Preparación de explantes de un solo somita a partir de embriones de pez cebra

Resumen

Presentamos un protocolo para aislar somitas individuales de embriones de pez cebra, cuya dinámica se puede seguir en cultivo durante varias horas mediante microscopía de fluorescencia time-lapse, proporcionando así una metodología para cuantificar los cambios en la forma de los tejidos a escala de resolución de una sola célula.

Resumen

El eje corporal de los embriones de vertebrados se subdivide periódicamente en unidades multicelulares 3D llamadas somitas. Si bien las oscilaciones genéticas y los prepatrones moleculares determinan la escala de longitud inicial de los somitas, los procesos mecánicos se han implicado en la determinación de su tamaño y forma finales. Para comprender mejor las propiedades materiales intrínsecas de los somitas, se desarrolla un método para cultivar explantes de un solo somita a partir de embriones de pez cebra. Los somitas individuales se aíslan primero eliminando la piel de los embriones, seguido de la extracción de la yema y la escisión secuencial de los tejidos vecinos. Utilizando embriones transgénicos, se puede observar la distribución de varias estructuras subcelulares mediante microscopía fluorescente de lapso de tiempo. La dinámica de los somitas explantados se puede seguir durante varias horas, lo que proporciona un marco experimental para estudiar los cambios en la forma de los tejidos a escala de resolución de una sola célula. Este enfoque permite la manipulación mecánica directa de los somitas, lo que permite la disección de las propiedades del material del tejido. Finalmente, la técnica descrita aquí puede extenderse fácilmente para explantar otros tejidos como la notocorda, la placa neural y el mesodermo de la placa lateral.

Introducción

Gran parte del sistema musculoesquelético adulto de los vertebrados emerge de los somitas embrionarios, que se forman de forma periódica y rítmica a lo largo del eje corporal de los embriones ^1,2. Los somitas son unidades multicelulares tridimensionales (3D) que suelen estar formadas por un núcleo interno de células mesenquimales y una capa epitelial periférica rodeada por una matriz extracelular rica en fibronectina³. La morfología de los somitas, es decir, su tamaño y forma, está determinada en parte por el reloj de segmentación y los prepatrones moleculares posteriores. Sin embargo, en la última década, se ha descubierto que las señales y fuerzas mecánicas también desempeñan un papel en la regulación del reloj de segmentación⁴, además de facilitar la formación de somitas ^5,6,7 y garantizar una mayor precisión de las longitudes de las somitas después de la formación inicial de somitas⁸.

La mecánica de los tejidos puede estudiarse directamente in vivo con la disponibilidad de nuevas herramientas⁹, sin embargo, para obtener una imagen completa que subyace a los procesos físicos, es necesario estudiar simultáneamente las propiedades intrínsecas de los tejidos. El protocolo descrito aquí proporciona un enfoque simple para preparar somitas individuales, cuyas propiedades físicas, desde las escalas celulares hasta las tejidas, se pueden estudiar de forma aislada del embrión. Si bien existen varios protocolos para la preparación de explantes en etapas de desarrollo similares 10,11,12,13,14, hasta donde sabemos, este es el primer protocolo que describe el aislamiento de somitas individuales. El protocolo es fácil de implementar y solo requiere el equipo básico disponible en la mayoría de los laboratorios de pez cebra que trabajan con embriones.

Para ayudar a desentrañar el papel de la mecánica en la formación morfológica de somitas, se desarrolla un método para cultivar explantes de un solo somita a partir de embriones de pez cebra, que se puede utilizar para sondear las propiedades intrínsecas del material de los somitas.

Protocolo

Este protocolo implica el uso de embriones vivos de vertebrados menores de 1 día después de la fertilización. Todos los experimentos se llevaron a cabo utilizando embriones derivados de adultos que se aparean libremente, por lo que están cubiertos por la licencia general de experimentación animal de la EPFL otorgada por el Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires del cantón de Vaud - Suiza (número de autorización VD-H23).

1. Antes de la disección

1. Obtener embriones a partir de un cruce de líneas transgénicas heterocigóticas de interés. Para la explantación de dos o tres somitas, normalmente solo se necesitan unos pocos embriones. En este protocolo, se utilizó un embrión para explantar un somita.
2. Prepare 1 tampón E3 a partir de dos existencias 50x: la culata 1 contiene 0,458 mM Na₂HPO₄, 0,042 mM KH₂PO₄, 4,084 mM NaCl, 0,128 mM KCl y la culata 2 contiene 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄. Prepare 500 mL de 1x Tampón E3 mezclando 480 mL de agua destilada con 10 mL de cada una de las dos existencias 50x.
3. Si se disecciona el mismo día, se deben criar embriones en 25 mL de medio E3 en una placa de Petri a 33 °C hasta la etapa de tres somitas. Si se disecciona a la mañana siguiente, cría los embriones en medio E3 a 28 °C hasta la etapa de escudo antes de transferirlos a 19 °C para la incubación nocturna.
4. Para identificar la etapa de escudo o las diferentes etapas de somita, utilice un microscopio estereoscópico de laboratorio estándar con un rango de aumento ajustable de aproximadamente 0,67x a 4,5x.
5. Reúna las herramientas y los reactivos necesarios para la disección.
   1. Alícuota L-15 de Leibovitz medio en tubos de 50 mL y almacenar en la nevera. Recomendamos utilizar la misma alícuota de la nevera durante un máximo de dos rondas.
   2. Prepare 50 mL de agarosa al 2% en medio L-15 utilizando un agitador magnético y manteniendo la temperatura a 85 °C. Una vez disuelta, almacene la solución a temperatura ambiente.
   3. Prepare 25 mL de agarosa de bajo punto de fusión al 2% en medio L-15 utilizando un agitador magnético y manteniendo la temperatura a 85 °C. Una vez disuelta, alícuota la solución en tubos de 1,5 mL y almacenarla a 4 °C. Esto se utilizará para preparar la cámara de imágenes.
   4. Vierta la agarosa fundida al 2% en una placa de Petri de 20 mm hasta que se llene un tercio de la profundidad de la placa y permita que la solución de agarosa se solidifique. Las disecciones se realizarán en estas placas de Petri. Prepare las placas de Petri con recubrimiento de agarosa con mucha antelación y guárdelas a 4 °C.
   5. Ensamble las siguientes herramientas: pipeta Pasteur para la transferencia de embriones, un par de pinzas para decorionar embriones, un par de pinzas finas para la extracción de la piel de los embriones, un microbisturí para hacer incisiones en los embriones, pipeta de vidrio pulido al fuego para transferir los explantes a la cámara de imágenes.
   6. Esterilice la pipeta de vidrio en etanol al 100% durante 15 minutos y enjuague dos veces pipeteando 5 mL de medio L-15 hacia arriba y hacia abajo.
   7. Prepare una herramienta para pestañas pegando una pestaña o cabello de la ceja a un capilar de vidrio.
6. Utilice un estereoscopio fluorescente con un rango de aumento ajustable de aproximadamente 0,63x a 6,3x y filtros GFP y RFP estándar para clasificar los embriones transgénicos positivos y transferirlos a una placa de Petri separada con medio E3.

2. Preparación del explante de un solo somita

1. Transfiera 2 o 3 embriones a una placa recubierta de agarosa (hecha en el paso 1.5.4) llena de 10 mL de medio L-15. Asegúrese de que la placa, junto con el medio L-15, se precaliente a 28 °C en una incubadora durante 30 minutos antes de transferir los embriones.
2. Decorionar cuidadosamente (Figura 1 A,B) un embrión con un par de pinzas. Sostenga el corion con una de las pinzas y use la segunda pinza para pellizcar y tirar del corion cerca de donde se coloca la primera pinza.
3. Repita este paso una vez más para abrir ampliamente el corion, después de lo cual el embrión puede ser empujado suavemente hacia afuera. Asegúrese de que el embrión no se dañe ni se exprima durante la descorionación.
4. Oriente el embrión en su lado lateral y sujete la piel entre la cabeza y la cola del embrión con una de las pinzas finas. Use la segunda pinza fina para pellizcar la piel cerca de donde todavía está colocada la primera pinza.
5. Aleja las dos pinzas una de la otra, mientras sujetas la piel, creando así una gran abertura. Suelte una de las pinzas de la piel y colóquela cerca de donde se sostiene la segunda pinza y repita el proceso de extracción de la piel hasta que la piel se extraiga en las regiones formadoras de somita.
   NOTA: Es fundamental eliminar completamente la piel que rodea a los somitas que se explantarán, de lo contrario, se vuelve difícil hacer disecciones más finas en los pasos posteriores del protocolo.
6. Use un micro cuchillo para raspar la yema (Figura 1C - explante sin piel y sin jarra la yema) y haga una serie de incisiones de la siguiente manera:
   1. Corte a través del embrión con el primer corte anterior al primer somita morfológico en el embrión y el segundo corte posterior al somita formado más recientemente (Figura 1D). Cortar una vez más por detrás y por delante a los somitas de interés (Figura 1E).
   2. Utilice el microcuchillo para raspar cualquier resto de yema de las regiones explantadas del embrión. Trate de quitar la mayor cantidad posible de yema para reducir la posibilidad de que los explantes se peguen al micro cuchillo. Si esto sucede, use una herramienta para pestañas para mover el explante de regreso a la solución mientras mantiene el micro cuchillo sumergido en el medio.
   3. Coloque el explante dorsalmente y haga un corte a lo largo del eje anteroposterior a través de la notocorda, cerca de los somitas en un lado (Figura 1F, G).
   4. Tome el explante sin la notocorda y corte a través del mesodermo de la placa lateral (LPM) cerca de los somitos.
      NOTA: Este paso se puede intercambiar con el paso anterior, es decir, funciona igualmente bien cortar primero el LPM seguido de cortar la notocorda.
7. Elegir la somita que se va a explantar y hacer dos cortes posteriores y anteriores a la somita respectivamente (Figura 1H).
8. Por último, gira la somita 90° con la herramienta de pestañas para visualizar la placa neuronal que sigue unida al somita. Haga un corte entre el somita y la placa neural, liberando así un solo somita (Figura 1I).
   NOTA: La placa neural también se puede quitar inmediatamente después del paso 2.6.4, es decir, después de quitar la notocorda y el LPM y antes de diseccionar un somita de los somitas vecinos.

3. Obtención de imágenes de explantes de un solo somita

NOTA: Aquí, se describe el procedimiento para obtener imágenes de explantes de somita única utilizando un microscopio de lámina de luz de vista única. Como alternativa, los somitas individuales explantados también pueden ser fotografiados en un microscopio confocal, que está más ampliamente disponible, o incluso en un microscopio de campo amplio si está exclusivamente interesado en seguir la morfología general de los explantes.

1. Prepare una cámara de imágenes de la siguiente manera:
   1. Llene una jeringa de 1 ml con formulación de caucho de silicona. Corte una punta de pipeta de 200 μL a aproximadamente 1 cm de la boca e inserte la jeringa en la punta de la pipeta.
   2. Envuelva manualmente el soporte de membrana con una tira de membrana de etileno propileno fluorado (FEP) precortada (Figura 2A-C) y fije la cámara de imágenes al soporte de membrana, que encajan perfectamente entre sí (Figura 2D).
   3. Agregue la formulación de caucho de silicona a lo largo de la intersección de la cámara y la membrana y séquela durante la noche, lo que permite que la membrana se adhiera a la cámara. Retire el soporte de la membrana 1 h antes del experimento de explante.
   4. Calentar una alícuota que contenga 0,5 mL de agarosa de bajo punto de fusión al 2% hecha con medio L-15 a 75 °C durante 10 min. Agregue 160 μL de agarosa calentada de bajo punto de fusión al centro de la cámara y coloque un molde de imagen en la agarosa (Figura 2E, F) y manténgalo en posición vertical hasta que la agarosa se solidifique.
   5. Agregue otros 160 μL de agarosa caliente de bajo punto de fusión a los dos extremos del molde y transfiera toda la unidad a 4 °C durante 30 min.
   6. Agregue 600 μL de medio L-15 a la cámara y retire el molde de la cámara con una pinza. Espere hasta que la cámara con medio L-15 vuelva a temperatura ambiente.
2. Transfiera la somita explantada con una pipeta de vidrio pulido mediante pipeteo a la cámara de imágenes y use una herramienta de pestañas para colocar el explante en el centro de la cámara.
3. Alinee los láseres de imagen según las instrucciones del fabricante y transfiera con cuidado la cámara de imagen al microscopio equipado con una cámara de incubación para mantener los explantes a 28 °C.
4. Realice una segunda ronda de alineación láser con las regiones de interés de la línea transgénica, seguida de la configuración de la pila z, el intervalo de tiempo y la duración deseados para las imágenes de lapso de tiempo. Para este experimento, adquiera 70 cortes z con un espaciado de 2 μm y un intervalo de fotogramas de 2 min.
5. Realice imágenes de lámina de luz de doble color (Figura 1J) de los explantes con láseres de 561 nm (10% de potencia láser, exposición de 100 ms) y 488 nm (10% de potencia láser, exposición de 100 ms). En este protocolo, la señal se recopiló con un objetivo de 25x/1.1 NA y a través de filtros de paso de banda de 561/25 nm y 525/50-25 respectivamente en una cámara sCMOS.

Resultados

Los explantes permiten cuantificar cambios de forma a gran escala en 3D. Para ilustrar esto, explantamos somita cuatro (N = 3) de embriones tempranos de pez cebra obtenidos de un cruce entre líneas heterocigóticas Utr::mCherry (Tg(actb2:mCherry-Hsa.UTRN); e119Tg) y H2B::GFP (Tg(h2az2a:h2az2a-GFP); kca6Tg). La utrofina es una proteína de unión a actina, y la línea Utr::mCherry muestra la distribución de estructuras filamentosas de actina. Este transgén se utilizó aquí como marcador de los contornos de las células. H2B::GFP es una histona marcada con fluorescencia y, en consecuencia, marca la distribución de la cromatina, proporcionando una descripción efectiva de la ubicación y la forma nuclear, así como figuras mitóticas que resaltan la división celular.

Evaluamos el éxito del protocolo de explante durante la toma de imágenes. Observamos que en un somita dañado durante la disección la integridad del tejido somita se ve comprometida, con muchas células disociándose y extruyendo del somita explantado, y/o muchas células muriendo, lo que puede notarse por la presencia de núcleos fragmentados en el canal nuclear. Los explantes exitosos permanecieron sanos durante 4-6 h, después de lo cual se observaron cambios en la integridad de la somita con células que se disociaron del explante y murieron.

En el canal de utrofinas, realizamos la segmentación manual de explantes en MATLAB (R2018b) en cortes z espaciados cada 10 μm. Desarrollamos un algoritmo personalizado en MATLAB para la segmentación, que está disponible gratuitamente para su descarga (https://github.com/sundar07/SomSeg). En el algoritmo, se puede establecer el archivo, el marco y la porción z que se van a segmentar, seguidos de una indicación al usuario, que permite dibujar manualmente un contorno alrededor de la región de interés. Esto se repitió para múltiples cortes z y se trazó, lo que mostró el redondeo de los explantes a lo largo del tiempo en 3D (Figura 3A). Además, también se obtuvo información complementaria sobre la forma del tejido utilizando el canal nuclear. Para ello, utilizamos Mastodon (versión 1.0.0-beta-19, https://github.com/mastodon-sc/mastodon), un plugin de FIJI¹⁵ , para obtener las posiciones de los centroides de los núcleos mediante la detección puntual. Primero convertimos los archivos tif del microscopio al formato xml/hdf5 en FIJI, tras lo cual se abrió un nuevo proyecto utilizando el plugin de Mastodon. En el plugin, elegimos la opción de detección puntual, donde definimos una región de interés que cubría el explante y utilizamos la diferencia de detector gaussiano con un diámetro de 5 μm y un factor de calidad de 25 para la detección de manchas. A continuación, transferimos las posiciones de los centroides de los núcleos a MATLAB y utilizamos una función incorporada (convhull) para obtener una envoltura convexa (Figura 3B), que caracterizó la geometría del explante. De manera similar, esto mostró el redondeo de los explantes a lo largo del tiempo (Figura 3B). Los datos de los núcleos permiten, además, cuantificar los movimientos celulares mediante el seguimiento en 3D y un cambio en el número de células a lo largo del tiempo. Por otro lado, el canal de utrofina permite cuantificar los cambios en las formas de las células a medida que los explantes se vuelven más redondos. En conjunto, estos parámetros son valiosos para caracterizar las propiedades intrínsecas del material de los somitas, lo que ayuda a desarrollar descripciones físicas efectivas de los cambios en la forma de los tejidos.

Los explantes también permiten caracterizar las tensiones de contacto con los tejidos vecinos de manera cuantitativa. Para ilustrar esto, aislamos manualmente dos somitas y los colocamos muy cerca y observamos su dinámica (N = 2). Para este experimento, no se rastreó la orientación de los somitas con respecto a los ejes corporales in vivo . Curiosamente, con el tiempo, los somitas explantados se adhirieron entre sí a lo largo de una superficie, mientras que las superficies libres, es decir, las regiones alejadas del sitio de contacto se redondearon (Figura 4). Esto sugiere que las fuerzas adhesivas superan las tensiones generadas por la tensión superficial en los sitios de contacto en los explantes. Esto se puede caracterizar aún más siguiendo los cambios de forma descritos anteriormente y cuantificando los ángulos de contacto entre los dos tejidos a lo largo del tiempo en 3D. Por lo tanto, los explantes proporcionan un sistema atractivo para cuantificar las fuerzas competitivas en acción que conducen a formas específicas de tejidos, cuyas implicaciones se pueden explorar in vivo.

Figura 1: Preparación de explantes de un solo somita. El embrión de pez cebra (A) se descoriona primero (B), seguido de la eliminación de la piel y la yema (C). A continuación, se selecciona la región del embrión que contiene somita mediante la eliminación de los restos de los tejidos (D, E). A continuación, las regiones alrededor de la somita de interés se eliminan en serie (F-H) para aislar finalmente una sola somita (I), seguidas de imágenes de lapso de tiempo utilizando un microscopio de lámina de luz (aquí se muestra la sección z central de la somita) (J). Abreviaturas: S = somita; N = notocorda; LPM = mesodermo de la placa lateral; A = anterior; P = posterior. Las líneas discontinuas indican las posiciones de corte. Barra de escala = 50 μm en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Montaje de la cámara de imagen de lámina de luz. (A-D) Una tira de membrana FEP (dimensiones en (B)) se envuelve alrededor del soporte de la membrana, se coloca en la cámara de imagen y la membrana se pega a la cámara de imagen. (E-F) Al día siguiente, se retira el soporte de la membrana y se coloca un molde de imagen (dimensiones en (E)) en el centro de la cámara de imagen en agarosa de bajo punto de fusión. Toda la unidad se mantiene a 4 °C durante 30 minutos, tras lo cual se retira el molde y la cámara con el canal se utiliza para la obtención de imágenes de explantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis 3D de las formas de los tejidos. (A) Los contornos de las células se visualizaron con utrofina marcada con fluorescencia (Utr::mCherry) y los núcleos se visualizaron con histonas marcadas con fluorescencia (H2B::GFP). Los contornos del explante se segmentaron manualmente a múltiples profundidades utilizando MATLAB y se muestran aquí. (B) Se detectaron núcleos (rojos) en el mismo explante utilizando Mastodon, un complemento de FIJI, y se sometieron a una envoltura convexa (cian), que informa sobre la geometría del explante. Nótese que el redaje de explantes es evidente en ambos análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los somitas explantados se adhieren entre sí. Dos somitas aislados de embriones y colocados manualmente en estrecha proximidad tienden a adherirse con el tiempo (N = 2). Se adquirieron múltiples cortes z con un intervalo de fotogramas de 2 minutos utilizando un microscopio de hoja de luz y aquí se muestran secciones medias de somitas de puntos de tiempo seleccionados. Los contornos de las células se visualizaron con utrofina marcada con fluorescencia (Utr::mCherry). Barra de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El campo de la somitogénesis ha estado dominado por estudios sobre el papel del reloj de segmentación en el ajuste de las longitudes de los segmentos durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, es igualmente importante considerar el papel de la mecánica tisular en la determinación de las morfologías finales de los somitas. El protocolo aquí descrito permite explantar somitas individuales, cuyas propiedades físicas intrínsecas pueden estudiarse de forma aislada del embrión. Sin embargo, la preparación manual limita el número de somitas que normalmente se preparan a cuatro a seis por sesión de imágenes. Dado que el protocolo implica disecciones finas y cuidadosas de varios tejidos en embriones sin el uso de ninguna enzima para facilitar la extracción de tejido, puede llevar algunas semanas de práctica dominar el proceso de disección. En nuestras manos, los pasos críticos del protocolo implican la eliminación cuidadosa de la piel y la yema de los explantes, lo que evita que los explantes en diferentes etapas del protocolo se adhieran a las herramientas utilizadas, lo que a su vez permite disecciones más fáciles para eliminar en serie los tejidos que rodean a un somita.

El protocolo de disección puede detenerse en pasos intermedios para obtener somitas adheridos a uno solo de los tejidos circundantes o para obtener explantes de grupos de somitas. Esto proporciona un método poderoso para extirpar tejidos en serie y estudiar el impacto de los tejidos vecinos en la facilitación de los cambios de forma en los somitas o en los tejidos vecinos. Por otro lado, utilizando este protocolo, se puede permitir que los tejidos explantados individuales se adhieran y se autoorganicen mecánicamente, como se demuestra colocando dos somitas explantados muy cerca.

Los explantes preparados por este método no requieren ningún ingrediente añadido en el tampón ni restricciones para garantizar la supervivencia durante períodos de tiempo de hasta varias horas. Sin embargo, se puede imaginar cultivarlos en hidrogeles y seguir su dinámica en presencia de restricciones externas, lo que podría servir como modelo para las tensiones de contacto que los somitas encuentran in vivo. Además, los explantes permiten sondear directamente las propiedades de sus materiales a través de microscopía de fuerza atómica, aspiración con pipeta o mediante el uso de herramientas microrrobóticas¹⁶. Finalmente, esperamos que este método pueda adaptarse fácilmente hacia el cultivo y estudio de otros tejidos en desarrollo en etapas similares, como la notocorda, la placa neural y el mesodermo de la placa lateral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa	Sigma	9012-36-6	Para el recubrimiento del fondo de placas de Petri
Agarosa, baja temperatura de gelificación	Sigma	39346-81-1	Para la preparación de la cámara de imagen Viventis
Cámara	Andor Andor	Zyla 4.2 Plus	Para la adquisición de imágenes en el microscopio de lámina de luz Objetivo de
detección	Nikon	Nikon CFI75 Apo LWD 25x/1.1 NA	Para la adquisición de imágenes de explantes
tira de membrana FEP	Lohmann Technologies UK Ltd	Dupont FEP Película de fluorocarbono, 200A	Para la preparación de la cámara de imagen Viventis
Pinzas finas	Dumont Dumont	5SF 11252-00	Para la extracción de piel de embriones
Pinzas	Dumont Dumont	55	Para la descorionación de embriones
L-15 de Leibovitz	Gibco	21083-027 Medio de cultivo de	explantes
Microscopio de lámina de luz	Viventis	LS1 live	Para la adquisición de imágenes de explantes
Micro knife	Fine Science Tools	10318-14	Para la realización de incisiones en embriones
Formulación de caucho de silicona	Wacker Chemie AG	Silpuran 4200	Para la preparación de la cámara de imagen Viventis

Medio