Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Un conjunto de productos depositados por la madre (por ejemplo, ARN, proteínas y otras biomoléculas) es necesario para todos los procesos celulares tempranos hasta que se active el genoma cigótico del embrión¹. El agotamiento prematuro de estos productos del ovocito es típicamente letal embrionario. A pesar de la importancia de estos genes en el desarrollo, el papel de muchos genes expresados por la madre es actualmente desconocido. El avance en la tecnología de edición de genes en el pez cebra, como CRISPR-Cas9, permite la focalización de genes expresados maternamente ^2,3,4. Sin embargo, la identificación de un fenotipo de efecto materno requiere una generación adicional en comparación con un fenotipo cigótico, por lo que requiere más recursos. Recientemente, la capacidad de edición bialélica de CRISPR-Cas9 se ha utilizado para detectar fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados (F0), conocidos como "crispantes"5,6,7,8,9,10. La técnica crispant permite la detección eficiente de genes candidatos en células somáticas, facilitando la comprensión de aspectos específicos en el desarrollo. El protocolo descrito en este trabajo permite la identificación de fenotipos de efecto materno, o "crispantes maternos", en una sola generación¹¹. Este esquema se puede lograr mediante la multiplexación de ARN guía a un solo gen y la promoción de eventos de edición bialélica en la línea germinal. Estos embriones maternos crispantes pueden identificarse por fenotipos morfológicos macroscópicos y someterse a una caracterización primaria, como el etiquetado de los límites celulares y el patrón de ADN¹¹. El análisis combinado del fenotipo observable y la caracterización molecular básica de los INDEL inducidos permite predecir el papel del gen objetivo en el desarrollo temprano.

En el pez cebra, durante las primeras 24 h después de la fertilización (hpf), un pequeño grupo de células se convierte en las células germinales primordiales, un precursor de la línea germinal^12,13,14,15. En las garras colocadas por hembras F0, la proporción de embriones maternos crispantes recuperados depende de cuántas células germinales contienen un evento de edición bialélico en el gen objetivo. En general, cuanto antes ocurra el evento de edición en el embrión, mayor será la probabilidad de que se observen mutaciones CRISPR-Cas9 en la línea germinal. En la mayoría de los casos, los fenotipos de embriones crujientes maternos provienen de la pérdida de función en los dos alelos maternos presentes en el ovocito en desarrollo. A medida que el ovocito termina la meiosis, uno de los alelos maternos se extruye del embrión a través del cuerpo polar, mientras que el otro alelo se incorpora al pronúcleo materno. La secuenciación de múltiples haploides crujientes maternos representará una mezcla de las mutaciones (inserciones y/o deleciones (INDELs)) presentes en la línea germinal que contribuyen al fenotipo¹¹.

El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para crear mutaciones CRISPR-Cas9 en genes de efecto materno e identificar el fenotipo correspondiente utilizando un enfoque de crispante materno (Figura 1). La sección uno explicará cómo diseñar y crear ARN guía de manera efectiva, mientras que las secciones dos y tres contienen pasos críticos para crear crispantes maternos mediante microinyección. Después de inyectar la mezcla CRISPR-Cas9, los embriones inyectados se examinan para detectar ediciones somáticas mediante PCR (sección cuatro). Una vez que los embriones F0 inyectados se desarrollan y alcanzan la madurez sexual, las hembras F0 se cruzan con machos de tipo salvaje, y sus crías son examinadas para detectar fenotipos de efecto materno (sección cinco). La sección seis incluye instrucciones sobre cómo hacer haploides crujientes maternos que se pueden combinar con la secuenciación de Sanger para identificar los INDEL inducidos por CRISPR-Cas9. Además, la Discusión contiene modificaciones que se pueden hacer al protocolo para aumentar la sensibilidad y el poder de este método.

En los estudios que condujeron al desarrollo de este protocolo, todos los alojamientos y experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).

1. Síntesis de ARN guía

NOTA: Los crispantes cigóticos se han creado utilizando un solo ARN guía o multiplexando múltiples ARN guía a un solo objetivo 5,6,7,8,9,10. La multiplexación de ARN guía aumenta el porcentaje de embriones que muestran un fenotipo cigótico crujiente¹⁰. Debido a esta mayor frecuencia de embriones que exhiben un fenotipo, los crispantes maternos se crean multiplexando cuatro ARN guía a un solo gen. Un protocolo más detallado sobre el uso de CHOPCHOP para diseñar ARN guía y un método de recocido para sintetizar ARN guía para el pez cebra se puede encontrar en otra parte 16,17,18,19,20.

1. Para identificar un gen expresado maternamente para apuntar, determinar los niveles de transcripción de ARNm durante el desarrollo a través de una base de datos de secuencias de ARN que proporciona información del transcriptoma desde el cigoto hasta 5 días²¹. En general, los genes específicos de la madre están altamente expresados en el embrión temprano y se degradan después de que se activa el genoma cigótico²².
2. Una vez que se ha identificado un gen diana expresado maternamente, determine el primer dominio proteico predicho utilizando la sección "dominios y características" disponible en el navegador del genoma Ensembl²³. Utilice este dominio como región objetivo para los cuatro ARN guía.
3. Utilice el programa de selección de ARN guía CHOPCHOP para identificar cuatro sitios diana de ARN guía en el primer dominio activo. Diseñar oligonucleótidos específicos de genes, como se muestra a continuación para cada sitio objetivo. En el oligonucleótido específico del gen, la sección N²⁰ corresponde a la secuencia objetivo menos el sitio PAM (NGG) de CHOPCHOP. Ordene estos oligonucleótidos específicos de genes y el oligonucleótido constante usando la purificación de desalinización estándar (ver Tabla de materiales).
   Oligonucleótido específico del gen:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Para crear una plantilla de ARN guía para cada oligonucleótido específico del gen, recociéndolo al oligonucleótido constante y rellene los voladizos con T4-ADN polimerasa como se describió anteriormente¹⁶. Después de ensamblar las cuatro plantillas de ARN guía, purifíquelas y concéntrelas juntas utilizando un kit concentrador y de limpieza de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
5. Sintetice la mezcla de sgRNA a partir de la plantilla de ARN guía agrupada utilizando un kit de transcripción T7 in vitro (consulte la Tabla de materiales). Realice la transcripción in vitro de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de medias reacciones del kit de transcripción T7 puede disminuir el costo por reacción.
6. Después de la síntesis de ARN, purificar el conjunto resultante de sgRNAs utilizando un protocolo de etanol/acetato de amonio como se describió anteriormente 16,20,24. Después de aislar el ARN, resuspenderlo en 20 μL de agua libre de nucleasas. Si se usaron medias reacciones del kit de transcripción T7 para transcribir el conjunto de sgRNAs, resuspender el ARN purificado en 10-15 μL de agua libre de nucleasas.
7. Cuantificar la cantidad de sgRNAs agrupados que se crearon utilizando un espectrofotómetro. Diluir el conjunto de sgRNAs en agua libre de nucleasas a una dilución de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Típicamente, el volumen final de la dilución de trabajo varía de 30-50 μL.
8. Después de determinar la concentración del conjunto de sgRNAs, verifique la integridad de los sgRNAs en un gel de agarosa al 1%.
   1. Lanzar una agarosa/0,5 μg/ml de bromuro de etidio al 1%/gel EBT. Una vez que el gel se haya solidificado, colóquelo en el búfer de ejecución TBE.
   2. Mezcle 1 μL de la mezcla de sgRNA y 1 μL de tampón de carga de gel de ARN (consulte la Tabla de materiales). Cargue esta muestra en el gel y ejecute el gel a 100 V durante 5 minutos.
9. Visualice las bandas usando luz ultravioleta (UV). El conjunto de sgRNAs debe aparecer como una sola banda. Si se observa un frotis, es probable que se haya producido una degradación del ARN.
10. Almacenar el conjunto de sgRNAs en alícuotas de 1 μL de un solo uso en tubos de tiras de PCR libres de nucleasa en el congelador de -80 °C. Para grandes volúmenes de mezcla de sgRNAs (30 μL o más), alícuota la mitad del volumen en los tubos de tira de PCR libres de nucleasa y almacenar la otra mitad como un volumen mayor en un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa. Descongelar y alícuota cuando sea necesario.
11. Para evitar la degradación del ARN, asegúrese de que las muestras en el tubo de microcentrífuga no se sometan a más de dos ciclos de congelación y descongelación.

2. Preparación de reactivos y materiales para microinyección

NOTA: En el pez cebra, la inyección de ARNm Cas9 puede crear crujientes cigóticos. Sin embargo, estudios han demostrado que la proteína Cas9 es más eficiente en la creación de INDELs en embriones inyectados^16,25. Este protocolo utiliza la proteína Cas9 para generar crispantes maternos porque esta proteína no experimenta el mismo retraso en la actividad que el ARNm Cas9 inyectado. En teoría, esto debería aumentar la probabilidad de una mutación bialélica temprana en el desarrollo, lo que resulta en una mayor probabilidad de que una sección más extensa de la línea germinal se vea afectada. Otros protocolos y recursos que detallan cómo prepararse para las microinyecciones se pueden encontrar en otra parte^24,26.

1. Compre o genere proteína Cas9 (consulte la Tabla de materiales). Resuspender la proteína Cas9 en agua libre de nucleasa para hacer una solución de 2 mg/ml y alícuota 1 μL en tubos de microcentrífuga de polipropileno libres de RNasa. Almacénelos como tubos de un solo uso a -80 °C.
2. La tarde antes de la inyección, use un extractor de micropipetas para tirar de un capilar de vidrio y crear una aguja de inyección. Guarde la aguja intacta en un soporte de aguja cerrado hasta la mañana de las microinyecciones.
3. Para crear una placa de inyección, vierta 20 ml de agarosa al 1,5%_{/ H 2}O estéril para llenar la mitad de una placa de Petri de 100 mm X 15 mm y espere a que se solidifique. Una vez que la solución de agarosa esté establecida, agregue 20 ml de agarosa al 1,5%_{/ H 2}O estéril a la placa de Petri y coloque el molde de plástico (consulte la Tabla de materiales) en la agarosa líquida y deje que se endurezca.
4. Después de que la agarosa se haya endurecido, retire el molde de plástico y guarde la placa de inyección boca abajo en un refrigerador hasta la mañana de las inyecciones. Se puede usar una sola placa para múltiples inyecciones, siempre y cuando los pozos mantengan su integridad.

3. Microinyección del cóctel CRISPR-Cas9 en un embrión de pez cebra unicelular para generar crispantes maternos

NOTA: Se pueden encontrar más recursos para la microinyección en embriones de pez cebra en otros lugares^24,26,27. La inyección de la mezcla CRISPR-Cas9 en el blastodisco en desarrollo de embriones unicelulares puede aumentar la probabilidad de crear crispantes maternos. La mezcla también se puede inyectar en el saco vitelino hasta la etapa de 2 células. Sin embargo, las mezclas inyectadas en la yema dependen de la corriente ooplasmática para llegar al blastodisco, por lo que CRISPR-Cas9 inyectado en la yema podría disminuir la eficiencia de corte del CRISPR-Cas9²⁸.

1. La tarde antes de las microinyecciones, coloque cruces de tipo salvaje en cajas de apareamiento de pez cebra. Mantenga tanto el pez macho como el hembra en el mismo tanque, pero sepárelos con un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, saque una alícuota de 2 mg/ml de proteína Cas9 y una alícuota del conjunto de sgRNAs. En el tubo de microcentrífuga de polipropileno libre de RNasa que contiene la proteína Cas9, ensamble una mezcla de inyección de 5 μL que incluya el conjunto de sgRNAs, 1 μL de solución de rojo de fenol al 0,5% y agua libre de nucleasa. Apunte a una concentración final de 400 ng/μL de proteína Cas9 y 200 ng/μL de los sgRNAs agrupados en agua libre de RNasa o una proporción de 2:1 de proteína Cas9 a sgRNAs en el embrión inyectado. Esta mezcla de inyección se puede almacenar en hielo durante la mañana de la inyección.
3. Retire una placa de inyección del refrigerador y deje que se caliente a temperatura ambiente (RT) durante al menos 20 minutos.
4. Después de armar el cóctel de inyección, permita que el macho y la hembra se apareen, por ejemplo, quitando el divisor de la caja de apareamiento o colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra, según corresponda.
5. Después de que los peces hayan puesto, pero antes de que se hayan recolectado los embriones, corte la punta de una aguja intacta con una nueva cuchilla de afeitar o pinzas finas para crear una aguja que tenga un orificio lo suficientemente pequeño como para evitar daños en el embrión, pero que sea lo suficientemente ancho como para que no se obstruya con la mezcla de inyección. Después de cortar la aguja, cargue la aguja con la mezcla inyectable utilizando una punta de pipeta del microcargador insertada en el extremo posterior del capilar (consulte Tablas de materiales).
6. Después de llenar la aguja, incubar la aguja durante 5 minutos en RT para ensamblar complejos Cas9-sgRNA.
7. Encienda el microinyector e inserte la aguja en el micromanipulador. Coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de micrómetro y calibre la aguja ajustando la presión de inyección hasta que la aguja expulse un bolo de 1 nL en el aceite mineral.
   NOTA: Al inyectar en el aceite mineral, un bolo de 1 nL tendrá un diámetro de aproximadamente 0,125 mm (o radio de 0,062 mm) medido con el portaobjetos micrométrico.
8. Para sincronizar los embriones, recójalos después de 10 min usando un colador de plástico y enjuáguelos en una placa de Petri usando 1x medio E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, y agregue 20 μL de 0.03 M Azul de metileno por 1 L de 1x E3). Retire 10-15 embriones y colóquelos en una placa de Petri separada para mantenerlos como controles no inyectados.
9. Transfiera el resto de los embriones en desarrollo a los pocillos de la placa de inyección.
10. Inyecte 1 nL de solución (un total de 400 pg de proteína Cas9 y 200 pg de sgRNAs) en el blastodisco en desarrollo de un embrión de una célula. Si la punta de la aguja se obstruye, use fórceps para romper la punta hacia atrás y recalibre la aguja para expulsar un bolo de 1 nL. Asegúrese de inyectar todos los embriones durante los primeros 40 minutos de desarrollo después de la fertilización.
11. Después de completar la inyección, devuelva los embriones inyectados a una placa de Petri etiquetada que contenga 1x medio E3 y permita que se desarrollen durante todo el día. Retire cualquier embrión que no esté fertilizado o que no se esté desarrollando normalmente de acuerdo con la serie²⁹ de estadificación del pez cebra.

4. Cribado de INDELs somáticos en embriones inyectados F0

NOTA: Se pueden utilizar otros métodos para identificar INDELs, como el ensayo de endonucleasa I T7 o el análisis de fusión de alta resolución, para determinar si los embriones contienen INDELs somáticos ³⁰.

1. Al día siguiente después de las inyecciones, retire los embriones defectuosos y lisados de la placa de Petri y reemplace el medio 1x E3 para mantener la salud del embrión.
2. Después de limpiar el plato, recoja seis embriones sanos inyectados y dos embriones de control del plato no inyectado. Coloque cada embrión individualmente en un solo pocillo de un tubo de tira de PCR y etiquete la parte superior de los tubos.
3. Para extraer el ADN genómico de embriones individuales, retire el exceso de medios E3 de los pocillos del tubo de tira y agregue 100 μL de NaOH de 50 mM por pocillo.
4. Incubar los embriones a 95 °C durante 20 min. A continuación, enfriar las muestras a 4 °C, añadir 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) y vorácelas durante 5 a 10 s. Este ADN extraído puede almacenarse a -20 °C durante al menos 6 meses sin degradación significativa del ADN.
5. Diseñe cebadores de detección únicos para cada sitio guía para amplificar un fragmento de ADN de 100-110 pb que incluya el sitio objetivo de CRISPR-Cas9. Si es posible, coloque el sitio de destino en el centro del fragmento amplificado, lo que permite la identificación de eliminaciones más grandes.
6. Para cada uno de los cuatro sitios objetivo guía, configure ocho reacciones de PCR de 25 μL utilizando 5 μL del ADN genómico de un solo embrión preparado, la mezcla de PCR y los cebadores de detección específicos de la guía para identificar mutaciones somáticas en el sitio objetivo (Tabla 1).
7. Lanzar un gel de bromuro de etidio / TBE al 2,5% de agarosa/0,5 μg/ml de bélido/EBT utilizando peines que creen pocillos de aproximadamente 0,625 cm de ancho. Este peine ancho permite una mejor resolución al detectar cambios de tamaño en la secuencia genómica. Después de que el gel se haya solidificado, colóquelo en una cámara de electroforesis que contenga tampón de ejecución TBE.
8. Agregue 5 μL de tinte de carga 6x al producto de PCR y cargue 25 μL de esta mezcla en el gel. Asegúrese de que las muestras inyectadas y de control se ejecuten en la misma fila del gel. Después de cargar todas las muestras, agregue 5 μL de bromuro de etidio por 1 L de tampón de ejecución de TBE al extremo positivo de la caja de gel.
9. Pase el gel a 120 V hasta que las bandas de ADN se resuelvan o el ADN se haya acercado al final del carril. Si el Cas9 creó INDELs en el sitio objetivo, normalmente se observa un frotis en las muestras inyectadas, pero no en los controles.
10. Si se observan frotis en un mínimo de tres de los cuatro sitios guía en embriones inyectados con cuatro ARN guía, crezcan los embriones inyectados por hermanos.
11. Siempre que las muestras inyectadas no contengan frotis en el número requerido de sitios guía, diseñe nuevos ARN guía para reemplazar los que no funcionaron y cree un nuevo grupo de ARN guía que incluya los que funcionaron y los recién diseñados. Inyecte y pruebe el nuevo grupo para detectar INDEL somáticos como se describió anteriormente.

5. Identificación de fenotipos de efecto materno en embriones maternos crispant

NOTA: Una vez que las hembras F0 inyectadas han alcanzado la madurez sexual, sus células germinales tienen el potencial de generar una mezcla de embriones maternos crujientes y de tipo salvaje. A pesar de que esta mezcla permite controles internos para la fertilización y el momento del desarrollo, sigue siendo beneficioso establecer un incross de tipo salvaje como control externo en caso de que un embrague de F0 hembra contenga solo embriones maternos crispantes.

1. La tarde antes del experimento, configure las hembras inyectadas F0 contra machos de tipo salvaje y controle cruces de tipo salvaje en cajas de apareamiento estándar de pez cebra. Coloque tanto el pez macho como la hembra en el mismo tanque, pero sepárelos con un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, permita que el macho y la hembra comiencen a aparearse, por ejemplo, quitando el divisor de la caja de apareamiento o colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra.
3. Recoja los embriones cada 10 minutos moviendo el inserto de puesta de huevos a un nuevo fondo del tanque de apareamiento que contenga agua fresca del sistema y etiquete el tanque con una etiqueta que identifique a la hembra F0 individual. Tome el tanque de apareamiento viejo y vierta el agua a través de un colador de té para recolectar los embriones de un embrague individual de 10 minutos.
4. Una vez que los embriones de un solo embrague de 10 minutos se hayan recogido en el colador, transfiéralos a una placa de Petri que contenga 1x medio E3. Etiquete la placa de Petri con la hora de recolección y la información del pescado.
5. Bajo un microscopio de disección con una fuente de luz transmitida, observe los embriones en desarrollo cada hora durante las primeras 6-8 h y diariamente durante los próximos 5 días.
6. Identificar posibles embriones maternos crispantes por cambios morfológicos macroscópicos en su desarrollo en comparación con controles de tipo salvaje emparejados en el tiempo²⁹.
7. Mover los embriones crujientes maternos potenciales a una placa de Petri que contenga 1x medio E3 y ensayo para fenotipo morfológico a 24 hpf y viabilidad (por ejemplo, inflado de la vejiga natatoria) a los 5 días después de la fertilización.

6. Secuenciación de alelos en haploides crujientes maternos

NOTA: Los haploides crujientes maternos contienen un solo alelo en el locus objetivo, lo que permite la identificación de INDEL en el gen objetivo a través de la secuenciación de Sanger. Los embriones haploides maternos crujientes también se pueden analizar utilizando ensayos de secuenciación de próxima generación. Se espera que los embriones que muestran un fenotipo materno crispante porten una lesión en al menos uno de los cuatro sitios objetivo (Ver Discusión).

1. La tarde antes del experimento, se establecieron parejas de apareamiento de hembras F0 conocidas por producir embriones maternos crujientes cruzados a machos de tipo salvaje. Mantenga a los machos de tipo salvaje físicamente separados de las hembras usando un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra en el inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, retire la partición física o coloque tanto los machos como las hembras dentro del inserto de puesta de huevos para iniciar el apareamiento. A la primera señal de puesta de huevos, interrumpa la reproducción separando al macho y a las hembras F0. Mantenga cada hembra F0 separada en cajas de apareamiento individuales.
3. Preparar una solución de esperma tratada con UV utilizando testículos de un macho de tipo salvaje por cada 100 μL de solución de Hank (Tabla 2), suficiente para fertilizar óvulos extruidos de una hembra, como se describió anteriormente³¹.
4. Extruir manualmente óvulos maduros de las hembras F0 preseleccionadas y realizar fertilización in vitro (FIV) utilizando el esperma tratado con UV³¹.
5. Después de la fertilización in vitro , permita que los embriones haploides se desarrollen hasta que se observe el fenotipo crujiente materno y coloque esos embriones en una placa de Petri diferente.
6. Una vez que se hayan identificado los embriones haploides maternos crispantes, permítales desarrollarse durante al menos 6 h después de la fertilización.
7. Para extraer el ADN genómico de al menos diez embriones haploides maternos crispantes, coloque un solo embrión haploide en un pocillo individual de un tubo de tira de PCR, elimine el exceso de medios E3 del pocillo y agregue 50 μL de NaOH a 50 mM.
8. Incubar los embriones a 95 °C durante 20 min. A continuación, enfriar las muestras hasta 4 °C, añadir 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) y vórtice durante 5-10 s. El ADN extraído puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
9. Para identificar qué sitios guía contienen INDEL, diseñe cebadores de secuenciación para amplificar un fragmento de ADN que incluya los cuatro sitios objetivo de CRISPR-Cas9. Estos cebadores de secuenciación permiten la identificación de INDEL que abarcan múltiples sitios de guía.
10. Configure dos reacciones de PCR de 25 μL por embrión utilizando 5 μL del ADN genómico preparado y los cebadores de secuenciación.
11. Una vez finalizada la PCR, purifique y concentre las dos muestras utilizando un kit concentrador y de limpieza de ADN (consulte la Tabla de materiales). Luego envíe el fragmento de ADN a la secuenciación de Sanger utilizando los cebadores de secuenciación directa e inversa.
12. Después de secuenciar el fragmento de crispante materno haploide, alinéelo a la secuencia de tipo salvaje e identifique los INDEL en los sitios objetivo utilizando un programa de alineación de secuencias.

El enfoque experimental descrito en este protocolo permite la identificación de fenotipos de efecto materno de una manera rápida y eficiente en el uso de los recursos (Figura 1).

Generación de crispantes maternos:
Al diseñar los cuatro ARN guía para dirigirse a un solo gen candidato de efecto materno, se debe prestar especial atención a dónde se unirán los ARN guía al ADN. En general, todos deben agruparse con regiones mínimas o nulas superpuestas entre los ARN guía al comienzo del primer dominio proteico predicho (Figura 2A). Dirigir los ARN guía a este dominio aumenta la posibilidad de que tanto los INDEL dentro como fuera del marco afecten la función de la proteína. Otras variables que deben considerarse al diseñar ARN guía son la eficiencia de corte y el número de sitios fuera del objetivo en el genoma.

Después de inyectar la solución CRISPR-Cas9, la actividad somática de Cas9 se puede determinar ejecutando un pequeño fragmento de PCR, aproximadamente 100 pb, en un gel de agarosa. Si se crearon INDELs en el embrión inyectado, se debe observar un frotis en las muestras inyectadas, pero no en el control no inyectado (Figura 2B). Cada sitio guía debe probarse independientemente para determinar la actividad de Cas9 en células somáticas. Si se observan frotis en al menos tres sitios guía, los embriones inyectados por hermanos deben crecer y examinarse para detectar fenotipos maternos crujientes.

Identificación de crispantes maternos:
Para determinar si los crispantes maternos se crean en cruces naturales, los embriones de un pez hembra F0 se pueden comparar con controles de tipo salvaje emparejados en el tiempo para observar cualquier cambio en el desarrollo temprano. Las nidadas F0 también deben puntuarse a 24 hpf y 5 días después de la fertilización para examinar el desarrollo del plan corporal básico y la viabilidad, respectivamente, para identificar los factores maternos que podrían regular las etapas posteriores del desarrollo embrionario. La identificación de un fenotipo compartido en nidadas de diferentes hembras F0 facilita distinguir los efectos causados por la pérdida de función de un gen diana de efectos fuera del objetivo o no específicos.

Además, las nidadas que contienen crispantes maternos son típicamente mosaico (es decir, incluyen embriones fenotípicos de tipo salvaje y embriones de crispantes maternos), lo que permite que los embriones de tipo salvaje actúen como un control interno para variables como el momento de la fertilización y la tasa de desarrollo. En promedio, las nidadas de hembras F0 contendrán aproximadamente 69% de embriones maternos crispantes, y se observaron embragues maternos que contienen hasta 100% de embriones crujientes maternos11.

Después de identificar embriones maternos crispantes, pueden ser utilizados para la caracterización molecular primaria, es decir, inmunomarcaje para límites celulares o tinción de ADN con DAPI, que puede proporcionar información sobre la naturaleza celular del proceso de desarrollo afectado11. El método crispant materno también se puede utilizar para fenocopiar mutaciones conocidas de efecto materno, como motley, tmi y aura (Figura 3)11.

Secuenciación de haploides crujientes maternos:
Para identificar la(s) lesión(es) genética(s) que contribuyen al fenotipo crispante materno, los espermatozoides tratados con UV y la FIV se combinan para crear haploides crujientes maternos (Figura 4). Los espermatozoides tratados con UV proporcionan un centriolo, pero no aportan ADN paterno, lo que permite que la división celular ocurra solo con material genómico materno. La creación de un haploide permite la secuenciación de Sanger del alelo materno y la identificación de INDELs crujientes maternos (Figura 4). En promedio, se observaron dos alelos por embrague de haploide crujiente materno. Los INDEL identificados a través de la secuenciación de Sanger incluyen ediciones tanto en sitios de guía individuales como en eliminaciones que abarcan múltiples sitios de guía (Figura 4C, Tabla 3). Un estudio de INDELs haploides maternos crispantes de diferentes hembras F0 muestra que los mismos sitios guía se editan en múltiples embriones, y la mayoría de las mutaciones recuperadas son codones de parada prematura (Tabla 3)11.

Figura 1: Flujo de trabajo materno crispante. Para crear un crujiente materno, comience diseñando cuatro ARNg que se dirijan al primer dominio activo del gen. 1) Luego sintetiza los cuatro gRNAs en una sola reacción. 2) Después de sintetizar y purificar los ARNg, cree un cóctel CRISPR-Cas9 e inyecte en el blastodisco de un embrión unicelular. 3) A continuación, examine los embriones inyectados para detectar mutaciones somáticas mediante PCR y electroforesis en gel. Si se crearan INDEL en muestras inyectadas, aparecería un frotis en los embriones inyectados, en contraste con la banda apretada del control de tipo salvaje. 4) Permita que los hermanos de los embriones inyectados crezcan durante 3-6 meses para alcanzar la madurez sexual. Después de alcanzar la madurez sexual, cruce una hembra inyectada F0 contra un macho de tipo salvaje. La progenie resultante puede ser una mezcla de embriones crujientes de tipo salvaje y maternos. Identificar una hembra inyectada F0 cuyos embriones muestran el fenotipo de efecto materno. 5) Para identificar las lesiones que contribuyen al fenotipo, la FIV se realiza utilizando espermatozoides tratados con UV para crear haploides crujientes maternos para la secuenciación de Sanger. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Generación de INDELs en genes diana. (A) Diagrama de estructura génica que muestra dominios proteicos hipotéticos (bloques púrpura claro y oscuro), ubicación de ARNg (líneas rojas) y sitios PAM (estrellas rojas). Los ARNg se dirigen al primer dominio activo. Los exones se muestran como bloques y los intrones se muestran como líneas. (B) Los frotis en un gel de agarosa al 2,5% son indicativos de INDEL en células somáticas en embriones inyectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Los crispantes maternos recapitulan el fenotipo de mutaciones conocidas de efecto materno. Comparación representativa de embriones silvestres vivos, emparejados en el tiempo (columna izquierda), mutantes maternos conocidos (columna central) y embriones maternos crispantes (columna derecha). (A) abigarrado/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura / mid1ipIl mutantes / crispantes maternos muestran defectos en la citocinesis en las divisiones embrionarias tempranas, lo que lleva a blástulas completamente sincitiales (A, B) o embriones parcialmente acelulares (C, caja blanca). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Uso de haploides crujientes maternos para secuenciar mutaciones inducidas por CRISPR-Cas9 . (A) Una hembra inyectada F0 cruzada contra un macho de tipo salvaje da como resultado un embrión diploide con un fenotipo de efecto materno. (B) La FIV se realiza utilizando espermatozoides tratados con UV para crear haploides crujientes maternos, lo que permite la secuenciación y el análisis de INDEL inducidos en el alelo materno. (C) Secuenciación representativa del haploide crujiente materno birc5b que muestra una gran deleción entre los sitios guía 3 y 4 (recuadro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Mezcla de PCR.

Tabla 2: Solución de Hank.

Tabla 3: La ubicación y el tipo de INDEL encontrados en dos conjuntos diferentes de haploides crujientes maternos: birc5b y prc1l.

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.