Sistema de cultivo de órganos para la evaluación de la toxicidad de excipientes y productos farmacéuticos para tratamientos intraoculares

Resumen

El objetivo de este protocolo es evaluar los cambios en la actividad metabólica y la función refractiva del cristalino en respuesta a un tratamiento experimental.

Resumen

Como causa principal de ceguera, las cataratas son una carga significativa para las decenas de millones de personas afectadas en todo el mundo por esta afección. Las exposiciones químicas, entre otros factores ambientales, son una causa establecida de cataratas. Las pruebas de toxicidad ocular pueden evaluar si los productos farmacéuticos y sus componentes pueden contribuir al daño del cristalino que puede provocar cataratas o ayudar en el tratamiento de las cataratas.

Los estudios in vitro y las pruebas in vivo con animales pueden utilizarse para evaluar la seguridad de los productos químicos antes de los estudios clínicos. La prueba de Draize, el estándar in vivo actual para las pruebas de toxicidad e irritabilidad ocular, ha sido criticada por la falta de sensibilidad y mediciones objetivas para determinar la toxicidad ocular. Los ensayos in vitro basados en células son limitados, ya que los cultivos celulares no pueden modelar adecuadamente un cristalino funcional intacto.

El método descrito aquí es una alternativa in vitro sensible a la experimentación con animales, diseñada para evaluar la respuesta del cristalino bovino intacto al tratamiento tanto a nivel de actividad celular como para el rendimiento refractivo general. El reactivo no tóxico resazurina se metaboliza en proporción al nivel de actividad celular. El ensayo de escáner láser de lente mide la capacidad de la lente para refractar haces de luz incidentes en un solo punto con un error mínimo, directamente relevante para su función natural. El método se puede utilizar para determinar los cambios agudos y tardíos en el cristalino, así como la recuperación del cristalino de exposiciones químicas o ambientales.

Introducción

Las cataratas, que afectan a más de 20 millones de personas, son la causa más prevalente de ceguera en todo el mundo ^1,2. Las cataratas se deben con mayor frecuencia a cambios en el cristalino relacionados con la edad, pero también son inducidas por traumatismos, afecciones genéticas, enfermedades o exposiciones tóxicas². En la actualidad, el tratamiento consiste en una intervención quirúrgica para sustituir el cristalino, un procedimiento costoso e invasivo al que pueden acceder principalmente los países desarrollados. La gran carga de las cataratas ha....

Protocolo

Todos los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas éticas de la Universidad de Waterloo para la investigación con tejido animal. Los ojos bovinos para el presente estudio fueron suministrados por un matadero, obtenidos de vacas no lecheras a las pocas horas de la muerte, y fueron diseccionados inmediatamente, un proceso que toma hasta 8 h desde la obtención de los ojos. Los ojos deben ser diseccionados inmediatamente para preservar la esterilidad y la calidad de la disección. El medio de cultivo se prepara a un pH de 7,4 y se filtra estérilmente antes de la suplementación con FBS²¹

Resultados

La Figura 2 y la Figura 3 (n = 6) muestran los resultados de un estudio que probó el efecto del tratamiento químico (lanosterol) en el cristalino bovino. El lanosterol es un esterol natural en el cristalino que en su día mostró resultados prometedores como posible intervención farmacéutica para las cataratas²⁵, aunque esto aún no se ha demostrado²⁶. El diseño del estudio incluyó un medio y un vehículo de control pa.......

Discusión

El propósito de este protocolo es evaluar directamente los efectos de los productos químicos o las exposiciones ambientales en el cristalino en el cultivo primario de tejidos. En primer lugar, se diseccionan las lentes y se escanea para comprobar la calidad óptica. La prevención de la contaminación y la garantía de la calidad de la disección son fundamentales. Las lentes se escanean a intervalos periódicos para monitorear continuamente los cambios en la función refractiva con respecto al.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(2-hidroxipropil)-β-ciclodextrina	Sigma-Aldrich	H107	Polvo
1 L sistema de filtración con tapa de botella	VWR	97066-204	Montaje completo, tapa de botella, 0,2 μ m
100 mm Placa de Petri	VWR	89022-320	Deslizable, estilo ahorrador de medios, estéril
Placa de 12 pocillos	Corning	353043	Estéril, fondo transparente placa de
Petri de 35 mm	VWR	25373-041	Falcon placas de Petri desechables, estériles, Corning
96 placa de pocillos	VWR	29442-072	Estéril, fondo transparente
Alamar azul (resazurina)	Fischer Scientific	DAL1100	Sondas moleculares reactivo de viabilidad celular
solución de cloruro de benzalconio	Sigma-Aldrich	63249	50% en H20
Cabina
placas Cytation 5 BioTek		CYT5MPV	Cell Imaging Lector multimodo
Suero fetal bovino	ThermoFischer Scientific	12484028	Calificado, calor inactivado, Canadá
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Para cultivo celular,
polvo Incubadora
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥ 93%,
L-glutamina	en polvo Sigma-Aldrich		Para cultivo celular, medio
en polvo (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modificado, con Earle′ sales s, sin L-glutamina, bicarbonato de sodio y rojo de fenol, en polvo, aptas para el cultivo celular
Pipetas			5 3/4'', con y sin algodón
Penicilina-estreptomicina	ThermoFischer Scientific		15140122 Líquido (10.000 U/mL)
Tampón de fosfato solución salina (PBS)			líquido, estéril, apto para cultivo celular
Puntas de pipeta (100 y micro; L, 1.000 y micro; L, 5.000 y micro; L)	VWR
ScanTox estéril (escáner láser de lentes)	/A	especialmente desarrollado internamente	Escanea la lente con un láser para determinar la calidad óptica de la lente
Cámara de cultivo ScanTox	/A	especialmente desarrollada internamente	Mantiene la lente bovina en su lugar durante las pruebas y el cultivo
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761	Para cultivo celular, en polvo
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, Biorreactivo, apto para cultivo celular

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