DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.
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Artículo de método
DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis
En este artículo
Resumen
Resumen
Las sinapsis son el sitio de comunicación entre las neuronas. La fuerza del circuito neuronal está relacionada con la densidad sináptica, y la descomposición de las sinapsis es característica de estados de enfermedad como el trastorno depresivo mayor (TDM) y la enfermedad de Alzheimer. Las técnicas tradicionales para investigar los números de sinapsis incluyen la expresión genética de marcadores fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP)), colorantes que llenan una neurona (por ejemplo, colorante de carbocianina, DiI) y detección inmunofluorescente de marcadores de columna vertebral (por ejemplo, densidad postsináptica 95 (PSD95)). Una advertencia importante a estas técnicas de proxy es que solo identifican cambios postsinápticos. Sin embargo, una sinapsis es una conexión entre un terminal presináptico y una columna vertebral postsináptica. El estándar de oro para medir la formación / eliminación de sinapsis requiere técnicas de microscopía electrónica o tomografía de matriz que consumen mucho tiempo. Estas técnicas requieren capacitación especializada y equipo costoso. Además, solo se puede evaluar un número limitado de neuronas y se utilizan para representar cambios en toda una región del cerebro. DetectSyn es una técnica fluorescente rápida que identifica cambios en la formación o eliminación de sinapsis debido a un estado de enfermedad o actividad farmacológica. DetectSyn utiliza un ensayo de ligadura de proximidad rápida para detectar proteínas pre y postsinápticas yuxtapuestas y microscopía fluorescente estándar, una técnica fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios. La detección fluorescente de la puntería resultante permite un análisis rápido e imparcial de los experimentos. DetectSyn proporciona resultados más representativos que la microscopía electrónica porque se pueden analizar áreas más grandes que un número limitado de neuronas fluorescentes. Además, DetectSyn funciona para neuronas cultivadas in vitro y cortes de tejido fijo. Finalmente, se proporciona un método para analizar los datos recopilados de esta técnica. En general, DetectSyn ofrece un procedimiento para detectar cambios relativos en la densidad de sinapsis a través de tratamientos o estados de enfermedad y es más accesible que las técnicas tradicionales.
Introducción
Las sinapsis son la unidad fundamental de comunicación entre neuronas1. Muchas sinapsis entre neuronas dentro de las mismas regiones dan lugar a circuitos que median el comportamiento2. Las sinapsis consisten en un terminal presináptico de una neurona que libera neurotransmisores o neuropéptidos que transmiten información a los receptores postsinápticos de otra neurona. La suma de señales presinápticas determina si la neurona postsináptica disparará un potencial de acción y propagará el mensaje a otras neuronas.
La sinaptopatología, la descomposición de las sinapsis, surge en enfermedades y tr....
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Protocolo
El aislamiento de células y tejidos de animales se realizó de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Wake Forest
NOTA: Este protocolo se utiliza en muestras ya tratadas y fijadas según paradigmas y requisitos experimentales específicos. Para fines de demostración, la formación de sinapsis debido al tratamiento antidepresivo rápido se utiliza para resaltar esta técnica de detección de sinapsis6. Las neuronas previamente cultivadas en cápsulas, tratadas, fijadas en paraformaldeh....
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Resultados
Los datos modificados de Heaney et al.6 se presentan para demostrar un experimento en el que se espera una mayor formación de sinapsis (consulte6 para obtener más información y una discusión más profunda del mecanismo). Anteriormente, se demostró que los antidepresivos rápidos requieren la activación del receptor metabotrópico inhibidor, GABAB (gamma-aminobutyric acid subtype B), para serefectivos 13. Además, los datos anteriores indicaron que los an.......
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Discusión
DetectSyn es un ensayo rápido que utiliza un ensayo de ligadura de proximidad para detectar proteínas dentro de los 40 nm entre sí, lo que permite la detección de la formación de sinapsis. Esta técnica mejora los ensayos fluorescentes actuales, que sirven solo como mediciones proxy para la formación de sinapsis. DetectSyn detecta cambios cuantificables en las proteínas sinápticas localizadas dentro de los 40 nm, es decir, dentro de la hendidura sináptica, entre sí. Además, DetectSyn es más rentable y lleva menos tiempo q.......
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Divulgaciones
Los autores no reportan ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud NINDS R01 NS105005 (KRG) y NS105005-03S1 (KRG), el Departamento de Defensa USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), y una subvención de FRAXA Research (CFH) y la Asociación de Alzheimer, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Fisher Scientific BP39920 | PBS también hicieron obras internas. | |
| Placas de 24 pocillos | Fisher Scientific | FB012929 | En el caso de las rebanadas de tejido, es posible que no sean necesarias placas preesterilizadas. |
| Tubos cónicos de 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Papel de aluminio | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Pollo anticuerpo anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Esmalte de uñas transparente | Fisher Scientific | NC1849418 | Otros esmaltes de uñas transparentes también funcionan. |
| Bloque frío | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Estación de trabajo informática | HP | ||
| Microscopio confocal o fluorescente | Nikon | A1R HD25 | |
| Burro anti-pollo FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink burro anti-Ratón PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink burro anti-Conejo MENOS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Reactivos de detección in situ Far Red | Sigma | DUO92013 | Contiene material de ligadura, material de amplificación, ligasa y polimerasa. |
| Medio de montaje in situ Duolink con DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| tampones de lavado in situ Duolink, fluorescencia | Sigma | DUO82049 | contiene tampón de lavado A y tampón de lavado B; diluya el tampón de lavado B al 1% en diH20 para un tampón de lavado B al 1%. |
| El pincel de punta fina | Fisher Scientific | NC9691026 | pelo de marta, tamaño 00 o 000, también se puede encontrar en las tiendas de manualidades |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectángulos | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass es innecesario para las neuronas cultivadas que ya están en cubreobjetos de vidrio. |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus | de Fisherbrand Fisher Scientific | 1255015 | Para las neuronas cultivadas que ya están en cubreobjetos de vidrio, los portaobjetos Superfrost pueden ser innecesarios. |
| Congelador, -20 grados; C | VWR | 76449-108 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Software de procesamiento de imágenes | , p. ej. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Placa de Petri grande, 100 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Agua de grado molecular | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Anticuerpo anti-Synapsin1 para ratones | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Suero de burro normal | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Agitador orbital | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Puntas de pipeta | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipetas | Fisher Scientific | 14-388-100 | Los volúmenes de trabajo oscilan entre 3 y micro; L a 500 y micro; L |
| Pipeta pasteur de plástico | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Pinzas de precisión/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Anticuerpo anti-PSD95 de conejo | Abcam | ab18258 | Otros pares de anticuerpos también pueden funcionar con optimización. |
| Frigorífico | VWR | 76470-402 | |
| Placa de Petri pequeña, 60 mm | Fisher | ||
| Temporizador | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Referencias
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregu....
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Reimpresiones y permisos
