiales) y células teñidas de un solo color (o perlas de compensación) para identificar las interacciones del espectro de fluorescencia del instrumento. Concéntrese en aquellos detectores con alta propagación de derrame para rediseñar el panel policromático, aumentar la sensibilidad y reducir el error de medición en detectores críticos (ver 14).
    2. Valore los anticuerpos de detección para encontrar la concentración óptima, lo que permite la detección de eventos positivos sin comprometer la detección de negativos.
      NOTA: Repita este paso cada vez que haya un cambio de lote de anticuerpos, ya que los valores de F / P y el brillo varían de un lote a otro.
    3. Opcional: Optimice los voltajes PMT adquiriendo la muestra en diferentes rangos de voltaje (es decir, un paseo de voltaje) para encontrar los PMT que conducen a una señal óptima sobre el ruido (es decir, la separación de negativos y positivos mientras se garantiza que la señal de la población más brillante permanezca en el rango lineal).
  2. Medición de la transferencia de salida de células T a BSLB
    1. Preparar RPMI 1640 suplementado (en adelante medio R10) que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Utilice el medio R10 para cultivar y expandir las células T.
    2. El día 1, aísle las células T de las cámaras de sangre periférica o del sistema de leucorreducción (LRS). Utilice kits de aislamiento y separación de células de inmunodensidad (consulte la Tabla de materiales) para el enriquecimiento de células T humanas CD4+ y CD8+ .
    3. Sembrar las células a una concentración final que oscile entre 1.5 y 2.0 × 106 células/ml, utilizando placas de 6 pocillos con no más de 5 ml de total por pozo.
    4. Activar las células T utilizando una proporción de 1:1 de perlas magnéticas de activación de células T humanas (anti-CD3/anti-CD28) (ver la Tabla de Materiales) y agregar 100 UI de IL-2 humana recombinante para apoyar la proliferación y supervivencia celular.
    5. El día 3, retire las perlas magnéticas activadoras utilizando columnas magnéticas (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que las perlas magnéticas permanezcan unidas a los lados del tubo antes de recuperar las células para pasos de lavado adicionales.
    6. Lave las perlas magnéticas una vez más con 5 ml de medio R10 fresco, mezcle bien y vuelva a colocarlas en el imán. Recupere este volumen y mezcle con las celdas recuperadas en el paso 6.2.5.
    7. Resuspend las células a 1.5-2 × 106 células/ml en R10 fresco que contiene 100 U/mL de IL-2. Reponer el medio después de 48 h, asegurándose de que la última adición de IL-2 sea 48 h antes del día de experimentación (días 7 a 14 de cultivo).
    8. El día del experimento de transferencia sináptica, prepare el medio de ensayo de transferencia sináptica (ver Tabla 1) complementando el medio RPMI 1640 libre de fenol rojo con 10% de FBS, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. No incluya IL-2 humana recombinante.
    9. Cuente las células utilizando la tinción azul tripano o la exclusión de corriente eléctrica y resuspóndalas a una concentración final de 2,5 × 106 células / ml en medio. Si se observa una muerte celular excesiva (>10%), elimine las células muertas / moribundas utilizando una mezcla de polisacárido y diatrizoato de sodio (consulte la Tabla de materiales) de la siguiente manera:
      1. Capa 15 mL de cultivo celular sobre 13 mL de la solución de diatrizoato de polisacárido-sodio.
      2. Centrífuga de 1.250 × g durante 20 min a RT con mínima aceleración y desaceleración. Recoger la capa celular (nube) en la interfaz entre el medio y la solución de diatrizoato de polisacárido-sodio.
      3. Lave las células al menos dos veces con un medio de ensayo de transferencia sináptica precalentado (preparado en el paso 6.2.7).
      4. Contar y resuspendir las células a una concentración final de 2,5 × 106/ml utilizando el medio de ensayo de transferencia sináptica. Cocultivo 100 μL de esta suspensión celular con BSLB (ver paso 6.2.15).
    10. Calcular el número de BSLB necesarios para el experimento; considere todas las diferentes mezclas maestras de proteínas y valoraciones de antígenos que se probarán (ya sea monómeros biotinilados HLA / MHC-péptidos o monobiotinilados anti-CD3ε Fab).
    11. Ensamble los BSLB siguiendo los mismos pasos de la sección 5 del protocolo, pero esta vez, combine todas las valoraciones de proteínas y lípidos necesarios para reconstituir una membrana APC compleja (Figura 3A). Mantenga las mismas relaciones vol:vol entre el volumen inicial de perlas de sílice y el volumen de mezcla de proteínas utilizada durante las calibraciones, así como los tiempos y temperaturas utilizados en la carga de BSLB. Por ejemplo, si se utilizaron 0,5 μL de perlas de sílice/pozo y 100 μL/pocillo de mezcla de proteínas para la calibración inicial, mantener relaciones de 5:1.000 vol:vol para preparar los BSLB para ser cocultivados con células T.
    12. Una vez que los BSLB se hayan cargado con la mezcla de proteínas de interés, lave los BSLB dos veces con HBS / HSA (BSA) para eliminar el exceso de proteínas no unidas. Use velocidades de sedimentación de 300 × g durante 2 min en RT en cada paso de lavado y deseche los sobrenadantes.
    13. Resuspend los 5 × 105 BSLB por pozo en 200 μL.
    14. Transfiera 100 μL por pozo a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U para hacer un duplicado, de modo que la cantidad final de BSLB por pozo sea de 2.5 × 105.
    15. Gire hacia abajo los BSLB a 300 × g durante 2 min y RT y deseche el sobrenadante.
    16. Resuspendir los BSLB utilizando 100 μL de suspensión de células T; mezclar suavemente para evitar la formación de burbujas.
    17. Incubar los cocultivos durante 90 min a 37 °C.
      NOTA: Alternativamente, las células y las perlas se pueden resuspendir en tampón HBS / HSA (BSA) en lugar de RPMI libre de fenol-rojo para el cocultivo. En este caso, la incubación debe realizarse en una incubadora sin CO2 , ya que este gas acidificará rápidamente el tampón en ausencia de bicarbonato.
    18. Enfríe los cocultivos de células BSLB-T incubando primero las células en RT durante un mínimo de 15 minutos. Protégelos de la luz.
    19. Centrifugar las células durante 5 min a 500 × g y RT; deseche el sobrenadante.
    20. Resuspend las células en RT 2% BSA-PBS (Libre de Ca2+ y Mg2+) para el bloqueo. Coloque las celdas en hielo durante 45 min. Proteger de la luz.
    21. Mientras incuba las células, prepare la mezcla maestra de anticuerpos utilizando BSA al 2% filtrado por 0,22 μm en PBS como un tampón de tinción, lo que proporcionará un bloqueo adicional.
      NOTA: Algunos lotes de anticuerpos conjugados con colorantes Violeta Brillante tienden a unirse a BSLB de forma no específica. El bloqueo con 5% BSA-PBS ayuda a reducir este ruido. A partir de ahora, asegúrese de mantener la cadena de frío intacta.
    22. Girar hacia abajo los cocultivos a 500 × g durante 5 min y 4 °C. Antes de desechar los sobrenadantes, asegúrese brevemente de que el pellet esté presente inspeccionando el fondo de la placa de 96 pocillos con una luz de fondo.
    23. Usando una pipeta multicanal, resuspenda las células en la mezcla maestra de tinción que contiene concentraciones optimizadas de anticuerpos.
      NOTA: Utilice puntas de pipeta sin filtro para evitar la generación de burbujas y errores en la distribución de los volúmenes de tinción.
    24. Incluye células marcadas con isotipo y BSLB, BSLB fluorescentes y no fluorescentes, y células y BSLB teñidas solas. Respetar el número total de eventos por pozo para todos los controles (es decir, solo BSLB que contengan 5 × 105 BSLB/pozo, y solo controles celulares que contengan 5 × 105 células/pozo para evitar un aumento relativo de anticuerpos por evento teñido).
    25. Mezclar suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen e incubar durante 30 minutos en hielo. Proteger de la luz.
    26. Lave las células y los BSLB dos veces con BSA-PBS al 2% en frío, pH 7.4 y pasos de sedimentación de 500 × g durante 5 min a 4 °C. Resuspendir los cocultivos lavados en 100 μL de PBS y adquirirlos inmediatamente.
    27. Si se necesita fijación, arregle usando 0.5% p/v de PFA en PBS durante 10 min, lave una vez y manténgalo en PBS hasta la adquisición. Proteger de la luz.
    28. Antes de la compensación, adquiera los estándares MESF, asegurando que tanto las poblaciones más tenues como las más brillantes caigan en el rango lineal de medición.
    29. Adquiera muestras de compensación, calcule la compensación y aplique la matriz de compensación (enlace) al experimento.
    30. Adquirir y guardar un mínimo de 2 × 104 estándares MESF totales para cada uno de los canales de cuantificación.
    31. Para la adquisición utilizando muestreadores de alto rendimiento, establezca la adquisición de instrumentos en el estándar, establezca la adquisición de muestras en 80 μL (o el 80% del volumen total), la tasa de flujo de muestreo entre 2.0 y 3.0 μL / s, el volumen de mezcla de muestras de 50 μL (o el 50% del volumen total para evitar la formación de burbujas durante la mezcla), la mezcla de muestras de 150 μL / s y la mezcla por pozo entre 3 y 5.
    32. Adquirir un mínimo de 1 × 104 BSLB individuales por muestra (consulte los paneles de la Figura 3B (i) a (vi) para la estrategia de cierre de referencia).
    33. Lave el citómetro durante 5 minutos con una solución de limpieza seguida de 5 minutos de agua ultrapura antes de apagar el instrumento. Si utiliza el HTS, siga las opciones de la pestaña HTS y la opción Limpiar .
    34. Exportar archivos FCS.

7. Medición de la transferencia sináptica de partículas a BSLB

  1. Abra los archivos FCS del experimento. Seleccione la población de células y BSLB en función de sus áreas de dispersión de luz lateral y delantera (SSC-A versus FSC-A), como se muestra en la Figura 3B (i).
  2. Seleccione los eventos dentro de la ventana de adquisición continua (Figura 3B (ii)).
  3. Centrarse en los eventos individuales de ambas células y BSLB; identificar células individuales primero basadas en W bajo en las compuertas secuenciales FSC-W/FSC-H (singletes-1, Figura 3B panel (iii)) y SSC-W/SSC-H (singletes-2; Figura 3B panel (iv)). Defina una puerta singlets-3 adicional seleccionando eventos con FSC-A y FSC-H proporcionales (Figura 3B, panel (v)).
  4. Extraiga la IMF de fracciones mesf en blanco y 1 a 4 y de células individuales y MESF para cada muestra de experimento.
  5. Genere valores corregidos de IMF (cMFI) para las fracciones MESF 1 a 4 restando la IMF de la población de cuentas en blanco de cada fracción.
  6. Generar cMFIs para BSLB y celdas individuales (consulte el panel (i ) de la Figura 3C ).
  7. Utilice la señal de BSLB teñida con anticuerpos de control de isotipo para corregir la IMF de BSLB teñida con anticuerpos contra los marcadores de células T relevantes. Utilice cMFI para calcular el porcentaje de transferencia sináptica normalizada (NST%) utilizando la ecuación que se muestra en el panel (ii) de la Figura 3C .
  8. Si está interesado, en cambio, en las partículas transferidas específicamente en respuesta a la activación de TCR, reste la señal de los BSLB nulos de la IMF de los BSLB agonísticos. Utilice este cMFI para calcular el NST% impulsado por TCR utilizando la ecuación que se muestra en el panel (ii) de la Figura 3C .
  9. Si está interesado en determinar el número total de moléculas transferidas como carga de partículas a través de la interfaz T cell-BSLB, adquiera cuentas de referencia MESF utilizando la misma configuración del instrumento y la misma sesión de adquisición para cocultivos T cell-BSLB.
  10. Analice las poblaciones de perlas MESF y extraiga sus cMFIs como se indica en los pasos del protocolo 5.8.15 a 5.8.17. Calcular la pendiente de la línea de mejor ajuste para el análisis de regresión de MESF sobre cMFI.
  11. Utilice la pendiente calculada para extraer el número de MESF depositados en los BSLB. Utilice los cMFI calculados utilizando controles de isotipo o BSLB nulos como espacios en blanco para extraer el número de MESF transferidos específicamente a los BSLB estimulantes.
  12. Calcule el número de moléculas de marcadores transferidos a BSLB dividiendo los MESF calculados (promedio) por BSLB por el valor F/P del anticuerpo de cuantificación.

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Resultados

FCM para la cuantificación absoluta de proteínas en la superficie celular
La reconstitución de BSLB que presentan densidades fisiológicas de ligandos requiere la estimación de densidades totales de proteínas en el subconjunto celular modelado. Para reconstituir los BSLB, incluya cualquier ligando relevante que se espera que desempeñe un papel en el eje de señalización de interés junto con las proteínas que apoyan la adhesión y la interacción funcional entre BSLB y las células, como ICAM-1 y moléculas ...

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Discusión

Los BSLB son herramientas versátiles para estudiar la producción de partículas de células T estimuladas con membranas modelo APC. La flexibilidad del método permite la reconstitución de composiciones de membrana complejas y reduccionistas para estudiar los efectos de los ligandos y sus señales sobre la secreción de tSVs y partículas de ataque supramolecular y sus componentes. Hemos probado esta tecnología en varias células T, incluyendo TH, CTL, Tregs y CART15 preactivadas. Este protocolo también ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Agradecimientos

Estamos agradecidos con los miembros de nuestro laboratorio y la comunidad del Instituto Kennedy de Reumatología por las discusiones científicas constructivas, especialmente con nuestro gerente de instalaciones de citometría de flujo Jonathan Webber. Este trabajo fue financiado por Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, la ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) y el Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (los tres a MLD). PFCD fue apoyado por EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, en conjunto con la Comisión Europea (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) y Marie Sklodowska-Curie Actions) y una beca Oxford-Bristol Myers Squibb.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinil] (sal de níquel)Avanti Lípidos Polares790404C-25mg18:1 DGS-NTA(Ni) en cloroformo

PIPETMAN L Multicanal P8x200L, 20-200 y micro; L		GilsonFA10011
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolinaAvanti Lípidos polares850375C-25mg  18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) en cloroformo
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 565ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(tapa biotinil) (sal sódica)Avanti Polar Lipids870273C-25mg18:1 Biotinyl Cap PE en cloroformo
200 y micro; L puntas amarillas 10 x 96 puntas, pilaStarlabS1111-0206
5 mL tubos de poliestireno de fondo redondoFalcon®
5,00 ± 0,05 µ m perlas de sílice no funcionalizadasBangs Laboratories Inc.
Placa de culto celular de 96 pocillos con fondo en U con tapa, tratamiento con cultivo de tejidos, no pirogénico.Costar®3799Para tinción de FCM y cocultivo de BSLB y células.
Placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo en V con tapa, cultivo de tejidos tratado, no pirogénico.Costar®3894Para la tinción con FCM de células o perlas en suspensión.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (éster de succinimidilo)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster de succinimidilo)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A37573 y A20006
Allegra X-12R CentrífugaBeckman CoulterPara la tinción normal en el tubo de muestras biológicas para papel de aluminio FCM
CualquiermarcaPara proteger las células y los BSLB de la luz
antihumana CD154 (CD40L), clon 24-31BioLegend310815 y 310818conjugados Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, respectivamente.
antihumano CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clon J252D4BioLegend356934Para el análisis cuantitativo de FCM de células amigdalinas como se muestra en la Fig. 1E
anti-humano CD19 Brilliant Violet 421, clon HIB19BioLegend302234Para el análisis cuantitativo de FCM de células amigdalinas como se muestra en la Fig. 1E
anti-humano CD2, clon RPA-2.10BioLegend300202Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD2, clon TS1/8BioLegend309218Brilliant Violet 421 conjugado.
anti-humano CD252 (OX40L), clon 11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD28, clon CD28.2eBioscience16-0289-85Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD317 (BST2, PDCA-1), clon 26F8ThermoFisher Scientific, invitrogen53-3179-42Alexa Fluor 488 conjugado, encontramos que este clon es más limpio que el clon RS38E.
anti-humano CD38, clon HB-7 BioLegend356624Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano CD38, clon HIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD39, clon A1BioLegendEtiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD4 Brilliant Violet 650, clon OKT4BioLegend317436Para el análisis cuantitativo de FCM de células amigdalaras como se muestra en la Fig. 1E
anti-CD4 humano, clon A161A1BioLegend357414 y 357421conjugados PerCP/Cyanine5.5 y Alexa Fluor 647,
respectivamente anti-CD4 humano, clon OKT4 BioLegend317414 y 317422conjugados PE/Cy7 y Alexa Fluor 647,
respectivamente anti-humano CD40, clon 5C3BioLegend334304Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD40, clon G28.5BioLegendEtiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD45, clon HI30BioLegend304056 y 368516conjugados Alexa Fluor 647 y APC/Cy7
anti-humano CD47, clon CC2C6BioLegend323118Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD54 (ICAM-1), clon HCD54BioLegend322702Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD63 (LAMP-3), clon H5C6BioLegend353020 y 353015PerCP/Cyanine5.5 y Alexa Fluor 647 conjugados, respectivamente
anti-humano CD73, clon AD2BioLegend344002Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD80, clon 2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD81, clon 5A6BioLegend349512 y 349502conjugado PE/Cy7 y marcados internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectivamente.
anti-humano CD82, clon ASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD86, clon IT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD8a, clon HIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano CD8a, clon SK1BioLegend344724Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano HLA-A/ B/C/E, clon w6/32BioLegend311414 y 311402Alexa Fluor 647 conjugados y marcados internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano HLA-DR, clon L243BioLegend307656 y 307622conjugados Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, respectivamente.
anti-humano ICAM-1, clon HCD54BioLegend322702Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano ICOS, clon C398.4ABioLegend313516Hámster Armenio IgG
anti-humano ICOSL, clon MIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647
conjugado anti-humano ICOSL, clon MIH12eBioscience16-5889-82Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano LFA-1, clon TS1/22BioLegendProducido internamenteEtiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano OX40, clon Ber-ACT35 (ACT35)BioLegend350018Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano PD-1 , clon EH12.2H7BioLegend135230 y 329902Alexa Fluor 647 conjugado y marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano PD-L1, clon 29E.2A3BioLegend329702Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano PD-L2, clon 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano PD-L2, clon MIH18BioLegend345502Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano TCRab, clon IP26BioLegend306712 y 306714conjugados Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, respectivamente.
antti-humano CD156c (ADAM10), clon SHM14BioLegend352702
antti-humano CD317 (BST2, Tetherin), clon RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 conjugado
Hámster Armenio IgG Alexa Fluor 647 Control de isotipo, clon HTK888BioLegend400902Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Citómetro de configuración y seguimiento de perlasBecton Dickinson & Compañía (BD)641319Seguimiento del rendimiento de los instrumentos antes de los FCM cuantitativos
BD FACSDivaBecton Dickinson & Empresa (BD)23-14523-00 Software deadquisición
Albúmina de suero bovinoMerck, Sigma-AldrichA3294
CaCl2, Cloruro de calcioMerck, Sigma-AldrichC5670anhidro, Bioreactivo, adecuado para el cultivo de células de insectos, adecuado para el cultivo de células de plantas, ≥ 96,0%
Caseína de leche bovina, adecuada como sustrato para la proteína quinasa (después de la desfosforilación), polvo purificadoMerck, Sigma-AldrichC5890
Dynabeads Activador T humano CD3/CD28ThermoFisher Scientific, Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12321DPara la extracción de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 en volúmenes inferiores a 2 mL
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12301DPara la eliminación de Dynabeads™ Activador T humano CD3/CD28 en volúmenes inferiores a 15 mL
Suero fetal bovino calificado, un disparoThermoFisher Scientific, GibcoA3160801Necesita inactivación por calor durante 30 minutos a 56 oC
Ficoll-Paque PLUSCytiva, GE HealthcareGE17-1440-02Solución estéril de polisacárido y diatrizato de sodio para el aislamiento de linfocitos
Colorante de viabilidad fijable eFluor 780eBiosciences65-0865-14Para la exclusión de células muertas durante los análisis
FlowJoBecton Dickinson & Empresa (BD)Versión 10.7.1Software de análisis
Grant Bio MPS-1 Multi Plate ShakerKeison ProductsMPS-1Para la mezcla de células durante las tinciones o BSLB durante la staning o la carga de proteínas (como alternativa a la agitación orbital)
Solución tampón HEPES (1 m)ThermoFisher Scientific, Gibco15630-056
HEPES, N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanosulfónico), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico.Merck, Sigma-AldrichH4034Para la preparación de tampón HBS/HAS o HBS/BSA. Certificado BioPerformance, ≥ 99,5% (valoración), apto para cultivo celular
Incubadora HERACell 150i CO2, 150 L, acero inoxidable electropulidoThermoFisher Scientific51026282Para el cultivo y la expansión de células T CD4+ y CD8+ purificadas.
Mezclador de Hula ® Mezclador de muestrasThermoFisher Scientific, Life Technologies15920DMezclador de laboratorio vertical de ángulo variable que se utiliza para la mezcla de BSLB y mezclas maestras de lípidos, soluciones de bloqueo, mezcla maestra de proteínas y tinciones de anticuerpos a pequeña escala.
Albúmina sérica humana, solución acuosa al 30%Merck, Sigma-Aldrich12667-M
Solución bloqueadora de receptores TruStain FcX FcBioLegend422302Fc Solución bloqueadora para el bloqueo de receptores Fc de muestras biológicamente relevantes
Contador y analizador celular Innovatis CASY TTBiovendis Products GmbHPara el recuento de células y la determinación del tamaño y el volumen de las células en función de la exclusión de la corriente eléctrica.
KCl, Cloruro de potasioMerck, Sigma-AldrichP5405Polvo, Biorreactivo, apto para cultivo celular
L-Glutamina 200 mM (100x)ThermoFisher Scientific, Gibco25030-024
MgCl2, Cloruro de magesioMerck, Sigma-AldrichM2393BioReactivo, apto para cultivo celular, apto para cultivo celular de insectos
Inserto de microtubo para 24 x 1,5/2,0 mL tubosKeison ProductsP-2-24Inserto de microtubo para Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini IncubatorLabnet International I5110A-230VPara la incubación (cocultivo) de BSLB y células en ausencia de CO2
Mínimo Medio esencial Aminoácidos no esencialesThermoFisher Scientific, Gibco11140-035
Control de anticuerpos policlonales IgG de ratónMerck, Sigma-AldrichPP54Se utiliza como control positivo para la medición de anticuerpos unidos a los estándares
de perlas de captura de IgG de ratónRatón IgG1, Isotipo k, clon MOPC-21BioLegend400129, 400112, 400130, 400144, 400128 y 400170conjugados Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 y Brilliant Violet 785 , respectivamente.
Ratón IgG1, Isotipo k, clon X40Becton Dickinson & Compañía (BD), Horizon562438Violeta Brillante 421 conjugado.
Ratón IgG1, κ Control de isotipo, clon P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Ratón IgG2a, k Isotipo, clon MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 conjugado
Ratón IgG2b, k Isotipo, clon MPC-11BioLegend400330 y 400355Alexa Fluor 647 y Brilliant Violet 785 conjugados, respectivamente
Multipocillo 6 pocillos Cultivo de tejidos tratados con plasma de gasal vacío Falcon353046Para el cultivo y la expansión de células T CD4+ y CD8+ purificadas.
Na2HPO4, fosfato disódicoMerck, Sigma-AldrichS7907
NaCl, cloruro de sodioMerck, Sigma-AldrichS5886Bioreactivo, adecuado para cultivo celular, adecuado para cultivo de células de insectos, adecuado para cultivo de células vegetales, ≥ 99%
NiSO4, sulfato de níquel (II)Merck, Sigma-Aldrich656895Para saturar sitios NTA; añadido durante el proceso de bloqueo
Penicilina Estreptomicina [+]10.000 unidades Penicilina; [+] 10.000 y micro; g/mL de estreptomicinaThermoFisher Scientific, Gibco15140-122
solución salina tamponada con fosfato pH 7,4, estérilThermoFisher Scientific, Gibco10010No Ca2+ o Mg2+ añadido
Polietersulfona (PES) Unidad de filtroThermo Scientific Nalgene  UY-06730-43La membrana hidrofílica de PES con baja unión a proteínas facilita el filtrado de soluciones con alto contenido de proteínas
PURESHIELD argón ISO 14175-I1-ArBOC Ltd.11-YPara la protección de las reservas de lípidos almacenadas a +4 ºC.
Estreptavidina purificadaBioLegend280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF perlasBangs Laboratories Inc.488Perlas de referencia para la interpolación de moléculas de Alexa Fluor 488 unidas a células y/o perlas BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESFBangs Laboratories Inc.647Perlas de referencia para la interpolación de moléculas de Alexa Fluor 647 unidas a células y/o BSLB
Cadena ligera IgG Kappa anti-ratón para ratas, clon OX-20ThermoFisher Scientific, invitrogenSA1-25258Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
IL-2 humano recombinantePeprotech200-02-1MG
RMPI Medio 1640 (1x); [-] L-glutaminaThermoFisher Scientific, Gibco31870-025
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células B humanasSTEMCELL Technologies15064Aislamiento de células B para medir densidades de proteínas en poblaciones celulares purificadas
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células T humanas CD4+STEMCELL Technologies15022C.1
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células T humanas CD4 + CD127bajas STEMCELL Tecnologías15361Preenriquecimiento de células T CD4+ CD127Low para el aislamiento posterior de Tregs por FACS.
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células T CD8+STEMCELL Technologies15063
RPMI Medio 1640 (1x); [-] Rojo de fenolThermoFisher Scientific, Gibco11835-063Para la incubación (cocultivo) de BSLB y células en ausencia de CO2. Los medios sin rojo de fenol reducen la autofluorescencia de las células en mediciones basadas en citometría de flujo y microscopía.
Piruvato de sodio (100 mM)ThermoFisher Scientific, Gibco11360-070
Mini centrífuga SproutFisherScientific, Heathrow Scientific LLC120301Microcentrífuga de sobremesa utilizada para lavar perlas de sílice y BSLB en tubos Eppendorf de 1,5 mL.
Tubos estériles de poliestireno de 5 ml con tapa redondaFalcon352058
UltraComp eBeads Compensation BeadsThermoFisher Scientific, invitrogen01-2222-42
Zeba Spin Columnas de desalinización 7K MWCOThermo Fisher Scientific, Invitrogen™89882
352052SS05003 humano humanas

Referencias

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