Method Article

In vitro Caracterización de chaperonas de histonas mediante ensayos analíticos, pull-down y acompañantes

DOI:

10.3791/63218

⸱

December 29th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe una batería de métodos que incluye cromatografía analítica de exclusión de tamaño para estudiar la oligomerización y estabilidad de la chaperona de histonas, ensayo de extracción hacia abajo para desentrañar las interacciones chaperona-histona de histonas, AUC para analizar la estequiometría de los complejos de proteínas y ensayo de acompañamiento de histonas para caracterizar funcionalmente una chaperona de histonas putativa in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las proteínas histonas se asocian con el ADN para formar la cromatina eucariota. La unidad básica de la cromatina es un nucleosoma, formado por un octámero de histonas que consiste en dos copias de las histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4, envueltas por el ADN. El octámero está compuesto por dos copias de un dímero H2A/H2B y una sola copia de un tetrámero H3/H4. Las histonas centrales altamente cargadas son propensas a interacciones no específicas con varias proteínas en el citoplasma celular y el núcleo. Las chaperonas de histonas forman una clase diversa de proteínas que transportan histonas desde el citoplasma al núcleo y ayudan a su deposición en el ADN, ayudando así al proceso de ensamblaje de nucleosomas. Algunas chaperonas de histonas son específicas para H2A/H2B o H3/H4, y algunas funcionan como chaperonas para ambas. Este protocolo describe cómo las técnicas de laboratorio in vitro , como los ensayos pull-down, la cromatografía analítica de exclusión de tamaño, la ultracentrifugación analítica y el ensayo de acompañamiento de histonas, podrían usarse en conjunto para confirmar si una proteína dada es funcional como una chaperona de histonas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los nucleosomas compuestos de ADN y proteínas histonas forman la unidad estructural de la cromatina y regulan varios eventos celulares críticos. Los nucleosomas se reposicionan y remodelan dinámicamente para hacer que el ADN sea accesible a diversos procesos como la replicación, la transcripción y la traducción 1,2. Las histonas que son altamente básicas tienden a interactuar con proteínas ácidas en el medio celular o sufren agregación, lo que lleva a varios defectos celulares 3,4,5. Un grupo de proteínas dedicadas llamadas chaperonas histonas ayudan al transporte de histonas desde el citoplasma hasta el núcleo y previenen eventos aberrantes de agregación histona-ADN 6,7. Fundamentalmente, la mayoría de las chaperonas de histonas almacenan y transfieren histonas al ADN con fuerza iónica fisiológica, ayudando así a la formación de nucleosomas 8,9. Algunas chaperonas de histonas tienen una preferencia definida por los oligómeros de histonas H2A/H2B o H3/H410.

Las chaperonas de histonas se caracterizan por su capacidad para ensamblar nucleosomas dependientes o independientes de la síntesis de ADN11. Por ejemplo, el factor de ensamblaje de la cromatina-1 (CAF-1) es dependiente, mientras que el regulador de histonas A (HIRA) es independiente de la síntesis de ADN12,13. Del mismo modo, la familia de nucleoplasminas de las chaperonas histonas está involucrada en la descondensación de la cromatina espermática y el ensamblaje de nucleosomas14. Los miembros de la familia de proteínas de ensamblaje de nucleosomas (NAP) facilitan la formación de estructuras similares a nucleosomas in vitro y están involucrados en el transporte de histonas entre el citoplasma y el núcleo15. Las nucleoplasminas y las proteínas de la familia NAP son chaperonas de histonas funcionales, pero no comparten ninguna característica estructural. Esencialmente, ninguna característica estructural única permite la clasificación de una proteína como una chaperona de histonas16. El uso de ensayos funcionales y biofísicos junto con estudios estructurales funcionan mejor para caracterizar las chaperonas de histonas.

Este trabajo describe métodos bioquímicos y biofísicos para caracterizar una proteína como una chaperona de histonas que ayuda al ensamblaje de nucleosomas. En primer lugar, se realizó cromatografía analítica de exclusión de tamaño para analizar el estado oligomérico y la estabilidad de las chaperonas de histonas. A continuación, se realizó un ensayo pull-down para determinar las fuerzas impulsoras y la naturaleza competitiva de las interacciones chaperona-histona de histonas. Sin embargo, los parámetros hidrodinámicos de estas interacciones no pudieron calcularse con precisión utilizando cromatografía analítica de exclusión de tamaño debido a la forma de la proteína y sus complejos que afectan su migración a través de la columna. Por lo tanto, se utilizó la ultracentrifugación analítica, que proporciona propiedades macromoleculares en solución que incluyen el peso molecular preciso, la estequiometría de interacción y la forma de las moléculas biológicas. Estudios anteriores han utilizado ampliamente el ensayo de acompañamiento de histonas in vitro para caracterizar funcionalmente las chaperonas de histonas como yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. El ensayo de acompañamiento de histonas también se utilizó para caracterizar funcionalmente las proteínas como chaperonas de histonas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cromatografía analítica de exclusión de tamaño para dilucidar el estado oligomérico y la estabilidad de las chaperonas de histonas

  1. Análisis del estado oligomérico de las chaperonas de histonas
    1. Equilibrar una columna de cromatografía analítica de exclusión de tamaño (SEC) de 24 ml con 1,2 ml de volumen de columna (CV), es decir, 28,8 ml de tampón SEC desgasificado [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 de NaCl mM y 1 mM de β-mercaptoetanol (β-ME)] a 4 °C (ver Tabla de materiales).
      NOTA: El tipo de columna, la composición del tampón y el pH del tampón se pueden seleccionar en función de la proteína de interés. El volumen de inyección de la muestra no debe exceder los 500 μL para una columna de 24 ml. Además, la presión de la columna debe mantenerse por debajo de 5 MPa.
    2. A partir de una solución madre de proteínas de mayor concentración, preparar 500 μL de muestra de proteína de 0,5 mg/ml en tampón SEC desgasificado e inyectarla en la columna preequilibrada utilizando un bucle de inyección de 500 μL. Permitir que la ejecución cromatográfica proceda a un caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min con el tampón SEC a 4 °C.
    3. Monitoree el perfil de elución de la proteína midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm. Cuando se trata de proteínas que carecen de residuos aromáticos, medir la absorbancia a 214 nm.
    4. Utilice el volumen de elución de la proteína para calcular su peso molecular aproximado en kDa utilizando la curva de calibración estándar21.
      NOTA: La curva de calibración se prepara trazando el volumen de retención de proteínas de peso molecular conocidas contra el logaritmo de sus respectivos pesos moleculares (log Mr), eluidos utilizando la misma columna.
  2. Análisis de la estabilidad térmica de las chaperonas de histonas
    1. Tomar 500 μL de 0,5 mg/ml de la muestra de proteína preparada en tampón SEC desgasificado (igual que el utilizado en 1.1.1) en tubos de microcentrífuga individuales y calentar cada tubo a una temperatura particular que oscile entre 20 °C y 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C y 90 °C) durante 10 min en un baño maría.
    2. Posteriormente, centrifugar las muestras tratadas térmicamente a 16.200 x g durante 10 min a 4 °C, recoger el sobrenadante con una micropipeta e inyectar cada muestra individualmente utilizando un bucle de inyección de 500 μL en la columna analítica, preequilibrado con el tampón SEC a 4 °C.
    3. Permitir que la ejecución cromatográfica proceda a un caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min con el tampón SEC a 4 °C.
    4. Observe la posición y la altura de los picos de elución y busque la aparición de picos adicionales para las diferentes muestras.
  3. Análisis de la estabilidad química de las chaperonas de histonas
    1. Para examinar la estabilidad salina de las chaperonas de histonas, incubar 500 μL de 0,5 mg/ml de muestra de proteína preparada en un tampón Tris [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y 1 mM de β-ME] suplementado con concentraciones crecientes de NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1,5 M y 2 M) en tubos de microcentrífuga separados durante 30 min a 4 °C. Centrifugar las muestras a 16.200 x g durante 10 min a 4 °C y retener el sobrenadante.
    2. A continuación, cargue las muestras de proteínas en diferentes concentraciones de NaCl individualmente, utilizando un bucle de inyección de 500 μL en la columna analítica preequilibrada con 1,2 CV (28,8 ml) del tampón respectivo que contiene concentraciones crecientes de NaCl a 4 °C.
    3. Permitir que la ejecución cromatográfica proceda a un caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min con 1 CV (24 ml) del tampón respectivo a 4 °C.
    4. Observe la posición y la altura de los picos de elución y busque la aparición de picos adicionales para las diferentes muestras.
    5. Del mismo modo, para el análisis de estabilidad de la urea, incubar 500 μL de 0,5 mg/ml de muestra de proteína preparada en un tampón Tris [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y 1 mM de β-ME] suplementado con concentraciones crecientes de urea (1 M, 2 M, 3 M, 4 M y 5 M) en tubos de microcentrífuga separados durante 16 h a temperatura ambiente. Centrifugar las muestras a 16.200 x g durante 10 min a temperatura ambiente y retener el sobrenadante.
    6. A continuación, cargue las muestras de proteínas tratadas con urea individualmente utilizando un bucle de inyección de 500 μL en la columna analítica preequilibrada con 1,2 CV (28,8 ml) del tampón correspondiente que contiene diferentes concentraciones de urea a temperatura ambiente.
    7. Permita que la ejecución cromatográfica proceda a un caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min con 1 CV (24 ml) del tampón respectivo a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: No realice los experimentos con tampón que contenga urea a una temperatura más baja ya que la urea tiende a cristalizar y dañar la columna.
    8. Observe la posición y la altura de los picos de elución y busque la aparición de picos adicionales para las diferentes muestras.

2. Ensayos pull-down basados en gradiente de sal para comprender el tipo de interacciones que contribuyen a la formación compleja entre oligómeros de histonas y una chaperona de histonas

  1. Para cada reacción del ensayo pull-down, pipetear 40 μL de resina Ni-NTA en una columna de centrifugado y lavar con agua estéril de doble destilación. Posteriormente, equilibre la resina con 100 CV (4 mL) de tampón de equilibrio [20 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 10 μg/mL de BSA y 1 mM de β-ME] (ver Tabla de materiales).
    NOTA: La extracción también se puede realizar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Preparar la muestra mezclando 5 μM de la chaperona de histonas marcada con His con 20 μM de dímero H2A/H2B de histona o tetrámero H3/H4 en el tampón de equilibrio. Incubar la muestra en hielo durante 1 h.
    NOTA: El dímero H2A/H2B y el tetrámero H3/H4 se preparan a partir de histonas humanas recombinantes21, y la integridad de los oligómeros se confirma sobre la base de las masas moleculares estimadas por ultracentrifugación analítica (AUC). Los mismos oligómeros de histonas se han utilizado para todos los experimentos mencionados a continuación.
  3. Cargue las muestras en columnas de centrifugado preequilibradas separadas con resina Ni-NTA del paso 2.1, cada una etiquetada para una concentración de sal particular, y mantenga las columnas durante 30 minutos a 4 °C. Centrifugar las columnas a 1000 x g durante 1 min.
  4. A continuación, lave las columnas con 100 CV (4 ml) de tampón de lavado [20 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM de imidazol, 0.2% de Tween-20 y 1 mM de β-ME] que contengan diferentes concentraciones de sal (es decir, 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM y 1 M NaCl). Lave cada columna con un tampón que tenga una concentración particular de sal.
  5. Después de la etapa de lavado con sal, eluya la proteína de las diferentes columnas utilizando 100 μL de tampón de elución [20 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM de NaCl, 300 mM de imidazol y 1 mM de β-ME].
  6. Posteriormente, someta las muestras eluyidas al 18% SDS-PAGE22 y visualice el gel después de la tinción con Coomassie Brilliant Blue R250 (ver Tabla de materiales). Alternativamente, puede cargar directamente la resina en el gel SDS-PAGE en lugar de liberar la proteína unida de la resina Ni-NTA.
    NOTA: Las composiciones del tampón de equilibrio, lavado y elución y el pH pueden modificarse dependiendo de la proteína de interés.

3. Ensayo pull-down competitivo para identificar la preferencia de una chaperona de histonas por H2A/H2B o H3/H4

  1. Preparar la columna de giro como se describe en el paso 2.1
  2. Incubar 5 μM de la chaperona de histonas con 20 μM de dímero H2A/H2B en 300 μL de tampón de equilibrio (preparado en el paso 2.1) durante 30 min sobre hielo.
    NOTA: La proporción de oligómero de histonas a chaperona de histonas en la reacción se puede elegir en función de los datos conocidos de estequiometría de unión; Use un exceso de histona cinco veces mayor si no hay información disponible.
  3. Centrifugar el complejo chaperona de histonas-H2A/H2B a 16.200 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar cualquier precipitado. A continuación, cargar la muestra en la columna de centrifugado preequilibrada con tampón de equilibrio (preparado en el paso 2.1) e incubar durante 30 min a 4 °C.
  4. Lave la columna con 100 CV (4 ml) de tampón de lavado [20 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM de NaCl, 50 mM de imidazol, 0.2% de Tween-20 y 1 mM de β-ME] para eliminar el exceso de dímero H2A/H2B. A continuación, mezcle el complejo chaperona histona-H2A / H2B con 20-60 μM de tetrámero H3 / H4 e incube durante 30 minutos en hielo.
  5. Vuelva a lavar la columna con 100 CV (4 ml) de tampón de lavado (preparado en el paso 3.4) para eliminar cualquier tetrámero H3/H4 no unido y eluya la muestra utilizando un tampón de elución (preparado en el paso 2.5). Sujete las muestras eluyidas al 18% SDS-PAGE y visualice después de la tinción con Coomassie Brilliant Blue R250.
    NOTA: El ensayo podría invertirse en el que, primero, el tetrámero H3 / H4 se puede mezclar con la chaperona, se permite que el complejo se una a las perlas de Ni-NTA y luego se incuba el complejo con concentraciones variables de dímero H2A / H2B.

4. Experimentos analíticos de ultracentrifugación - velocidad de sedimentación (AUC-SV) para analizar la estequiometría de unión entre chaperonas de histonas e histonas

  1. Preparación de muestras para AUC
    1. Dializar el dímero H2A/H2B de histona reconstituido, el tetrámero H3/H4 y la chaperona de histonas por separado a través de un tubo de diálisis de corte de 7 kDa23, contra un tampón de diálisis [20 mM de Tris (pH 7.5), 300 mM de NaCl y 1 mM de β-ME] (ver Tabla de materiales). Para minimizar el error de fondo debido a la falta de coincidencia del búfer, realice diálisis extensivamente contra el tampón de diálisis, preferiblemente tres veces durante un período de 24 h.
      NOTA: El ODinicial 280 de las muestras de proteína debe tener un valor de dos a tres veces mayor para lograr un OD280 final de 0.3-0.5. Esto se hace esencialmente para anular los efectos de la dilución.
    2. Purificar el dímero H2A/H2B, el tetrámero H3/H4 y la chaperona de histonas individualmente con el tampón de diálisis, utilizando cromatografía analítica de exclusión de tamaño (como se mencionó en el paso 1). Guarde el tampón de la ejecución para preparar diluciones adicionales más adelante y para usarlo como referencia en la celda AUC.
  2. Carga de muestras para AUC
    1. Mezclar las proteínas purificadas en un volumen final de 450 μL utilizando tampón de diálisis a partir del paso 4.1.1 para alcanzar un OD280 de 0,3-0,6. Mezcle la chaperona de histonas con dímero H2A/H2B o tetrámero H3/H4 para la formación de complejos en tubos de reacción separados. Incubar las mezclas de proteínas durante 2-3 h.
      NOTA: Alternativamente, los datos de sedimentación se pueden adquirir con un sistema de escaneo óptico de interferencia en la ultracentrífuga analítica. Por separado, para mezclar proteínas purificadas, fijar la concentración de chaperonas de histonas e incubarla con concentraciones crecientes de oligómeros de histonas para obtener la estequiometría exacta.
    2. Ensamble la celda con una pieza central de doble sector y ventanas de cuarzo para el experimento AUC-SV utilizando un detector de absorbancia de la ultracentrífuga analítica como se describió anteriormente en detalle24.
    3. Llene 400 μL de la solución de muestra y 420 μL de tampón de diálisis en los dos sectores (muestra y sectores de referencia, respectivamente) de la célula.
      NOTA: Se utiliza un mayor volumen de tampón en el sector de referencia para mantener el menisco de referencia por encima del menisco de la muestra. Sin embargo, mientras usa un sistema de interferencia óptica, llene los dos sectores con el mismo volumen.
    4. Pese y equilibre con precisión las celdas y cárguelas en un rotor de titanio de cuatro lugares (consulte la Tabla de materiales). Alinee las celdas utilizando las marcas proporcionadas en la parte inferior de las celdas y el rotor. Cargue el rotor en la centrífuga, cierre la tapa y permita desarrollar un vacío hasta que la presión descienda a menos de 15 micras de Hg y la temperatura del rotor se estabilice a 20 ° C (generalmente toma 2-2.5 h).
      NOTA: Los parámetros de funcionamiento del AUC incluyen la temperatura experimental, la velocidad del rotor, el intervalo entre escaneos y el número de escaneos que se recopilarán. En el caso de los experimentos SV, el intervalo de exploración se da de acuerdo con la masa molecular de la proteína; Las proteínas más pequeñas requieren intervalos de tiempo más grandes entre las exploraciones. La velocidad del rotor también se establece de acuerdo con la masa molecular esperada de la proteína, y el experimento se lleva a cabo a 20 ° C. Los datos de absorbancia se monitorizan a 280 nm.
    5. Para obtener la estequiometría exacta, mantenga constante la concentración de chaperonas de histonas e incube con concentraciones crecientes de oligómeros de histonas para lograr la saturación.
  3. Análisis de datos de AUC
    1. Realizar el análisis de datos como se describió anteriormente25. Brevemente, calcule la densidad y viscosidad de los componentes del tampón utilizando el programa SEDNTERP26 (consulte la Tabla de materiales). Del mismo modo, calcule el volumen específico parcial de la proteína en función de su composición de aminoácidos, utilizando también SEDNTERP.
    2. Cargue los datos de la máquina AUC en el programa SEDFIT27 y defina el menisco (línea roja), la parte inferior de la celda (línea azul) y los límites del análisis de datos (líneas verdes). Elija la distribución continua de C(s) como modelo.
    3. A continuación, establezca la resolución máxima en 100; establecer coeficiente de sedimentación (s), s min: 0 y s max: 10-15; establecer la relación de fricción en 1,2 inicialmente y optar por flotar para derivar la relación a partir de los datos; establecer el nivel de confianza (relación F; que determina la magnitud de la regularización) en 0,68 para la regularización 1 sigma; establecer valores parciales específicos de volumen, densidad tampón y viscosidad tampón obtenidos de SEDNTERP.
    4. Presione EJECUTAR para permitir que el software resuelva la ecuación de Lamm27. Ajuste los parámetros si hay una discrepancia significativa de datos. Después de ajustar los parámetros, presione FIT para refinar todos los parámetros. Evalúe la calidad del ajuste en función del valor de desviación cuadrática media (RMSD), que debe ser inferior a 0,01 unidades de señal.
    5. Estime las masas moleculares de los picos eligiendo la opción: mostrar pico "Mw en c (s)" en la función de visualización de la barra de herramientas principal, que proporcionará información sobre la 's' de la molécula / complejo.

5. Ensayo de superenrollamiento de plásmidos para confirmar la función de acompañamiento de histonas

  1. Reacción de ensamblaje de nucleosomas
    1. Mezclar 2 μM de tetrámero H3/H4 y 4 μM de dímero H2A/H2B con concentraciones crecientes de la chaperona de histonas (1-6 μM) en un tampón de ensamblaje [20 mM de Tris HCl (pH 7,5), 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl2, 0,1 mg/ml de BSA y 100 mM de NaCl] hasta un volumen final de 50 μL. Incubar la mezcla a 4 °C durante 30 min.
    2. Simultáneamente, en una reacción separada, pretratar 500 ng del plásmido pUC19 en espiral negativamente con 1 μg de enzima topoisomerasa I (ver Tabla de materiales) en el tampón de ensamblaje en un volumen final de 50 μL e incubar a 30 °C durante 30 min.
      NOTA: La topoisomerasa I relaja el ADN plásmido bicatenario superenrollado generando un nick monocatenario. Se podría utilizar una enzima topoisomerasa I de origen eucariota, como la topoisomerasa I del germen de trigo disponible comercialmente o la topoisomerasa I de Drosophila melanogaster expresada recombinantemente.
    3. A continuación, combinar el tetrámero H3/H4, el dímero H2A/H2B, la mezcla de chaperonas de histonas (del paso 5.1.1), la mezcla de reacción de ADN plásmido relajado (del paso 5.1.2) e incubar aún más a 30 °C durante 90 min.
      NOTA: Configure dos reacciones de control para el ensayo; uno con la chaperona de histonas y el ADN plásmido relajado (pero no las histonas) y el otro con los oligómeros de histonas y el ADN plásmido relajado (pero no la chaperona de histonas).
    4. Detenga la reacción de ensamblaje agregando 100 μL de tampón de parada 2x (40 mM de EDTA, 2% de SDS y 0.4 mg / ml de proteinasa K) e incubar a 37 °C durante 30 min.
      NOTA: Stop buffer desproteiniza el ADN plásmido mediante desnaturalización y proteólisis de histonas unidas.
  2. Extracción de fenol-cloroformo y precipitación de etanol
    1. Añadir un volumen igual de fenol saturado de Tris en el tubo que contiene la mezcla de reacción del paso 5.1.4 y mezclar bien, seguido de centrifugación a 16,200 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    2. Recoger suavemente la fase acuosa superior que tiene el ADN plásmido con una micropipeta y mezclar con un volumen igual de cloroformo. Vaporizar la mezcla y centrifugar a 16.200 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
      NOTA: El alcohol isoamílico podría incluirse en este paso para evitar una interfaz difusa entre las fases acuosa y orgánica.
    3. A continuación, recoja la fase acuosa superior, agregue 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5.5) y 2.5 volúmenes de etanol helado (consulte la Tabla de materiales). Mezclar bien la solución invirtiendo el tubo 3-4 veces y mantener la mezcla en un congelador de -20 °C durante 30 minutos para la precipitación completa del ADN plásmido.
    4. Centrifugar la muestra del paso 5.2.3 a 16200 x g durante 10 min y desechar suavemente el sobrenadante. Mantenga los tubos abiertos a temperatura ambiente hasta que incluso pequeñas cantidades de etanol se evaporen, dejando el ADN plásmido precipitado en el tubo.
  3. Realice la electroforesis en gel de agarosa para observar el efecto de superenrollamiento del plásmido.
    1. Disolver el ADN plásmido precipitado del paso 5.2.4 en agua estéril de doble destilación.
    2. Resuelva las muestras en un gel de agarosa al 1% en 1x tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) (40 mM de Tris, 20 mM de ácido acético y 1 mM de EDTA) (ver Tabla de materiales).
    3. Tiñe el gel con una concentración de 0.2-0.5 μg / ml de bromuro de etidio y observe bajo UV para visualizar las bandas de ADN en el gel.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El dominio nucleoplasmina N-terminal recombinante de la proteína FKBP53 de Arabidopsis thaliana se sometió a SEC analítico. El volumen pico de elución se trazó contra la curva estándar para identificar su estado oligomérico. Los resultados analíticos de la SEC revelaron que el dominio existe como un pentámero en solución, con una masa molecular aproximada de 58 kDa (Figura 1A, B). Además, el dominio de nucleoplasmina se analizó para determinar la estabilidad térmica...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo demuestra y valida un conjunto completo de protocolos para la caracterización bioquímica y biofísica de una chaperona de histonas putativa. En esta invención, se utilizaron proteínas de la familia NAP expresadas y purificadas recombinantemente, AtNRP1 y AtNRP2, y el dominio de nucleoplasmina N-terminal de AtFKBP53 para demostrar los protocolos. El mismo conjunto de experimentos podría muy bien usarse para delinear los atributos funcionales de las chaperonas de histonas previamente no caracterizadas de cualqu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No se declaró ningún conflicto de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las subvenciones extramuros a Dileep Vasudevan de la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería del Gobierno de la India [CRG/2018/000695/PS] y el Departamento de Biotecnología, Ministerio de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India [BT/INF/22/SP33046/2019], así como el apoyo intramuros del Instituto de Ciencias de la Vida, Bhubaneswar, son muy reconocidos. Agradecemos a la Sra. Sudeshna Sen y a la Sra. Annapurna Sahoo por su ayuda con la preparación de histonas. También se reconocen las conversaciones con nuestros colegas el Dr. Chinmayee Mohapatra, el Sr. Manas Kumar Jagdev y el Dr. Shaikh Nausad Hossain.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ácido acético (glacial)SigmaA6283
AcrilamidaMP Biomedicals814326
AgarosaMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Instrumento para la purificación de proteínas
Persulfato de amonio (APS)Rotor SigmaA3678
An-60TiBeckman Coulter361964Rotor para ultracentrifugación analítica
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA7030
CloroformoSigmaC2432
Coomassie azul brillante R 250Sigma1.15444
Tubo de diálisis (corte de 7 kDa)Thermo Fisher68700Para el análisis de muestras de proteínas
Ditiothreitol ( DTT)MP Biomedicals100597
Tinte de carga de ADNNew England BiolabsB7025S
Sal disódica EDTAMP Biomedicals 194822
Balanza electrónicaShimadzuATX224R
EtanolSigmaE7023
Bromuro de etidio (EtBr)SigmaE8751
Gel Doc SistemaBio-Rad12009077Para la obtención de imágenes de geles después de la tinción
Aparato de electroforesis en gel horizontalBio-Rad1704405 Instrumento para electroforesis en gel de agarosa
Ácido clorhídrico (HCl)Sigma320331
ImidazolMP Biomedicals102033
Cloruro de magnesio (MgCl2)SigmaM8266
MicropipetasEppendorfZ683779Para el pipeteo de microvolúmenes Sistema de
electroforesis Mini-PROTEANBio-Rad1658000Instrumento para SDS-PAGE
N,N-metileno-bis-acrilamidaMP Biomedicals800172
Nano dropThermo FisherND-2000Para la medición de concentraciones
Agarosa Ni-NTAInvitrogenR901-15Perlas de resina para ensayo desplegable
Optima Ultracentrífuga analítica AUCBeckman CoulterB86437Instrumento para ultracentrifugación analítica
Medidor de pHMettler ToledoMT30130863
PhenolSigmaP4557
Kit de aislamiento de plásmidosQiagen27104
Proteinasa KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Plásmido para ensayo de superbobinado
Centrífuga refrigerada de alta velocidadThermo Fisher75002402
SDS-PAGE marcador de proteínasBio-Rad1610317
SEDFITPrograma de software gratuito para datos analíticos de ultracentrifugación análisis
SEDNTERPPrograma de software libre para estimar la viscosidad y la densidad del tampón y el volumen específico parcial de una proteína
SigmaPrep Spin ColumnsSigmaSC1000Para ensayo pull-down
Acetato de sodioSigmaS2889
Cloruro de sodio (NaCl)MerckS9888
Dodecil sulfato de sodio (SDS)MP Biomédica102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Columna para cromatografía analítica de exclusión por tamaño
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Columna para cromatografía analítica de exclusión por tamaño
TEMEDSigma1.10732
Topoisomerasa IInspiralisWGT102Enzima utilizada en ensayo de superenrollamiento de plásmidos
Tris baseMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
UreaMP Biomedicals191450
Baño de aguaNü veNB 5Para el tratamiento térmico de muestras de proteínas
β-mercaptoetanol (β-ME)SigmaM6250
de proteínas y ADN

References

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