Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.
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Artículo de método
Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular
En este artículo
Resumen
Resumen
La heterogeneidad celular plantea desafíos para comprender la función de los tejidos complejos a nivel del transcriptoma. El uso de ARN específicos del tipo de célula evita posibles dificultades causadas por la heterogeneidad de los tejidos y desencadena el poderoso análisis del transcriptoma. El protocolo descrito aquí demuestra cómo utilizar el método de purificación de afinidad ribosómica (TRAP) para aislar ARN unidos a ribosomas de una pequeña cantidad de células que expresan EGFP en un tejido complejo sin clasificación celular. Este protocolo es adecuado para aislar ARN específicos de tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP recientemente disponible y también podría usarse para aislar ARN de cualquier célula que exprese EGFP.
Introducción
Los enfoques de alto rendimiento, incluida la secuenciación de ARN (RNA-seq) y el microarray, han permitido interrogar los perfiles de expresión génica a nivel de todo el genoma. Para tejidos complejos como el corazón, el cerebro y los testículos, los datos específicos del tipo de célula proporcionarán más detalles comparando el uso de ARN de todo el tejido 1,2,3. Para superar el impacto de la heterogeneidad celular, el método de purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) se ha desarrollado desde principios de la década de 20104. TRAP es capa....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales realizados siguieron los protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Auburn.
NOTA: El siguiente protocolo utiliza un testículo (aproximadamente 100 mg) en P28 de Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP (Mus musculus). Es posible que sea necesario ajustar los volúmenes de reactivos en función de los tipos de muestras y el número de tejidos.
1. Recolección de tejidos
- Eutanasia a los ratones usando una cámara deCO2 , desinfecte la superficie del abdomen con et....
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Resultados
El ratón Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) se cruzó por primera vez con el ratón reportero NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para generar ratones de doble mutación. Los ratones portadores de ambos alelos genéticos genéticamente modificados (es decir, Gli1-CreERT2 y NuTRAP) fueron inyectados con tamoxifeno una vez al día, cada dos días, para tres inyecciones. Las muestras de tejido se recogieron el 7º día después del1º día de la inyección.
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Discusión
La utilidad del análisis del transcriptoma de tejido completo podría amortiguarse, especialmente cuando se estudian tejidos heterogéneos complejos. Cómo obtener ARN específicos de tipo celular se convierte en una necesidad urgente para desatar la poderosa técnica RNA-seq. El aislamiento de ARN específicos del tipo celular generalmente se basa en la recolección de un tipo específico de células mediante micromanipulación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o microdisección por captura láser (LCM)
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente apoyado por NIH R00HD082686. Agradecemos la beca de investigación de verano de la Endocrine Society a H.S.Z. También agradecemos al Dr. Yuan Kang por criar y mantener la colonia de ratones.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Actb | eurofins | cebadores qPCR | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (cebador directo/cebador inverso) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA | Millipore | 11836170001 | |
| cicloheximida | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | cebadores qPCR | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (cebador directo/cebador inverso) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Ditiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| Imán DynaMag-2 | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Tubos Falcon 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Anticuerpo GFP | Abcam | ab290 | |
| Juego de molinos de vidrio | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparina | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| em>Hsd3b | eurofins | cebadores qPCR | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (cebador directo/cebador inverso) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Tubos de microcentrífuga 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Ratón Clariom S Microarrays de ensayo | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| Kit de aislamiento de ARN PicoPure | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D Células | |
| de cultivo de agua sin ARNasa | NUPW-0500 | ||
| RNaseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasa | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | cebadores qPCR | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (cebador directo/cebador inverso |
| Superíndice IV transcriptasa inversa | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | cebadores | qPCRGAATGTGTTCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (cebador delantero/cebador inverso) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Referencias
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al.
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Reimpresiones y permisos
