La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.
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Artículo de método
Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína
En este artículo
Resumen
Resumen
La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) es un método simple y conveniente para investigar la estructura secundaria y las interacciones de las biomoléculas. Los avances recientes en espectroscopia de CD han permitido el estudio de las interacciones ADN-proteína y la dinámica conformacional del ADN en diferentes microambientes en detalle para una mejor comprensión de la regulación transcripcional in vivo. El área alrededor de una zona de transcripción potencial necesita ser desenrollada para que ocurra la transcripción. Este es un proceso complejo que requiere la coordinación de modificaciones de histonas, la unión del factor de transcripción al ADN y otras actividades de remodelación de la cromatina. Utilizando la espectroscopia de CD, es posible estudiar los cambios conformacionales en la región promotora causados por proteínas reguladoras, como los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, para promover la transcripción. Los cambios conformacionales que ocurren en la proteína también pueden ser monitoreados. Además, las consultas sobre la afinidad de la proteína hacia su ADN objetivo y la especificidad de la secuencia se pueden abordar mediante la incorporación de mutaciones en el ADN objetivo. En resumen, la comprensión única de este método sensible y económico puede predecir cambios en la dinámica de la cromatina, mejorando así la comprensión de la regulación transcripcional.
Introducción
El dicroísmo circular (CD) es una técnica espectroscópica que se basa en la quiralidad inherente de las macromoléculas biológicas que conduce a la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente diestra y zurda. Esta absorción diferencial se conoce como dicroísmo circular. La técnica, por lo tanto, se puede utilizar para delinear la conformación de macromoléculas biológicas, como proteínas y ADN, que contienen centros quirales1,2.
Las ondas electromagnéticas contienen componentes eléctricos y magnéticos. Tanto el campo eléctrico como el magnético oscilan perpendicularmente ....
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Protocolo
1. Concentración de trabajo de los componentes de reacción
- Preparar las concentraciones de trabajo de tampones para CD y otros componentes de reacción recientemente (ver Tabla 1) y mantenerlas a 4 °C antes de configurar las reacciones.
NOTA: Para las reacciones de CD descritas en este trabajo, las concentraciones de trabajo de los componentes son las siguientes: Tampón de fosfato de sodio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. Actividad atPasa
- Antes de la espectroscopia de CD, establezca la activi....
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Resultados
ADAAD estabiliza una estructura similar a un bucle de vástago en el promotor MYC
La evidencia experimental previa mostró que SMARCAL1 es un regulador negativo de MYC29. El análisis de la región promotora larga de 159 pb del gen MYC por el mapeador QGRS mostró que la hebra delantera tenía el potencial de formar un G-quadruplex (Tabla 2). Mfold mostró que ambas hebras del ADN MYC podrían forma.......
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Discusión
El propósito de este artículo es introducir la técnica de espectroscopia de CD como un enfoque para estudiar los cambios conformacionales que ocurren en el ADN en presencia de proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP y vincular estos cambios conformacionales a la expresión génica. La espectroscopia de CD proporciona un método rápido y de fácil acceso para estudiar los cambios conformacionales en el ADN.
Un punto crucial a considerar para esta técnica es la pureza del AD.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, por el espectrofotómetro CD. V.J. y A.D. fueron apoyados por una beca de CSIR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosina 5′-trifosfato hidrato de sal disódica | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Cubeta de cuarzo | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD Espectrómetro | Fotofísica Aplicada | No disponible | |
| EDTA Sal Disódica Dihidratada | SRL | 43272 | |
| Glutatión Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Cromatografía de afinidad con glutatión |
| Hellmanex III solución de limpieza | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Deshidrogenasa | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Acetato de magnesio tetrahidratado | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Fisher scientific | M33-500 | |
| Sal disódica de NADH | Sigmaaldrich 10107735001 | ||
| Fosfoenolpiruvato Sal monociclohexilamonio | SRL | 40083 | |
| Acetato de potasio | Fisher scientific | P178-3 | |
| Piruvato quinasa | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Fosfato de sodio dibásico anhidro | Fisher scientific | S374-500 | |
| Fosfato de sodio monobásico monohidrato | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT lector de microplacas | BioTek | No disponible | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
Referencias
- Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodg....
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Reimpresiones y permisos
