Ensayo de extremidades recombinantes de pollo para comprender la morfogénesis, los patrones y los primeros pasos en la diferenciación celular

La extremidad de los vertebrados es un modelo formidable para estudiar la diferenciación celular, la proliferación celular, la muerte celular, la formación de patrones y la morfogénesis ^1,2. Durante el desarrollo, las extremidades emergen como protuberancias de las células derivadas del mesodermo de la placa lateral¹. Las yemas de las extremidades consisten en un núcleo central de células mesodérmicas cubiertas por un ectodermo. De esta estructura temprana, emerge una extremidad completa y bien formada. Después de que surge la yema de la extremidad, se reconocen tres ejes: (1) el eje proximo-distal ([PD] hombro a dedos), (2) el eje dorso-ventral ([DV] desde el dorso de la mano hasta la palma de la mano) y (3) el anterior-posterior ([AP] pulgar a dedo). El eje proximal-distal depende de la cresta ectodérmica apical (AER), ectodermo especializado ubicado en la punta distal de la yema de la extremidad. El REA es necesario para el crecimiento, el mantenimiento de la supervivencia, la proliferación y el estado indiferenciado de las células que reciben señales ^2,3. Por otro lado, la zona de actividad polarizante (ZPA) controla el patrón anteroposterior⁴, mientras que el dorsal y el ectodermo controlan el patrón dorsoventral ^7,8. La integración de patrones tridimensionales implica una diafonía compleja entre estos tres ejes⁵. A pesar de comprender la vía molecular durante el desarrollo de las extremidades, las preguntas abiertas sobre los mecanismos que controlan el patrón y el crecimiento adecuado para formar una extremidad completa permanecen sin respuesta.

Edgar Zwilling desarrolló el sistema de extremidades recombinantes (RL) en 1964 para estudiar las interacciones entre las células mesenquimales de las extremidades y el ectodermo en las extremidades en desarrollo⁶. El sistema RL ensambla el mesodermo de la yema de la extremidad disociada-reagregada en el ectodermo de la extremidad embrionaria para injertarlo en la parte dorsal de un embrión de pollito donante. Las señales proporcionadas por el ectodermo inducen la expresión de genes de diferenciación y genes de patrones de manera espacio-temporal, induciendo así la formación de una estructura similar a una extremidad que puede recapitular los programas celulares que ocurren durante el desarrollo de las extremidades ^7,8,9.

El modelo RL es valioso para comprender las propiedades de los componentes de las extremidades y la interacción entre las células mesodérmicas y ectodérmicas⁶. Un RL se puede definir como una estructura similar a una extremidad creada por el ensamblaje experimental o recombinación de células mesodérmicas de la yema de la extremidad dentro de una cubierta ectodérmica⁶. La morfogénesis de la RL depende de las características de las células mesodérmicas (u otros tipos) que responderán a las señales de patrones ectodérmicos. Una de las ventajas de este sistema experimental es su versatilidad. Esta característica permite la creación de múltiples combinaciones variando la fuente de células mesodérmicas, como células de diferentes etapas de desarrollo, de diferentes posiciones a lo largo de la extremidad, o células enteras (no disociadas) o reagregadas 7,8,9,10. Otro ejemplo es la capacidad de obtener el ectodermo embrionario de especies distintas del pollo, por ejemplo, tortuga¹¹, codorniz o ratón¹².

En este sentido, la técnica RL ayuda a estudiar el desarrollo de las extremidades y las interacciones entre las células mesenquimales y ectodérmicas de las extremidades desde un punto de vista evolutivo. Esta técnica también tiene un gran potencial para analizar la capacidad de diferentes fuentes de células progenitoras para diferenciarse en una estructura similar a una extremidad aprovechando las señales proporcionadas por el ectodermo embrionario 12,13,14. A diferencia de los cultivos in vitro, el RL permite evaluar la diferenciación y el potencial morfogenético de una población celular mediante la interpretación de las señales embrionarias de una extremidad en desarrollo ^9,15.

En este protocolo, se proporciona una guía paso a paso para realizar RL exitosa con células de brotes de extremidades mesodérmicas reagregadas, abriendo así la posibilidad de adaptar este protocolo con diferentes fuentes de células reagregadas o incluso diferentes fuentes de ectodermo.

Esta investigación fue revisada y aprobada por la Junta de Revisión Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Ciudad de México, México). En la figura 1A se muestra un diagrama de flujo esquemático de los pasos generales de este protocolo.

1. Incubación embrionaria y determinación de viabilidad

1. Incubar huevos de gallina fertilizados a 38 °C y 60% de humedad relativa durante aproximadamente tres días y medio hasta que alcancen la etapa de 22 HH (según Hamilton y Hamburger, 1951)¹⁶.
   NOTA: Los huevos de gallina recién fertilizados se pueden almacenar a 15 ° C durante un máximo de una semana.
   1. Para incubar los huevos fertilizados, coloque los huevos verticalmente con el lado puntiagudo hacia abajo en la incubadora humidificada. Gire los huevos durante la incubación, ya que es necesario para evitar que el embrión en desarrollo se adhiera a la membrana de la cáscara.
      NOTA: Los huevos de gallina fertilizados se pueden obtener de granjas locales. Los huevos de gallina fertilizados de White Leghorn generalmente se usan para evitar la pigmentación de las plumas en embriones tardíos. Considere incubar suficientes óvulos por separado para obtener tres estructuras: (1) células mesodérmicas de extremidades, (2) ectodermos de extremidades y (3) embriones de donantes para injertar el RL.
2. Después de tres días y medio de incubación, retire los huevos de la incubadora, hisopo con etanol al 70% y deje que se sequen al aire.
3. Identifique los embriones en desarrollo que candling el óvulo para observar los vasos sanguíneos y localizar el embrión. Deseche los óvulos que no tengan un embrión.
   NOTA: En este punto, distribuya los óvulos para obtener células mesodérmicas, ectodermos y los huéspedes para el RL.

2. Obtención de células mesodérmicas de las extremidades para llenar los ectodermos

NOTA: Antes de iniciar las manipulaciones, es muy recomendable desinfectar el área de trabajo, los microscopios y todo el instrumental mediante hisopado con solución de etanol al 70%.

1. Toque el extremo romo de la cáscara del huevo con el extremo de un fórceps romo para abrir una ventana y retire aproximadamente 1 cm x 1 cm de la cáscara con las pinzas.
2. Transfiera los huevos a un soporte de plástico o cartón y colóquelos uno por uno debajo del estereomicroscopio. Identifique la membrana de aire y luego retírela eligiendo un pequeño orificio donde no se encuentren vasos. Tire de esta área con la ayuda de fórceps quirúrgicos finos.
   NOTA: La membrana de aire se puede identificar como la membrana blanca y opaca observada inmediatamente después de la ventana del huevo.
   1. Retire cualquier pequeño trozo de cáscara de huevo que pueda entrar en contacto con el embrión.
      NOTA: Verifique que los embriones estén en la etapa de 22 HH antes de iniciar el protocolo. Los embriones en etapas anteriores se pueden devolver a la incubadora después de sellar la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva.
3. Abra el saco amniótico completamente abriendo el amnios con las pinzas quirúrgicas finas (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Amnion se puede identificar como una membrana transparente que cubre estrechamente el embrión y está llena de líquido amniótico.
4. Retire cuidadosamente el embrión del óvulo con un par de fórceps contundentes y luego transfiéralo a una placa de Petri estéril que contenga solución salina tamponada con fosfato helado (1x PBS). Repita este paso para los huevos restantes. Considere que solo ~ 8-10 embriones son suficientes para obtener las células mesodérmicas.
5. Lave los embriones una vez en 1x PBS helado, y con la ayuda de un estereomicroscopio (ver Tabla de materiales), retire las membranas restantes. Localiza las yemas de las extremidades posteriores.
   NOTA: Las yemas de las extremidades son estructuras redondeadas situadas a lo largo del eje anterior-posterior del embrión como protuberancias del flanco. Las extremidades posteriores se encuentran más posteriormente que las extremidades anteriores.
6. Mantenga los embriones en 1x PBS limpio, y usando un par de pinzas quirúrgicas finas, corte cada brote de la extremidad posterior longitudinalmente. Corta la yema muy cerca del flanco del embrión para diseccionar todas las yemas de las extremidades posteriores. Repita este paso con los embriones restantes.
7. Use una pipeta de transferencia de plástico para transferir los brotes de las extremidades a un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 ml.
8. Use una punta de pipeta para eliminar cualquier exceso de 1x PBS y reemplace PBS con 500 μL de solución de tripsina al 0.5% (consulte la Tabla de materiales). Incubar las yemas de las extremidades en un termobloqueo durante 7 min a 37 °C.
9. Retire la solución de tripsina y reemplácela con 500 μL de colagenasa tipo IV a 2 mg/ml en Hanks Balanced Salt Solution (ver Tabla de materiales), luego incube en un termobloque a 37 °C durante 8 min.
   NOTA: La incubación de tripsina separa ligeramente los ectodermos, mientras que la colagenasa desagrega las células mesodérmicas.
10. Después de la incubación, retire la mayor cantidad de colagenasa posible y reemplácela con 1 ml de medio de glucosa media-alta (DMEM-HG) de Dulbecco modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% para inactivar las enzimas. Pipetear la mezcla suavemente ~ 10 veces.
11. Filtrar la suspensión que contiene las células con un colador celular de 70 μm para dejar atrás los ectodermos.
    NOTA: La filtración también eliminará cualquier brote de extremidades no digeridos, dejando atrás una suspensión de células individuales.
12. Después de filtrar, pipetee la suspensión nuevamente 5-10 veces y centrífique a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente, luego deseche el sobrenadante.
13. Use 1 ml de DMEM-HG suplementado con 10% fbS para lavar el exceso de colagenasa. Centrifugar la suspensión a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
14. Deseche el medio cuidadosamente mediante pipeteo y luego reemplácelo con 1 ml de DMEM-HG fresco suplementado con 10% de FBS sin alterar las células en la parte inferior del tubo.
15. Deje que las células formen un gránulo compacto (reagregarlo) después de incubarlas durante 1-1.5 h a 37 ° C en un termobloqueo.
    NOTA: Mientras las células mesodérmicas van formando el pellet, es conveniente obtener los ectodermos de las extremidades.

3. Obtención de los ectodermos de las extremidades

1. Repita los pasos 1-6 de la sección 2 por separado con los otros 22 embriones de pollo HH elegidos para obtener los ectodermos.
   NOTA: El número de embriones para este propósito es proporcional al número final del RL deseado. Una proporción de 2:1 ectodermos-RL es apropiada.
2. Después de obtener los cogollos de las extremidades posteriores, use una pipeta de plástico para transferirlos a un tubo de microcentrífuga vacío. Retire cualquier exceso de 1x PBS y reemplácelo con 500 μL de tripsina al 0.5% en 1x PBS estéril. Incubar la mezcla durante 30 min a 37 °C en un termobloqueo.
3. Después de la digestión enzimática, transfiera la solución de tripsina que contiene los brotes de las extremidades a una placa de Petri estéril.
4. Retire el exceso de tripsina tanto como sea posible usando una micropipeta; inunde la placa de Petri con 1x PBS helado suplementado con 10% de FBS hasta que todos los brotes de las extremidades estén cubiertos.
   NOTA: FBS puede ser sustituido por suero de caballo.
5. Identificar las yemas de las extremidades debajo del estereomicroscopio; identificar el ectodermo como una membrana transparente ligeramente separada de las células mesodérmicas de las extremidades (Figura 1B).
6. Sostenga el extremo más proximal de la yema de la extremidad con la ayuda de fórceps quirúrgicos finos mientras separa cuidadosamente y separa la capa del ectodermo con las otras pinzas.
   NOTA: La obtención de los ectodermos podría ser difícil debido a la aglomeración de células mesodérmicas y la unión a los ectodermos, lo que hace que se vuelvan pegajosos. Se recomienda desechar constantemente las células mesodérmicas para mantener solo los ectodermos en la placa de Petri.
7. Mantenga los ectodermos en solución 1x PBS-10% FBS helada.
   NOTA: Los ectodermos se pueden almacenar a 4 °C en caso de que el mesodermo reagregado no esté listo. Sin embargo, es preferible coordinar el tiempo de incubación del pellet con la obtención ectodérmica.

4. Ensamblaje de células mesodérmicas dentro de la cubierta ectodérmica

NOTA: Para esto, es necesario tener los ectodermos vacíos en una placa de Petri con una solución estéril de 1x PBS-10% FBS que contenga un pellet formado de células mesodérmicas.

1. Después de formar el gránulo (ver sección 2), deseche ~600 μL del medio del tubo mediante pipeteo.
2. Separe cuidadosamente el pellet de la parte inferior con una punta de pipeta y sin romperlo o destruirlo.
3. Cuando el pellet esté completamente separado de la parte inferior del tubo, gire el tubo boca abajo para transferir el pellet a la placa de Petri que contiene los ectodermos vacíos (Figura 1C).
4. Corte un pequeño trozo del pellet con la ayuda de un par de pinzas quirúrgicas finas y colóquelo lo más cerca posible del ectodermo.
5. Como si de una bolsa se tratara, abre el ectodermo con las pinzas quirúrgicas, y coloca el trozo de pellet lo más apretado posible en la cubierta ectodérmica. Repita este paso para tantos RR como desee (Figura 1D).
   NOTA: Corte las piezas del pellet una por una y llene los ectodermos para mantener limpia la solución 1x PBS-10% FBS. El tamaño del pellet debe corresponder a cada ectodermo.
6. Permita que el ectodermo y el mesodermo sanen juntos durante ~ 30 minutos a temperatura ambiente y luego injertarlos en el huésped embrionario. Deseche el ectodermo y el mesodermo no utilizados.

5. Trasplante del ectodermo lleno en un embrión huésped
 

NOTA: Antes de trasplantar los ectodermos, coloque dos estereomicroscopios uno al lado del otro en un banco, uno para la manipulación embrionaria y el injerto de RL. El otro es para mantener los ectodermos llenos listos para transferir al embrión.

1. Seleccione el número de óvulos deseados para injertar los ectodermos llenos.
2. Usando el extremo de un fórceps romo, toque la cáscara de huevo de los 22 embriones huéspedes de HH para abrir una ventana. Identifique la membrana de aire y, utilizando un par de pinzas quirúrgicas finas, retírela por completo.
3. Abra el saco amniótico cerca de la extremidad anterior para exponer el flanco derecho del embrión. Abra solo la cantidad necesaria para realizar el procedimiento.
4. Guiado por la posición de la extremidad anterior, realice el rascado de la herida con una aguja de tungsteno (ver Tabla de Materiales) a la longitud de 2-3 somitas, dañando ligeramente el mesodermo hasta que sangre.
5. Transfiera individualmente un ectodermo lleno (RL) al embrión de pollito y coloque la base de la extremidad recombinante sobre la herida de somita.
   NOTA: La transferencia de RL se puede hacer con una pipeta de plástico o con un cuchillo de hendidura en ángulo.
6. Fije el RL correctamente con dos piezas de alambre de paladio de 0,025 mm de diámetro y 0,5-1 mm de longitud (ver Tabla de Materiales). Alinee la base del RL con la herida para asegurar que se unirá al flanco del embrión huésped y se vascularizará (Figura 1E).
7. Selle la ventana con cinta adhesiva y devuelva el huevo a la incubadora. Recoger los embriones en los puntos de tiempo deseados para el análisis.

Reconocer una extremidad recombinante bien realizada
Después del injerto, los embriones manipulados fueron devueltos a la incubadora para permitir que el RL se desarrollara. El tiempo de incubación se correlacionó con los requisitos del experimento. Sin embargo, el RL se puede distinguir fácilmente después de 12 h de implantación. Para determinar si la implantación fue adecuada, se observó el RL como una protuberancia que estaba firmemente unida a la pared mesodérmica del embrión donante (Figura 2A). Por el contrario, ya sea que la viabilidad celular y/o el injerto fallaran, el RL se desprendió de la pared mesodérmica o presentó una morfología rugosa (Figura 2B).

Examen morfológico y de patrones de extremidades recombinantes
Para el examen morfológico, RL se tiñó con azul alciano17 para observar la formación de elementos esqueléticos y su patrón. Se recomienda teñir todo el tronco del embrión donante para evitar perder el RL durante el procedimiento (Figura 3A). Alternativamente, antes de despejar el RL, se obtuvieron imágenes en solución de etanol para observar la morfología del RL o realizar mediciones cuantitativas (Figura 3B). El RL teñido o no teñido se cortó para observar la estructura del tejido o identificar el tipo de célula (Figura 3C).

Figura 1: Representación esquemática del diseño experimental de extremidades recombinantes (RL). (A) La RL se realizó mediante el ensamblaje del mesodermo de la yema de la extremidad a partir de un embrión de pollito de 22 HH donante dentro de una cubierta ectodérmica obtenida de otro donante de embriones de pollitos de 22 HH. Los ectodermos estaban fuertemente rellenos de células mesodérmicas. Después del ensamblaje, los ectodermos rellenos se transfirieron y se fijaron con alambres de paladio sobre la herida de un somita anterior. (B) Un brote de extremidad con su ectodermo desprendido después del tratamiento con tripsina. (C) El pellet se obtuvo después de su formación cerca de los ectodermos vacíos, listo para ser llenado. (D) Se muestra una cubierta ectodérmica llena de células mesodérmicas. (E) Fijación del RL en el embrión huésped con alambres de paladio. Tenga en cuenta que el RL se colocó en el flanco derecho del embrión cerca de la yema de la extremidad anterior; p: pellet. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Extremidades recombinantes pollo-pollo recién obtenidas. (A) Se muestra un RL de 24 h unido a la pared del mesodermo. (B) Se muestra un RL de 24 h sin éxito. Tenga en cuenta que el alambre de paladio no está fijando el RL; en consecuencia, el RL se desprendió de la pared mesodérmica y presentó una morfología rugosa. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis morfológico de extremidades recombinantes. (A) Tinción azul alciana para demostrar elementos esqueléticos en un RL pollo-pollo de 6 días. (B) El mismo RL se mostró en (A) antes de limpiar el azul alciano. (C) Rebanada sagital de un RL teñido con tinción azul alciano y con hematoxilina y eosina. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.