Microdisección y disociación del oviducto murino: identificación de segmentos individuales y aislamiento unicelular

Resumen

Se presenta un método para la microdisección del oviducto de ratón que permite la recolección de los segmentos individuales mientras se mantiene la integridad del ARN. Además, se describe el procedimiento de disociación de células oviductales no enzimáticas. Los métodos son apropiados para el posterior análisis de genes y proteínas de los segmentos oviductales funcionalmente diferentes y las células oviductales disociadas.

Resumen

Los sistemas modelo de ratón son inigualables para el análisis de procesos de enfermedad debido a su manipulabilidad genética y al bajo costo de los tratamientos experimentales. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño corporal, algunas estructuras, como el oviducto con un diámetro de 200-400 μm, han demostrado ser relativamente difíciles de estudiar excepto por inmunohistoquímica. Recientemente, los estudios inmunohistoquímicos han descubierto diferencias más complejas en los segmentos del oviducto de lo que se reconocía anteriormente; por lo tanto, el oviducto se divide en cuatro segmentos funcionales con diferentes proporciones de siete tipos distintos de células epiteliales. Los diferentes orígenes embriológicos y las proporciones de los tipos de células epiteliales probablemente hacen que las cuatro regiones funcionales sean diferencialmente susceptibles a la enfermedad. Por ejemplo, las lesiones precursoras de los carcinomas intraepiteliales serosos surgen del infundíbulo en modelos de ratón y de la región fimbrial correspondiente en la trompa de Falopio humana. El protocolo descrito aquí detalla un método de microdisección para subdividir el oviducto de tal manera que produzca una cantidad y pureza suficientes de ARN necesarias para el análisis posterior, como la transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) y la secuenciación de ARN (RNAseq). También se describe un método de disociación tisular en su mayoría no enzimático apropiado para la citometría de flujo o el análisis RNAseq unicelular de células oviductales totalmente diferenciadas. Los métodos descritos facilitarán la investigación adicional utilizando el oviducto murino en el campo de la reproducción, la fertilidad, el cáncer y la inmunología.

Introducción

El oviducto murino es similar en función y morfología a la trompa de Falopio ^humana1. Ambos consisten en un epitelio ciliado pseudoestratificado, formado por dos células residentes epiteliales históricamente descritas: células ciliadas y células ^{secretoras1,2}. El oviducto tiene tres segmentos clásicamente reconocidos: el infundíbulo, la ampolla y el istmo. En un estudio reciente, Harwalkar et al. ³ investigó la morfología del oviducto y la expresión génica que condujo a la expansión de la categorización de las células epiteliales residentes a siete pobla....

Protocolo

Todos los manejos y procedimientos de animales fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de California, Riverside y estuvieron de acuerdo con las pautas de la Asociación Americana para el Cuidado de Animales de Laboratorio, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y los Institutos Nacionales de Salud. El método descrito utilizó C57BL / 6 ratones adultos, hembras. Todos los animales fueron sacrificados por decapitación antes de la recolección de tejidos.

NOTA: En la primera figura (Figura 1) se muestra una descripción general del protocolo, que utiliz....

Resultados

El protocolo de disociación descrito produce 100.000-120.000 células por ratón con agrupación de ambos oviductos. El método es lo suficientemente suave como para dejar intactos los bordes celulares multiciliados, lo que permite una distinción entre las células multiciliadas y las células secretoras, y verifica que el método de digestión sea lo suficientemente suave como para evitar la desdiferenciación. Las imágenes representativas de inmunofluorescencia en la Figura 5 muestran grupos de cél.......

Discusión

Los tres segmentos del oviducto son histológica, morfológica y funcionalmente distintos1,2,3. El epitelio varía mucho de un extremo del oviducto al otro. Las células ciliadas dominan en el extremo fimbrial/infundibular, mientras que las células secretoras dominan en la región ístmica1. Si bien este gradiente general ha sido reconocido durante algún tiempo, trabajos recientes han descubierto más distincion.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 mm Mezcla de perlas de acero inoxidable	Siguiente Advance	SSB05	Mix 1:1 con 1,4 mm SSB14B, esterilizado
1,4 mm Mezcla de perlas de acero inoxidable	Siguiente Advance	SSB14B	Mix 1:1 con 0,5 mm SSB05, esterilizado
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7,4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Aguja 25G fría y estéril
	BD	305122
placas de Petri estériles de 60 mm	Corning	430166
70 μ mallas celulares m	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eucariota ARN total 6000 Pico Kit de chip	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Homogeneizador de tejidos	Siguiente avance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A7906
Frío placa/paquete/superficie de elección	N/A	N/A	Mantenido en -20 ° C para disección
Cera dental	Polysciences Inc.	403
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)/ Jamón' s F12	Corning	10-090-CV	Preparar medio de disección: DMEM/ Jamón' s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Suero Fetal Bovino	Corning	35-015CV
Pinzas de punta fina de elección	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Imágenes de validación inmunocitoquímica
IgG antiratón de cabra Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Imágenes de validación inmunocitoquímica
IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Imágenes de validación inmunocitoquímica
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Imágenes de validación inmunocitoquímica
Microscopio compuesto invertido	Keyence BZ-X700
Ratón anti-ratón Occludin	Invitrogen	33-1500	Imágenes de validación inmunocitoquímica
Tampón de disociación no enzimática	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L de glucosa, 0,4% BSA, 1X DPBS
Macromalla de nailon 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehído	Sigma Aldrich	P-6148	Imágenes de validación inmunocitoquímica
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Reactivo antidecoloración Prolong	Gold Tecnologías de señalización celular	9071S	Imágenes de validación inmunocitoquímica: medio de montaje antidecoloración
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare el medio de digestión pronasa: 0,15% pronasa en DMEM/Ham's F12,
yoduro de propidio	Roche	11 348 639 001	Imágenes de validación de viabilidad
Anti-ratón de conejo Tubulina	acetiladaAbcam	ab179484	Imágenes de validación inmunocitoquímica
tampón de lisis RBC	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilizado para la purificación en columna en texto
tijeras de microdisección en forma de resorte	Roboz Surgical	RS-5610
Pipetas estériles de bulbo de 3 ml	Globe Scientific	137135
Azul de toluidina	Alfa Aesar	J66015	Prepare la solución de azul de toluidina: 1% en 1X DPBS, imágenes estériles
salina tamponada con Tris (TBST)	N/A	N/A N/A	NaCl 0,1 N, Tris-Cl 10 mM pH 7,5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Imágenes de validación inmunocitoquímica
Reactivo de extracción de ARN de Trizol	Invitrogen	15596026	Denominado reactivo de extracción de ARN. Se requiere agua libre de nucelasa, cloroformo e isoproponal como complemento de la extracción de Trizol según las pautas del fabricante

estéril de validación salina