Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

Resumen

Aquí presentamos el protocolo para la reconstitución escalonada de células presentadoras de antígenos sintéticos utilizando bicapas lipídicas soportadas por perlas y su uso para interrogar la salida sináptica de las células T activadas.

Resumen

Las células presentadoras de antígenos (APC) presentan tres señales activadoras a las células T que participan en contacto físico: 1) antígeno, 2) coestimulación/corepresión y 3) citoquinas solubles. Las células T liberan dos tipos de partículas efectoras en respuesta a la activación: vesículas transsinápticas (tSV) y partículas de ataque supramolecular, que transfieren mensajeros intercelulares y median la citotoxicidad, respectivamente. Estas entidades son rápidamente internalizadas por apces que participan en contacto físico con células T, lo que hace que su caracterización sea desalentadora. Este artículo presenta el protocolo para fabricar y utilizar bicapas lipídicas soportadas por perlas (BSLB) como miméticas de células presentadoras de antígenos (APC) para capturar y analizar estas partículas transsinápticas. También se describen los protocolos para las mediciones absolutas de densidades de proteínas en las superficies celulares, la reconstitución de BSLB con tales niveles fisiológicos y el procedimiento de citometría de flujo para rastrear la liberación de partículas sinápticas por las células T. Este protocolo se puede adaptar para estudiar los efectos de proteínas individuales, mezclas de ligandos complejos, determinantes de virulencia de patógenos y fármacos en la producción efectora de las células T, incluidas las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, las células T reguladoras y las células T que expresan el receptor de antígenos quiméricos (CART).

Introducción

La sinapsis inmunológica (IS) es una estructura molecular fundamental formada en la interfaz de las células que participan en contacto físico que facilita el intercambio regulado de información de yuxtracrina. Se han descrito diferentes IS en la literatura, y un creciente cuerpo de evidencia sugiere que estos centros moleculares son una característica conservada de las redes celulares. Varias células inmunes, incluidas las células B, las células asesinas naturales, las células dendríticas, los macrófagos y las células T, intercambian información a través del ensamblaje de contactos de corta ^duración1. Los estudios multiómicos están avanzando en....

Protocolo

1. Medición de densidades de proteínas de la superficie celular con citometría de flujo cuantitativa

1. Preparar un tampón de citometría de flujo humano (hFCB) filtrado con 0,22 μm añadiendo EDTA (a una concentración final de 2 mM) y suero AB humano (hasta un 10% final) a solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 (ver Tabla 1). Filtre la solución con una unidad de filtro de poros de 0,22 μm para eliminar las impurezas séricas y almacenarla a 4 °C.
2. Recuperar las células y sedimentarlas por centrifugación a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
3. Lave las células dos veces....

Resultados

FCM para la cuantificación absoluta de proteínas en la superficie celular
La reconstitución de BSLB que presentan densidades fisiológicas de ligandos requiere la estimación de densidades totales de proteínas en el subconjunto celular modelado. Para reconstituir los BSLB, incluya cualquier ligando relevante que se espera que desempeñe un papel en el eje de señalización de interés junto con las proteínas que apoyan la adhesión y la interacción funcional entre BSLB y las células, como ICAM-1 y moléculas .......

Discusión

Los BSLB son herramientas versátiles para estudiar la producción de partículas de células T estimuladas con membranas modelo APC. La flexibilidad del método permite la reconstitución de composiciones de membrana complejas y reduccionistas para estudiar los efectos de los ligandos y sus señales sobre la secreción de tSVs y partículas de ataque supramolecular y sus componentes. Hemos probado esta tecnología en varias células T, incluyendo TH, CTL, Tregs y ^CART15 preactivadas. Este protocolo también .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinil] (sal de níquel)	Avanti Lípidos Polares	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) en cloroformo
PIPETMAN L Multicanal P8x200L, 20-200 y micro; L	Gilson	FA10011
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Lípidos polares	850375C-25mg	18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) en cloroformo
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(tapa biotinil) (sal sódica)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE en cloroformo
200 y micro; L puntas amarillas 10 x 96 puntas, pila	Starlab	S1111-0206
5 mL tubos de poliestireno de fondo redondo	Falcon®
5,00 ± 0,05 µ m perlas de sílice no funcionalizadas	Bangs Laboratories Inc.
Placa de culto celular de 96 pocillos con fondo en U con tapa, tratamiento con cultivo de tejidos, no pirogénico.	Costar®	3799	Para tinción de FCM y cocultivo de BSLB y células.
Placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo en V con tapa, cultivo de tejidos tratado, no pirogénico.	Costar®	3894	Para la tinción con FCM de células o perlas en suspensión.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (éster de succinimidilo)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster de succinimidilo)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 y A20006
Allegra X-12R Centrífuga	Beckman Coulter		Para la tinción normal en el tubo de muestras biológicas para papel de aluminio FCM
Cualquier	marca		Para proteger las células y los BSLB de la luz
antihumana CD154 (CD40L), clon 24-31	BioLegend	310815 y 310818	conjugados Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, respectivamente.
antihumano CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clon J252D4	BioLegend	356934	Para el análisis cuantitativo de FCM de células amigdalinas como se muestra en la Fig. 1E
anti-humano CD19 Brilliant Violet 421, clon HIB19	BioLegend	302234	Para el análisis cuantitativo de FCM de células amigdalinas como se muestra en la Fig. 1E
anti-humano CD2, clon RPA-2.10	BioLegend	300202	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD2, clon TS1/8	BioLegend	309218	Brilliant Violet 421 conjugado.
anti-humano CD252 (OX40L), clon 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD28, clon CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD317 (BST2, PDCA-1), clon 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 conjugado, encontramos que este clon es más limpio que el clon RS38E.
anti-humano CD38, clon HB-7 BioLegend		356624	Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano CD38, clon HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD39, clon A1	BioLegend		Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD4 Brilliant Violet 650, clon OKT4	BioLegend	317436	Para el análisis cuantitativo de FCM de células amigdalaras como se muestra en la Fig. 1E
anti-CD4 humano, clon A161A1	BioLegend	357414 y 357421	conjugados PerCP/Cyanine5.5 y Alexa Fluor 647,
respectivamente anti-CD4 humano, clon OKT4 BioLegend		317414 y 317422	conjugados PE/Cy7 y Alexa Fluor 647,
respectivamente anti-humano CD40, clon 5C3	BioLegend	334304	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD40, clon G28.5	BioLegend		Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD45, clon HI30	BioLegend	304056 y 368516	conjugados Alexa Fluor 647 y APC/Cy7
anti-humano CD47, clon CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD54 (ICAM-1), clon HCD54	BioLegend	322702	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD63 (LAMP-3), clon H5C6	BioLegend	353020 y 353015	PerCP/Cyanine5.5 y Alexa Fluor 647 conjugados, respectivamente
anti-humano CD73, clon AD2	BioLegend	344002	Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD80, clon 2D10	BioLegend	305216	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD81, clon 5A6	BioLegend	349512 y 349502	conjugado PE/Cy7 y marcados internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectivamente.
anti-humano CD82, clon ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD86, clon IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano CD8a, clon HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano CD8a, clon SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano HLA-A/ B/C/E, clon w6/32	BioLegend	311414 y 311402	Alexa Fluor 647 conjugados y marcados internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano HLA-DR, clon L243	BioLegend	307656 y 307622	conjugados Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, respectivamente.
anti-humano ICAM-1, clon HCD54	BioLegend	322702	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano ICOS, clon C398.4A	BioLegend	313516	Hámster Armenio IgG
anti-humano ICOSL, clon MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647
conjugado anti-humano ICOSL, clon MIH12	eBioscience	16-5889-82	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano LFA-1, clon TS1/22	BioLegend	Producido internamente	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano OX40, clon Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano PD-1 , clon EH12.2H7	BioLegend	135230 y 329902	Alexa Fluor 647 conjugado y marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano PD-L1, clon 29E.2A3	BioLegend	329702	Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano PD-L2, clon 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano PD-L2, clon MIH18	BioLegend	345502	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano TCRab, clon IP26	BioLegend	306712 y 306714	conjugados Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, respectivamente.
antti-humano CD156c (ADAM10), clon SHM14	BioLegend	352702
antti-humano CD317 (BST2, Tetherin), clon RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 conjugado
Hámster Armenio IgG Alexa Fluor 647 Control de isotipo, clon HTK888	BioLegend	400902	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Citómetro de configuración y seguimiento de perlas	Becton Dickinson & Compañía (BD)	641319	Seguimiento del rendimiento de los instrumentos antes de los FCM cuantitativos
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Empresa (BD)	23-14523-00 Software de	adquisición
Albúmina de suero bovino	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Cloruro de calcio	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	anhidro, Bioreactivo, adecuado para el cultivo de células de insectos, adecuado para el cultivo de células de plantas, ≥ 96,0%
Caseína de leche bovina, adecuada como sustrato para la proteína quinasa (después de la desfosforilación), polvo purificado	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Activador T humano CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	Para la extracción de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 en volúmenes inferiores a 2 mL
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Para la eliminación de Dynabeads™ Activador T humano CD3/CD28 en volúmenes inferiores a 15 mL
Suero fetal bovino calificado, un disparo	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Necesita inactivación por calor durante 30 minutos a 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Solución estéril de polisacárido y diatrizato de sodio para el aislamiento de linfocitos
Colorante de viabilidad fijable eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	Para la exclusión de células muertas durante los análisis
FlowJo	Becton Dickinson & Empresa (BD)	Versión 10.7.1	Software de análisis
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker	Keison Products	MPS-1	Para la mezcla de células durante las tinciones o BSLB durante la staning o la carga de proteínas (como alternativa a la agitación orbital)
Solución tampón HEPES (1 m)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanosulfónico), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	Para la preparación de tampón HBS/HAS o HBS/BSA. Certificado BioPerformance, ≥ 99,5% (valoración), apto para cultivo celular
Incubadora HERACell 150i CO2, 150 L, acero inoxidable electropulido	ThermoFisher Scientific	51026282	Para el cultivo y la expansión de células T CD4+ y CD8+ purificadas.
Mezclador de Hula ® Mezclador de muestras	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Mezclador de laboratorio vertical de ángulo variable que se utiliza para la mezcla de BSLB y mezclas maestras de lípidos, soluciones de bloqueo, mezcla maestra de proteínas y tinciones de anticuerpos a pequeña escala.
Albúmina sérica humana, solución acuosa al 30%	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Solución bloqueadora de receptores TruStain FcX Fc	BioLegend	422302	Fc Solución bloqueadora para el bloqueo de receptores Fc de muestras biológicamente relevantes
Contador y analizador celular Innovatis CASY TT	Biovendis Products GmbH		Para el recuento de células y la determinación del tamaño y el volumen de las células en función de la exclusión de la corriente eléctrica.
KCl, Cloruro de potasio	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Polvo, Biorreactivo, apto para cultivo celular
L-Glutamina 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, Cloruro de magesio	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReactivo, apto para cultivo celular, apto para cultivo celular de insectos
Inserto de microtubo para 24 x 1,5/2,0 mL tubos	Keison Products	P-2-24	Inserto de microtubo para Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator	Labnet International	I5110A-230V	Para la incubación (cocultivo) de BSLB y células en ausencia de CO2
Mínimo Medio esencial Aminoácidos no esenciales	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Control de anticuerpos policlonales IgG de ratón	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Se utiliza como control positivo para la medición de anticuerpos unidos a los estándares
de perlas de captura de IgG de ratónRatón IgG1, Isotipo k, clon MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 y 400170	conjugados Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 y Brilliant Violet 785 , respectivamente.
Ratón IgG1, Isotipo k, clon X40	Becton Dickinson & Compañía (BD), Horizon	562438	Violeta Brillante 421 conjugado.
Ratón IgG1, κ Control de isotipo, clon P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Ratón IgG2a, k Isotipo, clon MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 conjugado
Ratón IgG2b, k Isotipo, clon MPC-11	BioLegend	400330 y 400355	Alexa Fluor 647 y Brilliant Violet 785 conjugados, respectivamente
Multipocillo 6 pocillos Cultivo de tejidos tratados con plasma de gas	al vacío Falcon	353046	Para el cultivo y la expansión de células T CD4+ y CD8+ purificadas.
Na2HPO4, fosfato disódico	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, cloruro de sodio	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	Bioreactivo, adecuado para cultivo celular, adecuado para cultivo de células de insectos, adecuado para cultivo de células vegetales, ≥ 99%
NiSO4, sulfato de níquel (II)	Merck, Sigma-Aldrich	656895	Para saturar sitios NTA; añadido durante el proceso de bloqueo
Penicilina Estreptomicina [+]10.000 unidades Penicilina; [+] 10.000 y micro; g/mL de estreptomicina	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
solución salina tamponada con fosfato pH 7,4, estéril	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca2+ o Mg2+ añadido
Polietersulfona (PES) Unidad de filtro	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	La membrana hidrofílica de PES con baja unión a proteínas facilita el filtrado de soluciones con alto contenido de proteínas
PURESHIELD argón ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	Para la protección de las reservas de lípidos almacenadas a +4 ºC.
Estreptavidina purificada	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF perlas	Bangs Laboratories Inc.	488	Perlas de referencia para la interpolación de moléculas de Alexa Fluor 488 unidas a células y/o perlas BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF	Bangs Laboratories Inc.	647	Perlas de referencia para la interpolación de moléculas de Alexa Fluor 647 unidas a células y/o BSLB
Cadena ligera IgG Kappa anti-ratón para ratas, clon OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Marcado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
IL-2 humano recombinante	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medio 1640 (1x); [-] L-glutamina	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células B humanas	STEMCELL Technologies	15064	Aislamiento de células B para medir densidades de proteínas en poblaciones celulares purificadas
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células T humanas CD4+	STEMCELL Technologies	15022C.1
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células T humanas CD4 + CD127	bajas STEMCELL Tecnologías	15361	Preenriquecimiento de células T CD4+ CD127Low para el aislamiento posterior de Tregs por FACS.
Roseta Cóctel de enriquecimiento de células T CD8+	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medio 1640 (1x); [-] Rojo de fenol	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	Para la incubación (cocultivo) de BSLB y células en ausencia de CO2. Los medios sin rojo de fenol reducen la autofluorescencia de las células en mediciones basadas en citometría de flujo y microscopía.
Piruvato de sodio (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Mini centrífuga Sprout	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Microcentrífuga de sobremesa utilizada para lavar perlas de sílice y BSLB en tubos Eppendorf de 1,5 mL.
Tubos estériles de poliestireno de 5 ml con tapa redonda	Falcon	352058
UltraComp eBeads Compensation Beads	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Zeba Spin Columnas de desalinización 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	89882