Modelo de lesión por puñalada del Tectum óptico adulto utilizando pez cebra y medaka para el análisis comparativo de la capacidad regenerativa

Resumen

Se describe un modelo mecánico de lesión cerebral en el pez cebra adulto para investigar los mecanismos moleculares que regulan su alta capacidad regenerativa. El método explica crear una lesión por arma blanca en el tectum óptico de múltiples especies de peces pequeños para evaluar las respuestas regenerativas utilizando inmunotinción fluorescente.

Resumen

Mientras que el pez cebra tiene una capacidad superior para regenerar su sistema nervioso central (SNC), la medaka tiene una menor capacidad regenerativa del SNC. Se desarrolló un modelo de lesión cerebral en el tectum óptico adulto de pez cebra y medaka y se realizaron análisis histológicos y moleculares comparativos para dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la alta capacidad regenerativa de este tejido en estas especies de peces. Aquí se presenta un modelo de lesión por arma blanca para el tectum óptico adulto utilizando una aguja y análisis histológicos para la proliferación y diferenciación de las células madre neurales (NSC). Se insertó manualmente una aguja en la región central del tectum óptico, y luego los peces fueron perfundidos intracárdicamente y sus cerebros fueron disecados. Estos tejidos se crioseccionaron y evaluaron mediante inmunotinción contra los marcadores apropiados de proliferación y diferenciación de NSC. Este modelo de lesión tectum proporciona resultados robustos y reproducibles tanto en pez cebra como en medaka, lo que permite comparar las respuestas NSC después de la lesión. Este método está disponible para teleósteos pequeños, incluidos el pez cebra, la medaka y el killi africano, y nos permite comparar su capacidad regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) tiene una mayor capacidad para regenerar su sistema nervioso central (SNC) en comparación con otros mamíferos ^1,2,3. Recientemente, para comprender mejor los mecanismos moleculares subyacentes a esta mayor capacidad regenerativa, se han realizado análisis comparativos de la regeneración tisular utilizando tecnología de secuenciación de próxima generación ^4,5,6. Las estructuras cerebrales en el pez cebra y tetrápodos son bastante diferentes

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada. El pez cebra y la medaka se mantuvieron de acuerdo con los procedimientos estándar²⁸.

1. Herida por arma blanca en el tectum óptico adulto

1. Prepare una solución madre de tricaína al 0,4% (p/v) para la anestesia. Para una solución madre de 100 ml, disuelva 400 mg de metanosulfonato de tricaína (ver Tabla de materiales) en 90 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.0 usando tampón Tris HCl 1 M (pH 9.0)....

Resultados

La lesión de la herida por arma blanca en el tectum óptico mediante la inserción de agujas en el hemisferio derecho (Figura 1, Figura 4A y Figura 5A) induce varias respuestas celulares, incluida la proliferación de células gliales radiales (CGR) y la generación de neuronas recién nacidas. Del mismo modo, las poblaciones envejecidas de pez cebra y medaka se utilizaron para contrarrestar cualquier efecto del envejecimiento en la respu.......

Discusión

Aquí se describe un conjunto de métodos que se pueden utilizar para inducir lesiones por heridas de arma blanca en el tectum óptico utilizando una aguja para facilitar la evaluación de la proliferación y diferenciación de RGC después de una lesión cerebral. Las heridas de arma blanca mediadas por agujas son un método simple y eficientemente implementado que se puede aplicar a muchas muestras experimentales utilizando un conjunto estándar de herramientas. Se han desarrollado modelos de lesiones por puñaladas para varias r.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 10 mL	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
Aguja de 30 G	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehído Fosfato Solución Tampón	Wako	163-20145
Bloque			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) es suficiente tamaño para congelar 6 criomoldes
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Microscopio confocal C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (ancho x profundo x alto)
Criostato	Leica	CM1960
Danio rerio WT cepas RW
Tubo de extensión	TERUMO	SF-ET3520
Medio de montaje acuoso Fluoromount (TM), para uso con tejidos teñidos con colorante fluorescente	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Pinzas	DUMONT	11252-20
Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra IgG (H+L) con alta adsorción cruzada, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
secundario anti-conejo de cabra IgG (H+L) con alta adsorción cruzada, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solución	Dojindo	23491-52-3
Ácido clorhídrico	Wako	080-01066
Cámara de incubación para 10 portaobjetos Naranja Oscuro	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS Abrigo de vidrio corredero	Matsunami vidrio	MAS-01
Micro cubreobjetos	Vidrio Matsunami	C024451
Microscopía	Nikon	SMZ745T
Solución bloqueadora de suero de caballo normal	LABRATORIES VECTORIALES	S-2000-20
O.C.T Compuesto	Sakura Finetek	Japón 83-1824
Oryzias latipes Cepas WT Cab
Pluma PAP Bloqueador de superlíquidos	DAIDO SANGYO	PAP-S Tabletas
solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4	TaKaRa	T9181
		espuma de poliestireno	100 x 100 x 10 mm (ancho x profundo x alto) está disponible como bandeja
Sacarosa	Wako	196-00015	30 % (p/v) de sacarosa en PBS
Tricaína (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Citrato Trisódico Dihidratado	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250

de aluminio Anticuerpo deBandeja de