Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos derivados de monocitos (MDM) a partir de muestras de sangre humana, un método simple para introducir eficientemente reporteros de complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa inflamatoria (BiFC) en MDM humanos sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular, y un enfoque basado en imágenes para medir la activación de la caspasa inflamatoria en células vivas.
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Artículo de método
Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las caspasas inflamatorias incluyen caspasa-1, -4, -5, -11 y -12 y pertenecen al subgrupo de caspasas iniciadoras. La caspasa-1 es necesaria para garantizar la correcta regulación de la señalización inflamatoria y se activa por dimerización inducida por proximidad después del reclutamiento a inflamasomas. La caspasa-1 es abundante en el linaje celular monocítico e induce la maduración de las citoquinas proinflamatorias interleucina (IL)-1β e IL-18 a moléculas secretadas activas. Las otras caspasas inflamatorias, caspasa-4 y -5 (y su homólogo murino caspasa-11) promueven la liberación de IL-1β al inducir piroptosis. La complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa (BiFC) es una herramienta utilizada para medir la proximidad inflamatoria inducida por caspasa como una lectura de la activación de la caspasa. El prodominio caspasa-1, -4 o -5, que contiene la región que se une al inflamasoma, se fusiona con fragmentos no fluorescentes de la proteína fluorescente amarilla Venus (Venus-N [VN] o Venus-C [VC]) que se asocian para reformar el complejo fluorescente de Venus cuando las caspasas experimentan proximidad inducida. Este protocolo describe cómo introducir a estos reporteros en macrófagos primarios derivados de monocitos humanos (MDM) utilizando nucleofection, tratar las células para inducir la activación de la caspasa inflamatoria y medir la activación de la caspasa mediante fluorescencia y microscopía confocal. La ventaja de este enfoque es que se puede utilizar para identificar los componentes, los requisitos y la localización del complejo de activación de la caspasa inflamatoria en las células vivas. Sin embargo, se deben considerar controles cuidadosos para evitar comprometer la viabilidad y el comportamiento de las células. Esta técnica es una herramienta poderosa para el análisis de interacciones dinámicas de caspasa a nivel de inflamasoma, así como para el interrogatorio de las cascadas de señalización inflamatoria en MDM vivos y monocitos derivados de muestras de sangre humana.
Introducción
Las caspasas son una familia de proteasas de cisteína aspartato que se pueden agrupar en caspasas iniciadoras y caspasas verdugo. Las caspasas verdugosas comprenden caspasa-3, -6 y -7. Se encuentran naturalmente en las células como dímeros y son escindidos por las caspasas iniciadoras para ejecutar la apoptosis1. Las caspasas iniciadoras incluyen caspasa humana-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 y -12. Se encuentran como zimógenos inactivos (pro-caspasas) que se activan por dimerización inducida por proximidad y se estabilizan mediante escisión autoprotolítica 2,3. Las caspasas inflamatorias so....
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Protocolo
Este protocolo sigue las directrices del comité de ética de investigación humana de Baylor College of Medicine para la manipulación de muestras humanas. Las muestras de sangre se manejan siguiendo las pautas de seguridad institucionales para muestras humanas. Las muestras de sangre se obtienen en un banco de sangre regional, donde se recogen con solución de citrato fosfato dextrosa (CPD). Sin embargo, la sangre recolectada con otros anticoagulantes como la heparina sódica, la heparina de litio o el EDTA también se puede utilizar para este protocolo28,29.
1. Aislamiento de mono....
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Resultados
El esquema que se muestra en la Figura 2 ofrece una visión general de cómo obtener, transfectar e imagenr la MDM humana. Después de la incubación de los monocitos CD14+ seleccionados con GM-CSF durante 7 días, la morfología celular cambia en el transcurso del período de diferenciación (Figura 3A), pasando de células de suspensión esférica a células de suspensión esférica a delgadas y completamente unidas (días 3 y 4), y, por último, a células más diseminadas cu.......
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Discusión
Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos a partir de monocitos aislados de muestras de sangre humana y un método para introducir eficientemente los reporteros biFC de caspasa inflamatoria en MDM humano sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular.
Este protocolo aprovecha la técnica BiFC35 para etiquetar las caspasas inflamatorias en el dominio de reclutamiento de caspasa (CARD) con fragmentos no fluorescentes de la proteína fluor.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio de LBH pasados y presentes que contribuyeron al desarrollo de esta técnica. Este laboratorio cuenta con el apoyo de NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). La figura 2 se dibujó utilizando el software Biorender.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 48 pocillos para cultivo de tejidos2:34 placas | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm placas para cultivo de tejidos | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific 21985023 | ||
| 8 cubreobjetos de cámara con cubreobjetos de 1,5 CV | Columnas Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | Para la separación automatizada utilizando solo el separador AutoMACS Pro |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | Para la separación automatizada utilizando solo el separador AutoMACS Pro |
| AutoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | Para la separación automatizada utilizando solo el separador AutoMACS Pro |
| Solución de enjuague AutoMACS | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | Para la separación automatizada utilizando solo el separador AutoMACS Pro |
| Búfer de ejecución AutoMacs | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | Para la separación manual o automatizada con el separador QuadroMACS o AutoMACS pro Microscopio |
| invertido motorizado Axio Observer Z1 equipado con una unidad de disco giratorio CSU-X1A 5000 | Zeiss | Se puede utilizar cualquier microscopio confocal equipado con un módulo láser equipado con líneas láser de 568 nm (RFP) y longitudes de onda de 488 o 512 nm (GFP o YFP) | |
| AxioObserver A1, Microscopio invertido de grado de investigación | Zeiss | Cualquier microscopio de epifluorescencia con filtros de fluorescencia capaz de excitar longitudes de onda de 568 nm (RFP) y 488 o 512 nm (GFP o YFP) se puede utilizar | |
| Para la separación manual o automatizada con QuadroMACS o AutoMACS pro Separador | |||
| DPBS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed plásmido mito | Clontech | 632421 | Los plásmidos similares que se pueden utilizar como reporteros fluorescentes se pueden encontrar en Addgene |
| Fetal Bovine | Serum Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| Suplemento GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, de Porcino, ≥ 96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Caspasa inflamatoria Plásmidos | Disponible a petición del laboratorio | ||
| LBH LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Columnas | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | Para la separación manual utilizando únicamente el separador QuadroMACS |
| Rack de tubos MACS 15 mL | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | Para la separación manual solo con el separador QuadroMACS |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | Para la separación manual solo con el separador QuadroMACS |
| plásmido mCherry | Yungpeng Wang Lab | Addgene se pueden encontrar plásmidos similares que se pueden utilizar como reporteros fluorescentes | |
| Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Incluye dispositivo de electroporación de neón, pipeta y estación de pipetas | |
| Sistema de transfección de neón 10 µ L Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Incluye tampón de resuspensión R, tampón de resuspensión T, tampón electrolítico E, 96 x 10 y micro; L Puntas de neón y tubos de electroporación de neón |
| Sal sódica de nigericina, solución preparada | Sigma | SML1779-1ML | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina | Sigma | P7280-5mg | |
| Separador QuadroMACS | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | Para la separación manual mediante Separador QuadroMACS solo |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Medio | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Software Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (edición azul) | Zeiss | Cualquier software utilizado para operar el microscopio confocal de su elección |
Referencias
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....
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Reimpresiones y permisos
