Artículo de método

Ensayo de extremidades recombinantes de pollo para comprender la morfogénesis, los patrones y los primeros pasos en la diferenciación celular

DOI:

10.3791/63183

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12 de enero de 2022

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1Departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Anatomía y Biología Celular and IDIVAL, Facultad de Medicina, Universidad de Cantabria

En este artículo

Resumen

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Las extremidades recombinantes son un potente modelo experimental que permite estudiar el proceso de diferenciación celular y la generación de patrones bajo la influencia de señales embrionarias. Este protocolo presenta un método detallado para generar extremidades recombinantes con células mesodérmicas de extremidades de pollo, adaptables a otros tipos de células obtenidas de diferentes organismos.

Resumen

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La diferenciación celular es el proceso afinado del compromiso celular que conduce a la formación de diferentes tipos de células especializadas durante el establecimiento de tejidos y órganos en desarrollo. Este proceso se mantiene activamente en la edad adulta. La diferenciación celular es un proceso continuo durante el desarrollo y la homeostasis de los órganos. Comprender los primeros pasos de la diferenciación celular es fundamental para conocer otros procesos complejos como la morfogénesis. Por lo tanto, las extremidades de pollo recombinantes son un modelo experimental que permite el estudio de la diferenciación celular y la generación de patrones bajo señales de patrones embrionarios. Este modelo experimental imita un entorno in vivo ; ensambla células reagregadas en una cubierta ectodérmica obtenida de una yema de extremidad temprana. Posteriormente, los ectodermos se transfieren e implantan en un receptor embrionario de pollito para permitir su desarrollo. Este ensayo se utilizó principalmente para evaluar las células de las yemas de las extremidades mesodérmicas; sin embargo, se puede aplicar a otras células madre o progenitoras de otros organismos.

Introducción

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La extremidad de los vertebrados es un modelo formidable para estudiar la diferenciación celular, la proliferación celular, la muerte celular, la formación de patrones y la morfogénesis 1,2. Durante el desarrollo, las extremidades emergen como protuberancias de las células derivadas del mesodermo de la placa lateral1. Las yemas de las extremidades consisten en un núcleo central de células mesodérmicas cubiertas por un ectodermo. De esta estructura temprana, emerge una extremidad completa y bien formada. Después de que surge la yema de la extremidad, se reconocen tres ejes: (1) el eje pr....

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Protocolo

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Esta investigación fue revisada y aprobada por la Junta de Revisión Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Ciudad de México, México). En la figura 1A se muestra un diagrama de flujo esquemático de los pasos generales de este protocolo.

1. Incubación embrionaria y determinación de viabilidad

  1. Incubar huevos de gallina fertilizados a 38 °C y 60% de humedad relativa durante aproximadamente tres días y medio hasta que alcancen la etapa de 22 HH (según Hamilton y Hamburger, 19....

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Resultados

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Reconocer una extremidad recombinante bien realizada
Después del injerto, los embriones manipulados fueron devueltos a la incubadora para permitir que el RL se desarrollara. El tiempo de incubación se correlacionó con los requisitos del experimento. Sin embargo, el RL se puede distinguir fácilmente después de 12 h de implantación. Para determinar si la implantación fue adecuada, se observó el RL como una protuberancia que estaba firmemente unida a la pared mesodérmica del embrión donante (

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Discusión

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En general, el protocolo RL se puede dividir en cinco pasos: (1) incubación de embriones, (2) obtención de células mesodérmicas de extremidades para llenar los ectodermos, (3) obtención de ectodermos, (4) ensamblaje de células mesodérmicas dentro de las cubiertas ectodérmicas y (5) trasplante de los ectodermos llenos en los embriones huésped. La principal limitación de la técnica RL es el protocolo largo y detallado, que tiene muchos puntos críticos que requieren paciencia para funcionar adecuadamente. Para completar con.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Estefanía Garay-Pacheco por las imágenes de la Figura 2 y a María Valeria Chimal-Montes de Oca por las obras de arte. Este trabajo fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvención IN211117 e IN213314] y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [número de subvención 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] otorgado a JC-M. JC M-L recibió una beca postdoctoral del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alcian Blue 8GXSigmaA5268
Cuchillo de corte en ánguloAlcon2.75mm DB
Pinzas romasFine Science Tools11052-10
Colagenasa tipo IVGibco1704-019
DMEM-HGSigmaD5796
Incubadora de huevosIncumatic de MexicoIncumatic 1000
Suero fetal bovinoGibco16000069
Pinzas quirúrgicas finasFine Science Tools9115-10
Hanks Solución salina equilibradaSigmaH6648
MicrocentrífugaEppendorf5417R
MicropipetaNANA Alambre
de paladioGoodFellow7440 05-3
Placa de PetriNido705001
PippettecrmglobePF1016
Microscopio estereoscópicoZeissStemi DV4
CintaNA
NA Tripsina porcinaMerck9002 07-7
Aguja de tungstenoGoodFellowE74-15096/01

Referencias

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  1. Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
  2. Mahmood, R., et al.

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Etiquetas

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