Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Summary

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Abstract

La metástasis es un proceso complejo que requiere que las células superen barreras que solo se modelan de manera incompleta mediante ensayos in vitro . Se estableció un flujo de trabajo sistemático utilizando modelos in vivo robustos y reproducibles y métodos estandarizados para identificar nuevos actores en la metástasis del melanoma. Este enfoque permite la inferencia de datos en etapas experimentales específicas para caracterizar con precisión el papel de un gen en la metástasis. Los modelos se establecen mediante la introducción de células de melanoma modificadas genéticamente a través de inyecciones intracardíacas, intradérmicas o subcutáneas en ratones, seguidas de monitoreo con imágenes seriales in vivo . Una vez que se alcanzan los criterios de valoración preestablecidos, los tumores primarios y / o los órganos portadores de metástasis se extraen y procesan para diversos análisis. Las células tumorales se pueden clasificar y someter a cualquiera de varias plataformas "ómicas", incluida la secuenciación de ARN unicelular. Los órganos se someten a análisis de imagen e inmunohistopatológicos para cuantificar la carga general de metástasis y mapear su ubicación anatómica específica. Esta tubería optimizada, que incluye protocolos estandarizados para el injerto, monitoreo, recolección de tejidos, procesamiento y análisis, se puede adoptar para cultivos a corto plazo derivados de pacientes y líneas celulares humanas y murinas establecidas de varios tipos de cáncer sólido.

Introduction

La alta mortalidad asociada con el melanoma metastásico combinada con una incidencia creciente de melanoma en todo el mundo¹ (un aumento estimado del 7,86% para 2025) requiere nuevos enfoques de tratamiento. Los avances en el descubrimiento de objetivos dependen de modelos reproducibles de metástasis, un proceso altamente complejo. A lo largo de los pasos de la cascada metastásica, las células de melanoma deben superar innumerables barreras para lograr la evasión del sistema inmune y la colonización de tejidos distantes². La resiliencia y adaptabilidad de las células de melanoma surgen de multitud de factores, entre ello....

Protocol

NOTA: Los procedimientos de animales involucrados en el siguiente protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nueva York (IACUC). Todos los procedimientos se llevan a cabo en instalaciones aprobadas por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). La Figura 1 muestra el enfoque experimental general.

1. Cultivos a corto plazo de melanoma derivado del paciente (STC)

1. Coloque el tejido en una placa de Petri de 60 mm con 1 ml de RPMI completo (RPMI 1640 suplementado con suero b....

Results

Las siguientes figuras ilustran cómo se ha aplicado el flujo de trabajo descrito para la identificación de nuevos impulsores de la metástasis del melanoma. La Figura 2 resume los resultados de un estudio publicado en el que se estudiaron los efectos del silenciamiento de la fucosiltransferasa FUT8 en metástasis de melanoma in vivo ²⁶. Brevemente, el análisis de los datos glucómicos del paciente humano (obtenidos por matrices de lectinas) y el perfil transcrip.......

Discussion

El objetivo de este informe técnico es ofrecer un flujo de trabajo estandarizado de arriba a abajo para la investigación de actores potenciales en la metástasis del melanoma. Como los experimentos in vivo pueden ser costosos y llevar mucho tiempo, las estrategias para maximizar la eficiencia y aumentar el valor de la información obtenida son primordiales.

Es imperativo utilizar enfoques complementarios para validar los hallazgos dentro del mismo experimento. Por ejemplo, tanto la tinc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 Hoja de Scapel	WPI	500242	Para procedimientos quirúrgicos
#3 Mango Scapel WPI 500236			Para procedimientos quirúrgicos
Jeringa de tuberculina de 1 mL, punta deslizante	BD	309626	Injections jeringa de
10 mL, punta deslizante	BD	301029	Perfusión
10% Formalina Sódica Tamponada EK Industries		4499-20L	Para perfusión/fijador tisular
15 mL	Corning cónico	430052	Cultivo celular
15 mL Tubos de centrífuga de polipropileno cónico	Falcon		352196 Cultivo celular
Etanol de 200 pruebas	Deacon Labs	04-355-223	Histología
22G – Aguja de 22 mm	BD	305156	Perfusión
4-0 Sutura de Vicryl	Ethicon	J464G	Sutura
4% de fosfato de Carson tamponado paraformaldehído	EMS	15733-10	Para perfusión/fijador tisular
40µ m	Corning	431750	Procesamiento de tejidos
5-0 Sutura absorbible	Ethicon	6542000	Tapón
50 mL Cónico	Corning	430828	Cultivo celular
50mL Tubos de centrífuga de polipropileno cónico	Falcon	352070	Cultivo celular
7-0 Sutura de seda	FST	18020-70	Ligadura
70µ m	Corning	431751	Procesamiento
de tejidos Medios de montaje antidecoloración	Vector Labs	H-1000-10	Aproximador de inmunofluorescencia
que aplica fórceps, 10 cm	WPI	14189	Para procedimientos microquirúrgicos
Avance	Bruker	3 HD	Consola de RMN
Biospec 7030	Bruker	7030	Micro MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA Tinción
Pinzas de sutura Castroviejo, puntas rectas Plataforma de atado de 5,5 mm, 11 cm	WPI	WP5025501	Para procedimientos microquirúrgicos
Coplin Staining Jar	Bel-Art	F44208-1000	Histología
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Inmunofluorescencia
dCas9-KRAB	Addgene	110820	Manipulación genética
DNasa I	NEB	M0303L	Procesamiento de tejidos
DPBS	Corning	21-030-CM Procesamiento de	tejidos
Cuchilla de un solo filo extra afilada sin recubrimiento GEM		62-0167	Procesamiento de tejidos
Sustrato de matriz extracelular	Corning	354234	considerar el factor de crecimiento reducido ( como alternativa
FBS	Cytiva	SH30910.03	Cultivo celular
Fiji Image J	Fiji Image J	Software	Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugado multimer	Thermo Fisher	A16104	NuMA Tinción Suero
cabra	Gibco	PCN5000	Inmunofluorescencia
HBSS	Corning	21-020-CV	Procesamiento de tejidos
Hematoxilina	Richard-Allan Scientific	7231	Histología
Illumina III	PerkinElmer	CLS136334	BLI Instrument
Jeringa de insulina 28G - aguja de 8 mm	BD	329424	Inyecciones
Jeringa de insulina 31G - aguja de 6 mm	BD	326730	Inyecciones Pinzas de
iris, 10,2 cm, curva completa,	dentadas	WPI 504478	Para perfusión y procedimientos quirúrgicos
Isoflurano USP	Covetrus	11695067772	Anesthesia
Jewelers #7 Pinzas de titanio 11 cm 0,07 x 0,01 mm Punta	WPI	WP6570	Para procedimientos microquirúrgicos
Ketamina HCl 100 mg / mL	Mylan Ind.	1049007	Anestesia
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	Manipulación genética
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectina, DyLight 649	Invitrogen	L32472	Marcador de células endoteliales
vasculares MEM aminoácidos no esenciales X 100	Corning	25-025-CI
Tijeras Metzenbaum	WPI	503269	Para cirugía procedimientos
Unidad de microinyección	KOPF	5000	Inyecciones intracardíacas NaCl
	Fisher	S25877	Tinción NuMA
Aguja 30G x 25mm	BD	305128	Aguja de Inyección Intracardíaca
33G x 15mm	Hamilton	7747-01	Inyección Intracarotídea
Soporte de Aguja, Castroviejo, 14cm, con cerradura, 1.2mm Mordazas dentadas	WPI	14137-G	Para procedimientos microquirúrgicos
NOD. Ratones Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	El Laboratorio Jackson 005557		Ratones NU
/J modelo murino	El Laboratorio Jackson	002019	modelo murino
Aparato mitótico nuclear Proteína policlonal conejo anti-humano	Abcam	97585	NuMA Tinción
de penicilina-estreptomicina 10000U/mL	Gibco	15140122	Cultivo celular
Percoll	GE	0891-01	solución de separación por densidad
PI Guantes Quirúrgicos Clásicos	Cardinal Health	2D72PT75X	Cirugía
pLKO Tet-On	Addgene	21915	Manipulación genética
Povidona-Yodo 10% Solución Medline		MDS093943	Cirugía
Proparacaína Gotas 0.5%	Akorn Pharma	AX0501	Anestésico local oftálmico
Puralube Petrolatum Pomada Oftálmica	Dechra	83592
Cuchilla de afeitar de anestesia Cuchillas de doble filo	EMS	72000	Afeitado y corte de cerebro con vibrótomo
Reflex 9mm EZ Clip	Braintree	EZC-  KIT	Cierre de herida
RPMI 1640	Corning	10-040-CM	Tijeras para cultivo celular
, resorte 10,5 cm Str, 8 mm Cuchillas	WPI	501235	Para procedimientos microquirúrgicos
Cuchilla vibratoria semiautomática Microtomo	Leica	VT1200	Brain Slice Inmunofluorescencia
Anestesia de un solo canal Sistema de vaporizador	Kent Scientific	VetFlo-1210S	anestesia
Smartbox Sistema de cámara de sobremesa y soplador de escape	EZ Systems	TT4000	CO2 Eutanasia
Estéril Fenestrado Paño Desechable	Medline	NON21002	Surgery
Batas quirúrgicas Aurora estériles no reforzadas con fundas de ajuste	Medline	DYNJP2715	Surgery
T25 Flask	Corning	430639	Cultivo celular
Tris	Corning	46-031-CM	Tinción NuMA Triton
X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Pinza de atado Troutman de inmunofluorescencia, 10 cm, patrón G curvado, punta de 0,52 mm con plataforma de atado	WPI	WP505210	Para procedimientos microquirúrgicos
Clips de vasos 10G Presión 5x 0,8 mm Mandíbulas, 5/paquete	WPI	15911	Para procedimientos microquirúrgicos
Visiopharm	Visiopharm	Visiopharm	NuMA Software de cuantificación de tinciones
Xilasina 100mg/mL	Akorn Pharma	59399-111-50	Anestesia
Xileno	Fisher	X3P-1GAL	Histología