Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Resumen

El desarrollo temprano depende de los productos heredados por la madre, y el papel de muchos de estos productos es actualmente desconocido. En este documento, describimos un protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenotipos de efecto materno en una sola generación.

Resumen

El desarrollo temprano depende de un conjunto de factores maternos incorporados al ovocito maduro durante la ovogénesis que realizan todas las funciones celulares necesarias para el desarrollo hasta la activación del genoma cigótico. Por lo general, la orientación genética de estos factores maternos requiere una generación adicional para identificar fenotipos de efecto materno, lo que dificulta la capacidad de determinar el papel de los genes expresados por la madre durante el desarrollo. El descubrimiento de las capacidades de edición bialélica de CRISPR-Cas9 ha permitido la detección de fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados o "crispantes", aumentando la comprensión del papel que desempeñan los genes expresados cigóticamente en los programas de desarrollo. En este artículo se describe un protocolo que es una extensión del método crispant. En este método, la edición bialélica de las células germinales permite el aislamiento de un fenotipo de efecto materno en una sola generación, o "crispantes maternos". La multiplexación guía a los ARN a un solo objetivo promueve la producción eficiente de crispantes maternos, mientras que el análisis de secuencia de haploides de crispantes maternos proporciona un método simple para corroborar las lesiones genéticas que producen un fenotipo de efecto materno. El uso de crispantes maternos apoya la rápida identificación de genes esenciales expresados por la madre, facilitando así la comprensión del desarrollo temprano.

Introducción

Un conjunto de productos depositados por la madre (por ejemplo, ARN, proteínas y otras biomoléculas) es necesario para todos los procesos celulares tempranos hasta que se active el genoma cigótico del embrión¹. El agotamiento prematuro de estos productos del ovocito es típicamente letal embrionario. A pesar de la importancia de estos genes en el desarrollo, el papel de muchos genes expresados por la madre es actualmente desconocido. El avance en la tecnología de edición de genes en el pez cebra, como CRISPR-Cas9, permite la focalización de genes expresados maternamente ^2,3,4. Sin embargo, la identificación de un fenotipo de efecto materno requiere una generación adicional en comparación con un fenotipo cigótico, por lo que requiere más recursos. Recientemente, la capacidad de edición bialélica de CRISPR-Cas9 se ha utilizado para detectar fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados (F0), conocidos como "crispantes"5,6,7,8,9,10. La técnica crispant permite la detección eficiente de genes candidatos en células somáticas, facilitando la comprensión de aspectos específicos en el desarrollo. El protocolo descrito en este trabajo permite la identificación de fenotipos de efecto materno, o "crispantes maternos", en una sola generación¹¹. Este esquema se puede lograr mediante la multiplexación de ARN guía a un solo gen y la promoción de eventos de edición bialélica en la línea germinal. Estos embriones maternos crispantes pueden identificarse por fenotipos morfológicos macroscópicos y someterse a una caracterización primaria, como el etiquetado de los límites celulares y el patrón de ADN¹¹. El análisis combinado del fenotipo observable y la caracterización molecular básica de los INDEL inducidos permite predecir el papel del gen objetivo en el desarrollo temprano.

En el pez cebra, durante las primeras 24 h después de la fertilización (hpf), un pequeño grupo de células se convierte en las células germinales primordiales, un precursor de la línea germinal^12,13,14,15. En las garras colocadas por hembras F0, la proporción de embriones maternos crispantes recuperados depende de cuántas células germinales contienen un evento de edición bialélico en el gen objetivo. En general, cuanto antes ocurra el evento de edición en el embrión, mayor será la probabilidad de que se observen mutaciones CRISPR-Cas9 en la línea germinal. En la mayoría de los casos, los fenotipos de embriones crujientes maternos provienen de la pérdida de función en los dos alelos maternos presentes en el ovocito en desarrollo. A medida que el ovocito termina la meiosis, uno de los alelos maternos se extruye del embrión a través del cuerpo polar, mientras que el otro alelo se incorpora al pronúcleo materno. La secuenciación de múltiples haploides crujientes maternos representará una mezcla de las mutaciones (inserciones y/o deleciones (INDELs)) presentes en la línea germinal que contribuyen al fenotipo¹¹.

El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para crear mutaciones CRISPR-Cas9 en genes de efecto materno e identificar el fenotipo correspondiente utilizando un enfoque de crispante materno (Figura 1). La sección uno explicará cómo diseñar y crear ARN guía de manera efectiva, mientras que las secciones dos y tres contienen pasos críticos para crear crispantes maternos mediante microinyección. Después de inyectar la mezcla CRISPR-Cas9, los embriones inyectados se examinan para detectar ediciones somáticas mediante PCR (sección cuatro). Una vez que los embriones F0 inyectados se desarrollan y alcanzan la madurez sexual, las hembras F0 se cruzan con machos de tipo salvaje, y sus crías son examinadas para detectar fenotipos de efecto materno (sección cinco). La sección seis incluye instrucciones sobre cómo hacer haploides crujientes maternos que se pueden combinar con la secuenciación de Sanger para identificar los INDEL inducidos por CRISPR-Cas9. Además, la Discusión contiene modificaciones que se pueden hacer al protocolo para aumentar la sensibilidad y el poder de este método.

Protocolo

En los estudios que condujeron al desarrollo de este protocolo, todos los alojamientos y experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).

1. Síntesis de ARN guía

NOTA: Los crispantes cigóticos se han creado utilizando un solo ARN guía o multiplexando múltiples ARN guía a un solo objetivo 5,6,7,8,9,10. La multiplexación de ARN guía aumenta el porcentaje de embriones que muestran un fenotipo cigótico crujiente¹⁰. Debido a esta mayor frecuencia de embriones que exhiben un fenotipo, los crispantes maternos se crean multiplexando cuatro ARN guía a un solo gen. Un protocolo más detallado sobre el uso de CHOPCHOP para diseñar ARN guía y un método de recocido para sintetizar ARN guía para el pez cebra se puede encontrar en otra parte 16,17,18,19,20.

1. Para identificar un gen expresado maternamente para apuntar, determinar los niveles de transcripción de ARNm durante el desarrollo a través de una base de datos de secuencias de ARN que proporciona información del transcriptoma desde el cigoto hasta 5 días²¹. En general, los genes específicos de la madre están altamente expresados en el embrión temprano y se degradan después de que se activa el genoma cigótico²².
2. Una vez que se ha identificado un gen diana expresado maternamente, determine el primer dominio proteico predicho utilizando la sección "dominios y características" disponible en el navegador del genoma Ensembl²³. Utilice este dominio como región objetivo para los cuatro ARN guía.
3. Utilice el programa de selección de ARN guía CHOPCHOP para identificar cuatro sitios diana de ARN guía en el primer dominio activo. Diseñar oligonucleótidos específicos de genes, como se muestra a continuación para cada sitio objetivo. En el oligonucleótido específico del gen, la sección N²⁰ corresponde a la secuencia objetivo menos el sitio PAM (NGG) de CHOPCHOP. Ordene estos oligonucleótidos específicos de genes y el oligonucleótido constante usando la purificación de desalinización estándar (ver Tabla de materiales).
   Oligonucleótido específico del gen:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Para crear una plantilla de ARN guía para cada oligonucleótido específico del gen, recociéndolo al oligonucleótido constante y rellene los voladizos con T4-ADN polimerasa como se describió anteriormente¹⁶. Después de ensamblar las cuatro plantillas de ARN guía, purifíquelas y concéntrelas juntas utilizando un kit concentrador y de limpieza de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
5. Sintetice la mezcla de sgRNA a partir de la plantilla de ARN guía agrupada utilizando un kit de transcripción T7 in vitro (consulte la Tabla de materiales). Realice la transcripción in vitro de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de medias reacciones del kit de transcripción T7 puede disminuir el costo por reacción.
6. Después de la síntesis de ARN, purificar el conjunto resultante de sgRNAs utilizando un protocolo de etanol/acetato de amonio como se describió anteriormente 16,20,24. Después de aislar el ARN, resuspenderlo en 20 μL de agua libre de nucleasas. Si se usaron medias reacciones del kit de transcripción T7 para transcribir el conjunto de sgRNAs, resuspender el ARN purificado en 10-15 μL de agua libre de nucleasas.
7. Cuantificar la cantidad de sgRNAs agrupados que se crearon utilizando un espectrofotómetro. Diluir el conjunto de sgRNAs en agua libre de nucleasas a una dilución de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Típicamente, el volumen final de la dilución de trabajo varía de 30-50 μL.
8. Después de determinar la concentración del conjunto de sgRNAs, verifique la integridad de los sgRNAs en un gel de agarosa al 1%.
   1. Lanzar una agarosa/0,5 μg/ml de bromuro de etidio al 1%/gel EBT. Una vez que el gel se haya solidificado, colóquelo en el búfer de ejecución TBE.
   2. Mezcle 1 μL de la mezcla de sgRNA y 1 μL de tampón de carga de gel de ARN (consulte la Tabla de materiales). Cargue esta muestra en el gel y ejecute el gel a 100 V durante 5 minutos.
9. Visualice las bandas usando luz ultravioleta (UV). El conjunto de sgRNAs debe aparecer como una sola banda. Si se observa un frotis, es probable que se haya producido una degradación del ARN.
10. Almacenar el conjunto de sgRNAs en alícuotas de 1 μL de un solo uso en tubos de tiras de PCR libres de nucleasa en el congelador de -80 °C. Para grandes volúmenes de mezcla de sgRNAs (30 μL o más), alícuota la mitad del volumen en los tubos de tira de PCR libres de nucleasa y almacenar la otra mitad como un volumen mayor en un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa. Descongelar y alícuota cuando sea necesario.
11. Para evitar la degradación del ARN, asegúrese de que las muestras en el tubo de microcentrífuga no se sometan a más de dos ciclos de congelación y descongelación.

2. Preparación de reactivos y materiales para microinyección

NOTA: En el pez cebra, la inyección de ARNm Cas9 puede crear crujientes cigóticos. Sin embargo, estudios han demostrado que la proteína Cas9 es más eficiente en la creación de INDELs en embriones inyectados^16,25. Este protocolo utiliza la proteína Cas9 para generar crispantes maternos porque esta proteína no experimenta el mismo retraso en la actividad que el ARNm Cas9 inyectado. En teoría, esto debería aumentar la probabilidad de una mutación bialélica temprana en el desarrollo, lo que resulta en una mayor probabilidad de que una sección más extensa de la línea germinal se vea afectada. Otros protocolos y recursos que detallan cómo prepararse para las microinyecciones se pueden encontrar en otra parte^24,26.

1. Compre o genere proteína Cas9 (consulte la Tabla de materiales). Resuspender la proteína Cas9 en agua libre de nucleasa para hacer una solución de 2 mg/ml y alícuota 1 μL en tubos de microcentrífuga de polipropileno libres de RNasa. Almacénelos como tubos de un solo uso a -80 °C.
2. La tarde antes de la inyección, use un extractor de micropipetas para tirar de un capilar de vidrio y crear una aguja de inyección. Guarde la aguja intacta en un soporte de aguja cerrado hasta la mañana de las microinyecciones.
3. Para crear una placa de inyección, vierta 20 ml de agarosa al 1,5%_{/ H 2}O estéril para llenar la mitad de una placa de Petri de 100 mm X 15 mm y espere a que se solidifique. Una vez que la solución de agarosa esté establecida, agregue 20 ml de agarosa al 1,5%_{/ H 2}O estéril a la placa de Petri y coloque el molde de plástico (consulte la Tabla de materiales) en la agarosa líquida y deje que se endurezca.
4. Después de que la agarosa se haya endurecido, retire el molde de plástico y guarde la placa de inyección boca abajo en un refrigerador hasta la mañana de las inyecciones. Se puede usar una sola placa para múltiples inyecciones, siempre y cuando los pozos mantengan su integridad.

3. Microinyección del cóctel CRISPR-Cas9 en un embrión de pez cebra unicelular para generar crispantes maternos

NOTA: Se pueden encontrar más recursos para la microinyección en embriones de pez cebra en otros lugares^24,26,27. La inyección de la mezcla CRISPR-Cas9 en el blastodisco en desarrollo de embriones unicelulares puede aumentar la probabilidad de crear crispantes maternos. La mezcla también se puede inyectar en el saco vitelino hasta la etapa de 2 células. Sin embargo, las mezclas inyectadas en la yema dependen de la corriente ooplasmática para llegar al blastodisco, por lo que CRISPR-Cas9 inyectado en la yema podría disminuir la eficiencia de corte del CRISPR-Cas9²⁸.

1. La tarde antes de las microinyecciones, coloque cruces de tipo salvaje en cajas de apareamiento de pez cebra. Mantenga tanto el pez macho como el hembra en el mismo tanque, pero sepárelos con un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, saque una alícuota de 2 mg/ml de proteína Cas9 y una alícuota del conjunto de sgRNAs. En el tubo de microcentrífuga de polipropileno libre de RNasa que contiene la proteína Cas9, ensamble una mezcla de inyección de 5 μL que incluya el conjunto de sgRNAs, 1 μL de solución de rojo de fenol al 0,5% y agua libre de nucleasa. Apunte a una concentración final de 400 ng/μL de proteína Cas9 y 200 ng/μL de los sgRNAs agrupados en agua libre de RNasa o una proporción de 2:1 de proteína Cas9 a sgRNAs en el embrión inyectado. Esta mezcla de inyección se puede almacenar en hielo durante la mañana de la inyección.
3. Retire una placa de inyección del refrigerador y deje que se caliente a temperatura ambiente (RT) durante al menos 20 minutos.
4. Después de armar el cóctel de inyección, permita que el macho y la hembra se apareen, por ejemplo, quitando el divisor de la caja de apareamiento o colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra, según corresponda.
5. Después de que los peces hayan puesto, pero antes de que se hayan recolectado los embriones, corte la punta de una aguja intacta con una nueva cuchilla de afeitar o pinzas finas para crear una aguja que tenga un orificio lo suficientemente pequeño como para evitar daños en el embrión, pero que sea lo suficientemente ancho como para que no se obstruya con la mezcla de inyección. Después de cortar la aguja, cargue la aguja con la mezcla inyectable utilizando una punta de pipeta del microcargador insertada en el extremo posterior del capilar (consulte Tablas de materiales).
6. Después de llenar la aguja, incubar la aguja durante 5 minutos en RT para ensamblar complejos Cas9-sgRNA.
7. Encienda el microinyector e inserte la aguja en el micromanipulador. Coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de micrómetro y calibre la aguja ajustando la presión de inyección hasta que la aguja expulse un bolo de 1 nL en el aceite mineral.
   NOTA: Al inyectar en el aceite mineral, un bolo de 1 nL tendrá un diámetro de aproximadamente 0,125 mm (o radio de 0,062 mm) medido con el portaobjetos micrométrico.
8. Para sincronizar los embriones, recójalos después de 10 min usando un colador de plástico y enjuáguelos en una placa de Petri usando 1x medio E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, y agregue 20 μL de 0.03 M Azul de metileno por 1 L de 1x E3). Retire 10-15 embriones y colóquelos en una placa de Petri separada para mantenerlos como controles no inyectados.
9. Transfiera el resto de los embriones en desarrollo a los pocillos de la placa de inyección.
10. Inyecte 1 nL de solución (un total de 400 pg de proteína Cas9 y 200 pg de sgRNAs) en el blastodisco en desarrollo de un embrión de una célula. Si la punta de la aguja se obstruye, use fórceps para romper la punta hacia atrás y recalibre la aguja para expulsar un bolo de 1 nL. Asegúrese de inyectar todos los embriones durante los primeros 40 minutos de desarrollo después de la fertilización.
11. Después de completar la inyección, devuelva los embriones inyectados a una placa de Petri etiquetada que contenga 1x medio E3 y permita que se desarrollen durante todo el día. Retire cualquier embrión que no esté fertilizado o que no se esté desarrollando normalmente de acuerdo con la serie²⁹ de estadificación del pez cebra.

4. Cribado de INDELs somáticos en embriones inyectados F0

NOTA: Se pueden utilizar otros métodos para identificar INDELs, como el ensayo de endonucleasa I T7 o el análisis de fusión de alta resolución, para determinar si los embriones contienen INDELs somáticos ³⁰.

1. Al día siguiente después de las inyecciones, retire los embriones defectuosos y lisados de la placa de Petri y reemplace el medio 1x E3 para mantener la salud del embrión.
2. Después de limpiar el plato, recoja seis embriones sanos inyectados y dos embriones de control del plato no inyectado. Coloque cada embrión individualmente en un solo pocillo de un tubo de tira de PCR y etiquete la parte superior de los tubos.
3. Para extraer el ADN genómico de embriones individuales, retire el exceso de medios E3 de los pocillos del tubo de tira y agregue 100 μL de NaOH de 50 mM por pocillo.
4. Incubar los embriones a 95 °C durante 20 min. A continuación, enfriar las muestras a 4 °C, añadir 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) y vorácelas durante 5 a 10 s. Este ADN extraído puede almacenarse a -20 °C durante al menos 6 meses sin degradación significativa del ADN.
5. Diseñe cebadores de detección únicos para cada sitio guía para amplificar un fragmento de ADN de 100-110 pb que incluya el sitio objetivo de CRISPR-Cas9. Si es posible, coloque el sitio de destino en el centro del fragmento amplificado, lo que permite la identificación de eliminaciones más grandes.
6. Para cada uno de los cuatro sitios objetivo guía, configure ocho reacciones de PCR de 25 μL utilizando 5 μL del ADN genómico de un solo embrión preparado, la mezcla de PCR y los cebadores de detección específicos de la guía para identificar mutaciones somáticas en el sitio objetivo (Tabla 1).
7. Lanzar un gel de bromuro de etidio / TBE al 2,5% de agarosa/0,5 μg/ml de bélido/EBT utilizando peines que creen pocillos de aproximadamente 0,625 cm de ancho. Este peine ancho permite una mejor resolución al detectar cambios de tamaño en la secuencia genómica. Después de que el gel se haya solidificado, colóquelo en una cámara de electroforesis que contenga tampón de ejecución TBE.
8. Agregue 5 μL de tinte de carga 6x al producto de PCR y cargue 25 μL de esta mezcla en el gel. Asegúrese de que las muestras inyectadas y de control se ejecuten en la misma fila del gel. Después de cargar todas las muestras, agregue 5 μL de bromuro de etidio por 1 L de tampón de ejecución de TBE al extremo positivo de la caja de gel.
9. Pase el gel a 120 V hasta que las bandas de ADN se resuelvan o el ADN se haya acercado al final del carril. Si el Cas9 creó INDELs en el sitio objetivo, normalmente se observa un frotis en las muestras inyectadas, pero no en los controles.
10. Si se observan frotis en un mínimo de tres de los cuatro sitios guía en embriones inyectados con cuatro ARN guía, crezcan los embriones inyectados por hermanos.
11. Siempre que las muestras inyectadas no contengan frotis en el número requerido de sitios guía, diseñe nuevos ARN guía para reemplazar los que no funcionaron y cree un nuevo grupo de ARN guía que incluya los que funcionaron y los recién diseñados. Inyecte y pruebe el nuevo grupo para detectar INDEL somáticos como se describió anteriormente.

5. Identificación de fenotipos de efecto materno en embriones maternos crispant

NOTA: Una vez que las hembras F0 inyectadas han alcanzado la madurez sexual, sus células germinales tienen el potencial de generar una mezcla de embriones maternos crujientes y de tipo salvaje. A pesar de que esta mezcla permite controles internos para la fertilización y el momento del desarrollo, sigue siendo beneficioso establecer un incross de tipo salvaje como control externo en caso de que un embrague de F0 hembra contenga solo embriones maternos crispantes.

1. La tarde antes del experimento, configure las hembras inyectadas F0 contra machos de tipo salvaje y controle cruces de tipo salvaje en cajas de apareamiento estándar de pez cebra. Coloque tanto el pez macho como la hembra en el mismo tanque, pero sepárelos con un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, permita que el macho y la hembra comiencen a aparearse, por ejemplo, quitando el divisor de la caja de apareamiento o colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra.
3. Recoja los embriones cada 10 minutos moviendo el inserto de puesta de huevos a un nuevo fondo del tanque de apareamiento que contenga agua fresca del sistema y etiquete el tanque con una etiqueta que identifique a la hembra F0 individual. Tome el tanque de apareamiento viejo y vierta el agua a través de un colador de té para recolectar los embriones de un embrague individual de 10 minutos.
4. Una vez que los embriones de un solo embrague de 10 minutos se hayan recogido en el colador, transfiéralos a una placa de Petri que contenga 1x medio E3. Etiquete la placa de Petri con la hora de recolección y la información del pescado.
5. Bajo un microscopio de disección con una fuente de luz transmitida, observe los embriones en desarrollo cada hora durante las primeras 6-8 h y diariamente durante los próximos 5 días.
6. Identificar posibles embriones maternos crispantes por cambios morfológicos macroscópicos en su desarrollo en comparación con controles de tipo salvaje emparejados en el tiempo²⁹.
7. Mover los embriones crujientes maternos potenciales a una placa de Petri que contenga 1x medio E3 y ensayo para fenotipo morfológico a 24 hpf y viabilidad (por ejemplo, inflado de la vejiga natatoria) a los 5 días después de la fertilización.

6. Secuenciación de alelos en haploides crujientes maternos

NOTA: Los haploides crujientes maternos contienen un solo alelo en el locus objetivo, lo que permite la identificación de INDEL en el gen objetivo a través de la secuenciación de Sanger. Los embriones haploides maternos crujientes también se pueden analizar utilizando ensayos de secuenciación de próxima generación. Se espera que los embriones que muestran un fenotipo materno crispante porten una lesión en al menos uno de los cuatro sitios objetivo (Ver Discusión).

1. La tarde antes del experimento, se establecieron parejas de apareamiento de hembras F0 conocidas por producir embriones maternos crujientes cruzados a machos de tipo salvaje. Mantenga a los machos de tipo salvaje físicamente separados de las hembras usando un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra en el inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, retire la partición física o coloque tanto los machos como las hembras dentro del inserto de puesta de huevos para iniciar el apareamiento. A la primera señal de puesta de huevos, interrumpa la reproducción separando al macho y a las hembras F0. Mantenga cada hembra F0 separada en cajas de apareamiento individuales.
3. Preparar una solución de esperma tratada con UV utilizando testículos de un macho de tipo salvaje por cada 100 μL de solución de Hank (Tabla 2), suficiente para fertilizar óvulos extruidos de una hembra, como se describió anteriormente³¹.
4. Extruir manualmente óvulos maduros de las hembras F0 preseleccionadas y realizar fertilización in vitro (FIV) utilizando el esperma tratado con UV³¹.
5. Después de la fertilización in vitro , permita que los embriones haploides se desarrollen hasta que se observe el fenotipo crujiente materno y coloque esos embriones en una placa de Petri diferente.
6. Una vez que se hayan identificado los embriones haploides maternos crispantes, permítales desarrollarse durante al menos 6 h después de la fertilización.
7. Para extraer el ADN genómico de al menos diez embriones haploides maternos crispantes, coloque un solo embrión haploide en un pocillo individual de un tubo de tira de PCR, elimine el exceso de medios E3 del pocillo y agregue 50 μL de NaOH a 50 mM.
8. Incubar los embriones a 95 °C durante 20 min. A continuación, enfriar las muestras hasta 4 °C, añadir 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) y vórtice durante 5-10 s. El ADN extraído puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
9. Para identificar qué sitios guía contienen INDEL, diseñe cebadores de secuenciación para amplificar un fragmento de ADN que incluya los cuatro sitios objetivo de CRISPR-Cas9. Estos cebadores de secuenciación permiten la identificación de INDEL que abarcan múltiples sitios de guía.
10. Configure dos reacciones de PCR de 25 μL por embrión utilizando 5 μL del ADN genómico preparado y los cebadores de secuenciación.
11. Una vez finalizada la PCR, purifique y concentre las dos muestras utilizando un kit concentrador y de limpieza de ADN (consulte la Tabla de materiales). Luego envíe el fragmento de ADN a la secuenciación de Sanger utilizando los cebadores de secuenciación directa e inversa.
12. Después de secuenciar el fragmento de crispante materno haploide, alinéelo a la secuencia de tipo salvaje e identifique los INDEL en los sitios objetivo utilizando un programa de alineación de secuencias.

Resultados

El enfoque experimental descrito en este protocolo permite la identificación de fenotipos de efecto materno de una manera rápida y eficiente en el uso de los recursos (Figura 1).

Generación de crispantes maternos:
Al diseñar los cuatro ARN guía para dirigirse a un solo gen candidato de efecto materno, se debe prestar especial atención a dónde se unirán los ARN guía al ADN. En general, todos deben agruparse con regiones mínimas o nulas superpues...

Discusión

El protocolo presentado en este manuscrito permite la identificación y caracterización molecular primaria de un fenotipo de efecto materno en una sola generación en lugar de las múltiples generaciones requeridas para las técnicas genéticas directas e inversas. Actualmente, se desconoce el papel de muchos genes expresados por la madre. Esta falta de conocimiento se debe en parte a la generación adicional requerida para visualizar un fenotipo al identificar genes de efecto materno. En el pasado, la rápida identificación de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	Para mezcla de PCR
1,5 mL Tubos Eppendorf	Cualquier fabricante
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific		18427013 Síntesis de ARNg Escalera de
100 BP	Cualquier fabricante		Para electroforesis en gel
Etanol 100% libre de ARNasa	Cualquier fabricante
100% ARNasa Etanol libre	Cualquier fabricante
Vaso de precipitados de 100 ml	Cualquier fabricante		para FIV
5 m Actetato de amonio	Thermo Fischer Scientific	encontrado en el kit de transcripción MEGAshortscript T7	Síntesis de ARNg
70% Etanol			Síntesis de ARNg (70 mL de etanol + 30 mL de agua libre de nucleasa)
Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID FHC	INC	27-30-1	para microinyección
Bulk Pharma Bicarbonato de sodio 35 libras	Suministro de arrecife a granel	255	Suministros
de pescado CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Proteína Cas9 con NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Oligonucleótido	constante ADN integrado Tecnologías (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Placa de vidrio de depresión	Thermo Fischer Scientific	13-748B	para
FIV Pinzas de disección	Dumont	SS	para FIV
Tijeras de disección	Fine Science Tools	14091-09	para FIV
Esteroscopio de disección (con fuente de luz transmitida)	Cualquier fabricante		para FIV
ADN Clean & Concentrador -5	Zymo Research	D4014	Síntesis de ARNg
ADN Gel Loading Dye (6x)	Cualquier fabricante		Para electroforesis en gel
EconoTaq ADN polimerasa	Lucigen	30032-1	Para mezcla de PCR
Electroféresis Fuente de alimentación	Cualquier fabricante		Para electroforesis en gel
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf  Femtotips Microloader Puntas para Microinyector Femtojet	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	para Microinyección
Etanol (200 grados, sin nucleasas)	Cualquier fabricante
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	para microinyección
Red de pesca	Cualquier fabricante		Suministros de pescado
Camarón en salmuera congelado Camarones	salmuera Camarones		Suministros de pescado
General Agarosa de uso múltiple	Cualquier fabricante		Para electroforesis en gel
Oligonucleótido específico de genes	Tecnologías integradas de ADN (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGAGAGAAATAGCAAG
Guantes	Cualquier fabricante
Cubo de hielo	Cualquier fabricante
Sal oceánica instantánea	Cualquier fabricante		Suministros para peces
Invitrogen UltraPure Bromuro de etidio, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Pez
MEGAshortscript T7 Kit de transcripción	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Síntesis de ARNg
Azul de metileno	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	para E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	para PCR mezcla
MgSO2· 7H2O	MiliporeSigma	M2773
Molde de plástico por microinyección	World Precision Instruments		Moldes Z para
microinyección Micromanipulador	Cualquier fabricante		para micropipeteros de microinyección
	Cualquier fabricante
Extractor de micropipetas	Sutter	P-87	para microinyección
Puntas de micropipeta con filtros (todos los tamaños)	Cualquier fabricante Puntas
de micropipeteador sin filtros ( todos los tamaños)	Cualquier fabricante
Microondas	Cualquier fabricante
Aceite mineral	MiliporeSigma	m5904-5ml	para microinyección
MS-222 ( Tricaína-D)	Cualquier fabricante Aprobado		la FDA
Na2 HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Tubos de Microfuga Antiadherentes, sin RNasa, 1,5 mL	Ambion	AM12450	Síntesis de ARNg
Agua libre de nucleasas	Cualquier fabricante
Toalla de papel	Cualquier fabricante
Pipetas de pastro	Cualquier fabricante Cualquier fabricante
Tubos de tiras de PCR	Cualquier fabricante
Placas de Petri de 100 mm de diámetro	Cualquier fabricante
Solución de rojo de fenol	MiliporeSigma	P0290	para microinyección
Pestales de plástico	VWR	47747-358	para FIV
Cuchara de plástico	Cualquier fabricante		Para FIV
Huevos de camarones en salmuera de grado premium	Camarones en salmuera Tinte
	encontrado en el kit de transcripción MEGAshortscript T7	para electroforesis en gel
		21-402-178
Escala	Cualquier Fabricante Sharpie
	Cualquier Fabricante
Espátula	Cualquier fabricante
H2O estéril	Cualquier fabricante		para mezcla de PCR
T4 ADN polimerasa	NEB	M0203	Síntesis de cinta de ARNg
	fabricante
TBE (Tris-Borato-EDTA) 10x	Cualquier fabricante		Para electroforesis en gel
Tinte de té	Amazon	IMU-71133W	Suministros para peces
Peine de 12 dientes Thermo Scientific Owl, 1,0/1,5 mm de grosor, doble cara para B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	para electroforesis en gel
Thermo Scientific  Owl EasyCast B2 Mini Sistemas de electroforesis en gel	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	Para electroforesis en gel
Termociclador	Cualquier fabricante
Termociclador	Cualquier fabricante
Transiluminador	Cualquier fabricante
Lámpara UV	UVP	Modelo XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	Para FIV
Gafas de seguridad UV	Cualquier fabricante		para
FIV Wash Bottle Thermo	Fischer Scientific	S39015	Suministros
para peces Cajas de apareamiento para peces	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Suministros para peces
1,5 ml Tubos Eppendorf Fisher	Scientific	05-402-11
10 dNTPs molares	Thermo
escalera de 100 BP	Thermo Fischer Scientific	15628019
etanol 100% libre de ARNasa	cualquier fabricante
5m Accetato de amonio	Thermo Fischer Scientific
70% Etanol			70ml de etanol y 30 ml de agua libre de nucleasa
Accesorios para Caja de Gel Horizontal	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarosa	cualquier fabricante
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihidratado	Sigma	10035-04-8	E3
Tubo capilar	Cole-Parmer	UX-03010-68	para agujas de inyección
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Ordenador	cualquier fabricante
Diseccionando Forcepts cualquier	fabricante
Microscopio de disección	cualquier fabricante
Tijeras de disección	cualquier fabricante
ADN Clean & Concentrador -5	Zymo Research	D4014
Colorante de carga de gel de ADN (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq ADN polimerasa	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetasTips	Fischer Scientific 10289651		20 microlitros
Etanol (200 grados, sin nucleasas)	cualquier fabricante
Bromuro de etidio	Thermo Fischer Scientific	15585011
Red de pesca	cualquier fabricante		Malla fina
Camarones en salmuera congelados	LiveAquaria	CD-12018	alimento para peces
Peine de gel (0,625 mm)	cualquier fabricante
Sistema de electroféresis en gel	cualquier fabricante
de oligonucleótidos específicos de	(IDT)
Aguja capilar de vidrio	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Pagado :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds
Platos de vidrio de	cualquier fabricante
Guantes	cualquier fabricante
La solución			de Hank Combine 9,9 ml de premezcla de Hank's con 0,1 ml de HS Stock #6
La premezcla			combina lo siguiente en orden: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Guarde todas las solas HS en 4C
Solución de Hanks Solución
			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Solución Madre de Hank #1			8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl en 100 ml ddH2O
Solución Madre de Hank #2			0,358 g Na2HPO4 anhidro; 0,60 g K2H2PO4 en 100 ml ddH2O
Solución Madre de Hank #4			0,72 g de CaCl2 en 50 ml ddH2O
Solución Madre de Hank #5			1,23 g MgSO47H2O en 50 ml ddH20
Solución Madre de Hank #6			0,35 g de NaHCO3 en 10,0 ml ddH20; hacer fresco día de uso
HCl	Sigma	7647-01-0
Cubitera	cualquier fabricante
Instant Ocean Salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure&comercio; Agua destilada libre de DNasa/RNasa	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medio
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Pez
Mega Short Script T7 Kit de transcripción	Thermo Fischer Scientific	AM1354
azul de metileno	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medio
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulador
Molde de plástico de microinyección	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinyector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) con puntas	cualquier fabricante		necesita puntas p10 filtradas
Micropipeta (20-200) con puntas	cualquier fabricante
Micropipeteador (100-1000) con puntas	cualquier fabricante
Portaobjetos
Microondas	cualquier fabricante
MiliQ Water	cualquier fabricante
aceite mineral	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
espátula estrecha	cualquier fabricante
Tirador de agujas	Sutter	P-97
Toalla de papel	cualquier fabricante
Pipetas Pastro Fisher	Scientific	13-678-20A
Sitio de guía de flanqueo de cebador de PCR	Integrated DNA Technologies (IDT)
Guía de flanqueo de cebadores de PCR Sitio de corte de ARN	Integrated DNA Technologies (IDT)		Desalado estándar
Tubos de tiras de PCR	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Placas de Petri Fisher	Scientific	FB0875714	10 cm de diámetro 100mm x 15mm
Rojo Fenol	Fisher Science	S25464
https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 Puntas de pipeta	Cualquier fabricante		Puntas de 10ul, 200ul y 1000ul
Plagas de plástico	Fisher Scientific	12-141-364
Cuchara de plástico	cualquier fabricante
Guía de cebador Sitio	Tecnologías de ADN integradas (IDT)
Hoja de afeitar	Uline	H-595B
Gel de ARN Colorante de carga	en kit de script megacorto (kit de transcripción in vitro)
ARNasa lejos	Fisher	21-402-178
Tubos de microcentrífuga de polipropileno sin ARNasa	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
Agua libre de ARNasa	Fisher Scientific	10-977-023
Escala	cualquier fabricante
Sharpie	cualquier fabricante
Bicarbonato de sodio (célula cultivo probado)	Sigma	S5761	agua de pescado
Bromuro de sodio Solotion	Sigma	E1510
Software para espectrofotómetro
			Sterlie
H2O	cualquier marca
T4 ADN polimerasa	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Cinta	cualquier marca
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	disponible en la mayoría de las tiendas de cocina
Termociclador
Pipeta de transferencia	Uline	S-24320
Transiluminador
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
Lámpara UV	UVP
	cualquier fabricante
Botella de lavado	fisher scientific	S39015
Cajas de apareamiento de pez cebra	cualquier fabricante
Receta	de tampón PCRAñadir 171,12mL estéril H20; 0,393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0,262 mL de gelatina al 1%. Esterilizar en autoclave durante 20 minutos y luego enfriar el solo con hielo. A continuación, agregue 3.468 mL 100 mg / mL BSA; 0,262 mL dATP (100 mM), 0,262 mL dCTP (100 mM); 0,262 mL dGTP (100 mM);   0,262 mL dTTP (100 ml). Aliquote en tubos eppendorf estériles