Estudio de diseño a implementación para el desarrollo y validación de pacientes de diagnósticos de interruptores de punto de apoyo basados en papel

La RT-qPCR se ha mantenido como la tecnología estándar de oro para el diagnóstico clínico debido a su excelente sensibilidad y especificidad. Aunque es muy robusto, el método depende de equipos y reactivos costosos y especializados que requieren distribución y almacenamiento con temperatura controlada. Esto presenta barreras significativas para la accesibilidad de diagnósticos de calidad a nivel mundial, particularmente en tiempos de brotes de enfermedades y en regiones donde el acceso a laboratorios bien equipados es limitado ^1,2. Esto se observó durante el brote del virus Zika 2015/2016 en Brasil. Con solo cinco laboratorios centralizados disponibles para proporcionar pruebas RT-qPCR, se produjeron cuellos de botella significativos, lo que limitó el acceso a los diagnósticos. Esto fue especialmente difícil para las personas en entornos periurbanos, que se vieron más gravemente afectadas por el brote ^3,4. En un esfuerzo por mejorar el acceso a los diagnósticos, el protocolo muestra una plataforma que se ha desarrollado con el potencial de proporcionar diagnósticos descentralizados, de bajo costo y de alta capacidad en entornos de bajos recursos. Como parte de esto, se estableció una tubería de descubrimiento de diagnóstico, acoplando sensores basados en amplificación isotérmica y conmutación de ARN sintético con sistemas de expresión libre de células basados en papel ^5,6.

Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS), en particular los sistemas libres de células basados en E. coli, son una plataforma atractiva para una amplia gama de aplicaciones de biodetección, desde el monitoreo ambiental ^7,8 hasta el diagnóstico de patógenos 5,6,9,10,11,12 . Compuestos por los componentes necesarios para la transcripción y traducción, los sistemas CFPS tienen ventajas significativas sobre los biosensores de células enteras. Específicamente, la detección no está limitada por una pared celular y, en general, son modulares en diseño, bioseguras, económicas y pueden liofilizarse para uso portátil. La capacidad de liofilizar reacciones basadas en circuitos genéticos sobre sustratos como papel o textiles, permite el transporte, el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente⁵ e incluso la incorporación en tecnología portátil¹³.

Trabajos anteriores han demostrado que los sistemas libres de células de E. coli se pueden utilizar para detectar numerosos analitos, por ejemplo, metales tóxicos como el mercurio, antibióticos como la tetraciclina^7,14, productos químicos disruptores endocrinos^15,16, biomarcadores como el ácido hipúrico 17, moléculas de detección de quórum asociadas a patógenos ^9,18 y sustancias ilícitas como la cocaína 17 y el gamma hidroxibutirato (GHB)¹⁹ . Para la detección de ácidos nucleicos específicos de secuencia, las estrategias se han basado en su mayor parte en el uso de biosensores basados en interruptores acoplados a técnicas de amplificación isotérmica. Los interruptores de punto de apoyo son riboreguladores sintéticos (también denominados simplemente "interruptores" en el resto del texto) que contienen una estructura de horquilla que bloquea la traslación posterior al secuestrar el sitio de unión ribosómica (RBS) y el codón de inicio. Tras la interacción con su ARN desencadenante objetivo, la estructura de horquilla se alivia y se habilita la traducción posterior de un marco de lectura abierto del reportero²⁰.

La amplificación isotérmica también puede ser utilizada como diagnóstico molecular²¹; sin embargo, estos métodos son propensos a la amplificación inespecífica, lo que puede reducir la especificidad y, por lo tanto, la precisión de la prueba por debajo de la RT-qPCR ²². En el trabajo reportado aquí, la amplificación isotérmica aguas arriba de los sensores basados en interruptores se utilizó para proporcionar una amplificación de señal combinada que permite la detección clínicamente relevante de ácidos nucleicos (femtomolar a attomolar). Este emparejamiento de los dos métodos también proporciona dos puntos de control específicos de la secuencia que, en combinación, proporcionan un alto nivel de especificidad. Usando este enfoque, trabajos previos han demostrado la detección de virus como Zika⁶, Ébola⁵, Norovirus¹⁰, así como bacterias patógenas como C. difficile²³ y Typhoid¹² resistente a los antibióticos. Más recientemente, se han demostrado interruptores de punto de apoyo sin células para la detección del SARS-CoV-2 en un esfuerzo por proporcionar diagnósticos accesibles para la pandemia de^{COVID-19 11,12,13}.

El siguiente protocolo describe el desarrollo y la validación del ensayo de interruptor de punto de apoyo sintético sin células y basado en papel para la detección del virus Zika, desde el diseño del biosensor in silico , pasando por los pasos de ensamblaje y optimización, hasta la validación de campo con muestras de pacientes. El protocolo comienza con el diseño in silico de sensores basados en interruptores de punto de apoyo de ARN y cebadores de amplificación isotérmica específicos para el ARN viral Zika. Aunque existen numerosos métodos de amplificación isotérmica, aquí se demostró el uso de la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) para aumentar la concentración del ARN viral objetivo presente en la reacción, lo que permite una sensibilidad clínicamente significativa. Prácticamente, los métodos de amplificación isotérmica tienen la ventaja de operar a una temperatura constante, eliminando la necesidad de equipos especializados, como los termocicladores, que generalmente se limitan a ubicaciones centralizadas.

A continuación, se describe el proceso de ensamblaje de los sensores de interruptor de punto de apoyo sintético con secuencias de codificación de reportero a través de PCR de extensión de superposición, y la detección de los sensores de interruptor de punto de apoyo sintético para un rendimiento óptimo en sistemas libres de células utilizando ARN sintético. Para este conjunto de sensores del virus Zika, hemos seleccionado el gen lacZ que codifica la enzima β-galactosidasa, que es capaz de escindir un sustrato colorimétrico, el rojo clorofenol β-D-galactopiranósido (CPRG), para producir un cambio de color amarillo a púrpura que puede ser detectado a simple vista o con un lector de placas. Una vez que se identifican los interruptores sintéticos de mayor rendimiento, se describe el proceso para la detección de cebadores para la amplificación isotérmica basada en secuencias de ácidos nucleicos de la secuencia objetivo correspondiente utilizando ARN sintético para encontrar conjuntos que proporcionen la mejor sensibilidad.

Finalmente, el desempeño de la plataforma de diagnóstico se valida in situ en América Latina (Figura 1). Para determinar la precisión del diagnóstico clínico, el ensayo sin células en papel se realiza utilizando muestras del virus del Zika de pacientes; en paralelo, se realiza un ensayo RT-qPCR estándar de oro para la comparación. Para monitorear los ensayos colorimétricos sin células, permitimos la cuantificación in situ de los resultados en regiones donde los termocicladores no están disponibles. El lector de placas ensamblado a mano llamado Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; en adelante, lector de placas portátil) también se presenta aquí²⁴. Inicialmente desarrollado como un dispositivo complementario para el diagnóstico de interruptores de punto de apoyo sintéticos sin células, el lector de placas portátil ofrece una forma accesible de incubar y leer resultados de una manera de alto rendimiento, proporcionando análisis de software integrado basado en visión artificial para los usuarios.

Figura 1: Flujo de trabajo para analizar muestras de pacientes utilizando reacciones de interruptor de punto de apoyo sin células basadas en papel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Todos los procedimientos que involucran a participantes humanos deben llevarse a cabo de acuerdo con las normas éticas y las directrices pertinentes, incluidos los principios éticos para la investigación médica con seres humanos establecidos por la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial. Este estudio fue aprobado por el comité de ética en investigación humana bajo el protocolo de licencia número CAAE: 80247417.4.0000.5190. El consentimiento informado de todos los pacientes incluidos en este estudio fue eximido por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Fiocruz-PE para las muestras diagnósticas.

NOTA: El dispositivo PLUM se denominará en lo sucesivo "lector de placas portátil".

1. Diseño computacional de cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos

1. Escanear el genoma del Zika para identificar un conjunto de regiones candidatas para la amplificación que tienen aproximadamente 200 nucleótidos (nt) a 300 nt de longitud poniendo la secuencia genómica en NCBI/Nucleotide BLAST^25,26. Comparar el genoma con las secuencias de ARN de referencia (refseq_rna) y buscar sitios que permanezcan altamente conservados y no tengan homología con el genoma humano (otros parámetros BLAST permanecen sin cambios). Seleccione al menos dos sitios para diseñar el interruptor de punto de apoyo sintético.
2. Utilice los criterios de selección de Deiman et ^al.27 para generar pares de cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos directos e inversos para cada región de amplificación candidata. En resumen, siga estos criterios para diseñar imprimaciones: (1) contenido de GC entre 40% -60%; (2) 20 a 24 nt de longitud con una temperatura de fusión del ADN superior a 41 °C; (3) no hay series de cuatro o más nucleótidos idénticos; (4) el nucleótido 3' final es una base A; (5) baja estructura secundaria de cebador y probabilidad de formación de dímeros. Cribe de 8 a 10 pares de cebadores para cada región de destino (recomendado).
3. Agregue la secuencia de prefijo que contiene la secuencia promotora T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(SECUENCIA PROMOTORA T7 subrayada) al extremo 5' de los cebadores directos para permitir la transcripción de los amplicones utilizando ARN polimerasa T7 (RNAP). Ordene los cebadores como oligos de ADN de una compañía de síntesis de ADN.

2. Diseño computacional de interruptores de punto de apoyo

1. Instale NUPACK²⁸ versión 3.2 (suite de diseño de ácidos nucleicos) según las instrucciones del sitio web²⁹. Utilice un sistema operativo UNIX y MATLAB (plataforma de computación numérica) como lenguaje de programación (recomendado).
2. Identificar las secuencias diana (p. ej., genoma viral) específicas del patógeno de interés para los diseños de los interruptores de punto de apoyo como en el paso 1.1. Elija las secuencias objetivo de Zika de los amplicones basados en secuencias de ácidos nucleicos generados en el paso 1.2.
   NOTA: En la práctica, los cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos o los interruptores de punto de apoyo sintéticos se pueden diseñar y probar primero, dependiendo de las necesidades de los usuarios. Si ya se han establecido regiones objetivo particulares de interés (por ejemplo, a partir de publicaciones existentes o protocolos de diagnóstico), el diseño y la detección del interruptor de punto de apoyo pueden ocurrir primero, seguidos por el diseño y la detección de cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos. Si no hay regiones objetivo establecidas, primero examine los cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos contra el genoma completo para reducir los objetivos de elección mientras se selecciona la eficiencia de amplificación del cebador. Si hay múltiples secuencias disponibles para el patógeno, es mejor diseñar cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos que se centren en regiones altamente conservadas (en lugar de examinar todo el genoma).
3. Descargue e instale el software de MATLAB necesario en el equipo.
4. Configure las variables de entorno para permitir que se llame a las funciones de la suite de diseño de ácidos nucleicos en el software. Para ello, abra el software y, a continuación, abra (o cree) un archivo startup.m en la carpeta de trabajo predeterminada. A continuación, copie las siguientes líneas de código en el archivo startup.m y, finalmente, agregue la carpeta que contiene los binarios de la suite de diseño de ácidos nucleicos al PATH:
   NUPACKINSTALL = '/Usuarios/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. Abra el software de la plataforma de computación numérica y navegue hasta la carpeta del software de diseño. Ejecute los algoritmos de diseño accesibles en https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
6. Introduzca las secuencias de destino en el design_input_file.csv situado en la subcarpeta de entrada. Las entradas incluyen Nombre, Secuencia externa, Secuencia interna, Temperatura, Nombre de salida y Secuencia de salida como se define en la Tabla 1. Si aún no se han determinado sitios de cebado para el objetivo, mantenga las secuencias internas y externas iguales. Solo los primeros 29 nt del reportero serán considerados durante el proceso de diseño. Cuando haya terminado, guarde y cierre la hoja de cálculo actualizada.
   NOTA: La secuencia de salida es la secuencia de la proteína reportera que se planea usar para el ensayo (por ejemplo, lacZ). La especificación de las secuencias internas y externas garantiza que el algoritmo no genere interruptores de punto de apoyo sintéticos que se superpongan con cualquiera de los cebadores. También asegura que el ensayo reconozca tres sitios únicos en el genoma del Zika para mejorar su especificidad.
7. Seleccione los parámetros que desea utilizar para la función de diseño: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, opciones). Rellene los valores de los parámetros como:
   1. num_designs - el número de diseños principales para cada salida objetivo del software. El valor predeterminado es 6 y se puede cambiar según sea necesario (se recomienda un mínimo de seis diseños para cada objetivo).
   2. input_file: este parámetro especifica el nombre del archivo que proporciona la información de la secuencia de entrada. El valor predeterminado es 'design_input_file.csv' y se puede cambiar según sea necesario.
   3. Elija entre las siguientes opciones: (1) Serie A y Serie B: la(s) versión(es) del interruptor de dedo que generará el código. Establezca la Serie B en 1 y la Serie A en 0 para generar el interruptor de punto de la serie B, que es el formato utilizado en el diagnóstico del virus del Zika⁶; (2) Paralelo: establecido en 1 para aprovechar múltiples núcleos para calcular los diseños; de lo contrario, se establece en 0; (3) Antisentido: se establece en 1 para generar interruptores de punto de apoyo que hibridan la secuencia antisentido (es decir, el complemento inverso) de la entrada objetivo; de lo contrario, establezca en 0.
8. Ejecute la función de diseño utilizando los parámetros seleccionados: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). El algoritmo comenzará a generar los diseños de interruptores de punto de apoyo para los objetivos de interés.
9. Al finalizar el diseño, ubique las secuencias de diseño del interruptor de punto de apoyo superior y las secuencias de destino correspondientes en la carpeta final_designs en forma de hojas de cálculo de formato .csv. Las secuencias de ADN del interruptor de punto de apoyo generadas por el algoritmo contendrán la secuencia promotora T7 en el extremo 5' y la secuencia conservada de enlazador de 21 nt AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG en el extremo 3'.
10. Examine las secuencias de diseño del interruptor de punto superior resultantes contra otros virus comunes colocándolas en NCBI-BLAST y verificando la homología de secuencia. Acepta secuencias con 40% de homología o menos.
11. Ordene las secuencias de horquilla del interruptor de dedo del pie como oligos de ADN y luego ensamblarlas con el gen reportero en interruptores completamente funcionales. Solicite los cebadores de PCR necesarios para el montaje posterior del sensor dependiendo de la proteína informadora de elección.

Tabla 1: La definición de cada parámetro utilizado en el software de diseño del interruptor de detenido.

3. Construcción de interruptores de punto de apoyo por PCR

NOTA: Estos pasos describen la construcción de interruptores de punto de apoyo LacZ mediante PCR de extensión de superposición. Aquí, el oligo de ADN se usa como cebador directo y el terminador T7 se usa como cebador inverso. Utilizamos el plásmido pCOLADuet-LacZ como plantilla para el gen lacZ (addgene: 75006). Cualquier otra plantilla de ADN que contenga la secuencia correspondiente se puede usar como plantilla, siempre que el terminador T7 esté incluido en la construcción final.

1. Una vez que se hayan recibido oligos de ADN sintético del proveedor comercial, prepare soluciones de ADN sintético y cebador de amplificación inversa a una concentración de 10 μM en agua libre de nucleasas. Ensamblar las reacciones en tubos de PCR sobre hielo de acuerdo con la Tabla 2.
   NOTA: Los volúmenes de PCR se pueden escalar según sea necesario. Utilice una cantidad mínima (0.1-1 ng) de la plantilla de ADN pCOLADuet-LacZ para evitar la necesidad de un paso adicional de eliminación de plásmidos o una señal LacZ de fondo. Para cantidades más altas de plantilla de ADN, siga la PCR con un digest de enzimas de restricción de DpnI para eliminar la plantilla de plásmido residual.
2. Colocar las reacciones en un termociclador, siguiendo las condiciones de ciclo enumeradas en la Tabla 3. Analizar los productos de PCR en un gel de agarosa (Figura 2; ver Protocolo Suplementario y³⁰).
3. Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR basado en columna de centrifugado y eluye el ADN en 15-30 μL de agua libre de nucleasa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuantificar el ADN usando un espectrofotómetro.

Tabla 2: Los componentes de PCR utilizados para construir los interruptores de punto de apoyo.

Tabla 3: Condiciones de ciclismo utilizadas durante la construcción de los interruptores de punto de apoyo por PCR.

4. Preparación del ARN blanco sintético (Trigger)

1. Utilizando un software de diseño de biología molecular, modifique las plantillas de ARN desencadenante sintético (seleccionadas en el paso 1.1) para incluir una secuencia promotora T7 aguas arriba, asegurando que la plantilla completa permanezca corta (<200 pb). diseñe cebadores hacia adelante y atrás para amplificar el cebador de la secuencia disparo (para secuencias oligo, consulte Protocolo suplementario).
2. Ordene las secuencias como oligos de ADN. Una vez recibido, reconstituir el ADN desencadenante sintético y los cebadores de amplificación a 10 μM en agua libre de nucleasas. Ensamblar las PCR correspondientes en tubos de pared delgada sobre hielo de acuerdo con la Tabla 2 y usar 0.5 μL del ultrasonido de ADN desencadenante (concentración final de 0.1 μM) como ADN modelo.
3. Coloque las reacciones en un termociclador y utilice las condiciones de ciclo enumeradas en la Tabla 3. Utilice un tiempo de extensión de 15 s. Evalúe la calidad y purifique los productos de PCR de activación como se describe en el paso 3.3 y el Protocolo suplementario.
   NOTA: Para acelerar el proceso, los productos de PCR de gatillo purificados en columna también se pueden usar directamente para la detección inicial del interruptor del punto de apoyo.

5. Transcripción in vitro de secuencias desencadenantes seleccionadas

1. Ensamble los componentes de reacción en hielo de acuerdo con la Tabla 4.
2. Incubar reacciones de transcripciónin vitro (IVT) a 37 °C durante 4 h, seguido de tratamiento con DNasa I para eliminar el ADN molde. Para el paso de DNasa I, añadir 70 μL de agua libre de nucleasa, 10 μL de tampón DNasa I 10x y 2 μL de DNasa I (libre de RNasa), e incubar a 37 °C durante 15 min. Si no continúa con el paso 5.4 inmediatamente, inactive DNasa I con la adición de 50 mM EDTA e inactivación térmica a 65 °C durante 10 min.
3. Paso opcional: Realizar un análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (por ejemplo, urea-PAGE) en los productos IVT para evaluar la calidad del ARN como se describe en el Protocolo Suplementario.
4. Purifique los productos de IVT desencadenantes utilizando un kit de limpieza de ARN basado en columnas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y luego cuantifique la concentración y pureza de ARN utilizando espectrofotometría. Consulte Protocolo suplementario para obtener instrucciones sobre cómo determinar la molaridad y el número de copias/μL del ARN.

Tabla 4: Transcripción in vitro (IVT) de secuencias desencadenantes seleccionadas.

6. Cribado inicial de los interruptores

NOTA: Esta sección describe los pasos asociados con la configuración de reacciones de interruptores de punto de apoyo sin celdas, basados en papel, y cómo detectar interruptores de punto de apoyo de alto rendimiento. El papel de filtro bloqueado BSA utilizado en el paso 6.10 debe prepararse de antemano como se describe en el Protocolo Suplementario.

1. Preparar una solución madre de CPRG disolviendo 25 mg del polvo en 1 ml de agua libre de nucleasas. Mantener la solución en hielo en todo momento y almacenar a -20 °C para uso prolongado.
2. Determine el número de reacciones que desea configurar. Para cada interruptor de punto de apoyo evaluado, incluya un control sin plantilla (sin interruptor y sin ARN objetivo, también conocido como control solo libre de células) para tener en cuenta cualquier señal de fondo que pueda surgir de la mezcla maestra. Incluya un control de solo interruptor para evaluar la permeabilidad del interruptor de fondo o la tasa de apagado en ausencia de ARN objetivo.
3. Ensamble una mezcla maestra de reacción libre de células de solución A, solución B, inhibidor de RNasa y CPRG en hielo de acuerdo con el protocolo estándar que figura en la Tabla 5.
   NOTA: Los pasos descritos aquí son para una mezcla maestra que será suficiente para un conjunto triplicado de reacciones de 1,8 μL con un volumen añadido del 10% para tener en cuenta el error de pipeteo. El volumen de la mezcla maestra debe ajustarse según sea necesario dependiendo del número de interruptores de punto de apoyo apantallados.
4. Para cada reacción libre de células triplicadas, dispense la mezcla maestra en un tubo de PCR, manteniendo todos los tubos en hielo. Para el tubo reservado como control solo libre de células, agregue agua libre de nucleasas a un volumen final de 5.84 μL, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y centrifugar brevemente. Para el resto de los tubos, agregue el ADN del interruptor de punto de apoyo purificado por PCR a una concentración final de 33 nM.
5. Para los tubos reservados como controles de interruptor solo, agregue agua libre de nucleasas a un volumen final de 5.84 μL. En el caso de los tubos reservados para probar el interruptor de la puntera y la combinación de ARN diana, añadir el ARN diana transcrito in vitro hasta una concentración final de 1 μM. Luego, agregue agua libre de nucleasas a un volumen final de 5.84 μL. Mezcle bien todas las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y centrifugar brevemente.
6. Agregue 30 μL de agua libre de nucleasa a los pocillos que rodean los pocillos de reacción en una placa de fondo negro y transparente de 384 pocillos. Esto minimiza la evaporación en el transcurso del experimento y mejora la reproducibilidad.
   NOTA: Si utiliza el dispositivo lector de placas portátil, coloque una lámina de PCR sobre la placa y use un cuchillo de precisión para cortar los pocillos destinados a su reacción, así como cada uno de los cuatro pocillos de esquina. La lámina de PCR evita la sobreexposición de la cámara del lector de placas portátil de pozos vacíos.
7. Con un punzón de biopsia de 2 mm y unas pinzas, corte los discos de papel de filtro bloqueados por BSA y colóquelos en los pocillos de reacción, ya sea expulsando el punzón o usando pinzas (consulte Protocolo suplementario para preparar papel de filtro bloqueado por BSA). Dispense triplicar volúmenes de 1,8 μL de cada tubo de reacción en los discos de papel de filtro en la placa de 384 pocillos, manteniendo todas las muestras, así como la placa de 384 pocillos, en hielo en todo momento.
   NOTA: Si utiliza el dispositivo lector de placas portátil, agregue 1,8 μL de CPRG (0,6 mg/ml) a cada una de las cuatro esquinas de la placa de 384 pocillos. El color amarillo de la CPRG proporciona reconocimiento de patrones al lector de placas portátil para la alineación de la plantilla digital de placa multipozo en el análisis de imágenes. Cubra los pocillos de la placa con película de PCR para evitar la evaporación.
8. Coloque la placa en un lector de placas, lea OD₅₇₀ a 37 °C cada minuto durante 130 min.

Tabla 5: Componentes de la reacción de transcripción-traducción libre de células PURExpress.

7. Identificación de interruptores de punto de alto rendimiento

NOTA: En esta sección se describe cómo analizar los datos del paso 6 para seleccionar los interruptores de punto de mejor rendimiento para avanzar.

1. Comience el análisis de datos normalizando primero a la absorbancia OD₅₇₀ de fondo. Para hacer esto, reste las mediciones de OD 570 de reacciones que no tienen ningún interruptor o ARN objetivo (es decir, pozos solos libres de células) de las otras mediciones de OD₅₇₀.
2. Suaviza los datos normalizados usando una media móvil de tres puntos y ajusta el valor mínimo de cada pocillo a cero. Consulte la figura 3 para ver un ejemplo de datos normalizados del curso de tiempo recopilados para los interruptores de punto de apoyo 27B, 33B y 47B.
3. Usando estos datos procesados, calcule el cambio de pliegue (o relación ON/OFF) determinando la diferencia en la tasa de cambio de color (es decir, cambio en OD₅₇₀ a lo largo del tiempo) entre el interruptor de punto de apoyo y los pozos objetivo y de interruptor solo (consulte el Protocolo suplementario para calcular la relación; Figura 4).
4. Seleccione los interruptores con el cambio de pliegue ON/OFF más alto para una mayor caracterización. Omita los interruptores de punto de apoyo de bajo rendimiento que muestran el cambio de plegado más bajo.

8. Cribado y sensibilidad del cebador de amplificación basado en secuencias de ácidos nucleicos

NOTA: En los siguientes pasos, primero se realiza una detección de cebadores de amplificación isotérmica funcional, y luego se evalúa su sensibilidad determinando el número de copias de ARN objetivo por μL de ARN sintético que un interruptor de punto de apoyo dado puede detectar de manera confiable cuando se combina con amplificación isotérmica. Después de la amplificación isotérmica, realice reacciones libres de células para identificar conjuntos de cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos exitosos. Sin embargo, puede ser más rentable ejecutar geles de poliacrilamida o agarosa en reacciones de amplificación basadas en secuencias de ácidos nucleicos para reducir primero el conjunto de conjuntos de cebadores candidatos. En ese caso, los conjuntos de cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos que generan una banda en el gel en el tamaño de amplicón apropiado pueden ser preseleccionados para el posterior cribado libre de células.

1. Hacer una solución madre de 25 μM de todos los juegos de cebadores directos e inversos en agua libre de nucleasas (consulte el Protocolo suplementario). Determinar el número de reacciones de amplificación basadas en secuencias de ácidos nucleicos y las reacciones libres de células posteriores que deben configurarse. Esto dependerá del número de interruptores de punto de apoyo y los respectivos juegos de cebadores.
   NOTA: Al examinar los cebadores, es importante incluir siempre un control sin plantilla para cada conjunto de cebadores para tener en cuenta cualquier artefacto de fondo que pueda surgir debido a la amplificación no específica asociada al cebador.
2. Configure una reacción de 5 μL de la siguiente manera (escale esto según sea necesario). Descongele todos los reactivos en hielo. Ensamble una mezcla maestra de reacción del tampón de reacción, la mezcla de nucleótidos y el inhibidor de la RNasa de acuerdo con la Tabla 6. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que el precipitado blanco esté solubilizado, y luego dispensar alícuotas en tubos de PCR.
   1. Si la mezcla maestra es para cribar cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos, excluya los cebadores de la mezcla maestra al principio (dispense 2,55 μL de mezcla maestra). De lo contrario, si se realiza un análisis de sensibilidad de cebador, los cebadores se pueden incluir en la mezcla maestra (en cuyo caso se dispensan alícuotas de 2,75 μL). Agregue la mezcla de enzimas después de las etapas de desnaturalización y equilibrio.
3. Si examina los cebadores de amplificación basados en secuencias de ácidos nucleicos, agregue los cebadores directos e inversos a los tubos apropiados. En un termociclador, configure el protocolo de incubación como se describe en la Tabla 7.
4. Agregue 1 μL de agua libre de nucleasas o 1 μL de ARN desencadenante objetivo a 2 pM o aproximadamente 10⁶ copias/μL, asegurándose de etiquetar los tubos en consecuencia. Mezclar con un pipeteo suave y girar brevemente los tubos.
   NOTA: Para el cribado del conjunto de cebadores, utilice una concentración de ARN desencadenante objetivo que sea lo suficientemente alta como para no afectar el límite inferior de detección del método de amplificación isotérmica, pero no lo suficientemente alta como para proporcionar la activación del interruptor de punto de apoyo si no se produjera amplificación.
5. Mover los tubos al termociclador e iniciar la incubación. Después de 12 minutos, retire los tubos y agregue 1,25 μL de la mezcla de enzimas a cada tubo. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugar brevemente los tubos.
   NOTA: En este punto, los tubos pueden mantenerse a temperatura ambiente; Sin embargo, la mezcla de enzimas debe mantenerse en hielo hasta que se agregue a los tubos.
6. Devuelva los tubos al termociclador, omitiendo el paso de retención de 41 °C para iniciar la incubación de reacción de 1 h.
   NOTA: Después de la incubación, las reacciones pueden colocarse en hielo para su procesamiento el mismo día o congelarse a -20 °C para su posterior procesamiento.
7. Siga los pasos 6.2-6.7 y la Tabla 8 para ensamblar reacciones de interruptor de punto de apoyo sin celda a base de papel para evaluar el rendimiento de la imprimación. Analice los datos como se describe en los pasos 7.1-7.2 y en la figura 3.
   NOTA: Además de los controles mencionados anteriormente, es importante incluir también el control negativo para tener en cuenta cualquier señal de fondo que pueda surgir de la reacción. Además, es importante incluir también un control con el interruptor y 2 pM (concentración final) de ARN diana, como control de amplificación sin NASBA.
8. Identifique pares de cebadores candidatos para avanzar con el análisis de sensibilidad. Los pares de cebadores se seleccionan en función de si se produce la activación del interruptor de punto de apoyo después de la adición de la reacción incubada. Si es necesario, repita la pantalla de imprimación con más combinaciones de imprimación.
9. Manteniendo las muestras de ARN en hielo en todo momento, haga el siguiente conjunto de dilución en serie de ARN diana en agua libre de nucleasas: 10⁴, 10³, 10 2, 10¹ y 10⁰ copias de ARN/μL. Repita la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos y las reacciones libres de células con los conjuntos de cebadores seleccionados (pasos 8.2-8.7), probando la serie de dilución en serie para identificar los conjuntos de cebadores que proporcionan la mejor sensibilidad. Consulte la figura 5 para ver un ejemplo de resultados para determinar la sensibilidad del conjunto de cebadores.
   NOTA: Idealmente, el interruptor de punto de apoyo seleccionado y el par de cebadores deben detectar tan solo 1-100 copias de ARN objetivo por μL del ARN (concentración de solución madre).
10. Repita el experimento de sensibilidad a la amplificación basado en secuencias de ácidos nucleicos en triplicado biológico. Este paso sirve para confirmar la reproducibilidad de los resultados antes de pasar a experimentos con muestras de pacientes.
11. Opcional: Para tener una fuente confiable del ADN del interruptor para uso a largo plazo y para el transporte, clone la(s) secuencia(s) de conmutación seleccionada(s) en un plásmido utilizando cualquier método de clonación convencional. Del mismo modo, la secuencia de ARN desencadenante objetivo también puede clonarse en un plásmido de elección para su almacenamiento.

Tabla 6: Componentes de reacción NASBA.

Tabla 7: Condiciones de reacción para la NASBA.

Tabla 8: Componentes de reacción libres de células a base de papel.

9. Recolección de muestras de pacientes y extracción de ARN viral

NOTA: Esta sección describe el protocolo para recolectar muestras de pacientes y extraer el ARN utilizando un kit de purificación de ARN. El siguiente protocolo se utiliza para obtener suero de sangre periférica. Las muestras utilizadas en este estudio fueron recolectadas de pacientes que presentaban fiebre, exantema, artralgia u otros síntomas relacionados de infección por arbovirus en el estado de Pernambuco, Brasil.

1. Recolectar muestras de sangre periférica de pacientes sospechosos de infección por arbovirus. Realizar venopunción (tubo de sangre total) utilizando una técnica aséptica estándar. Etiquete los tubos de muestra con un código anónimo y la fecha de recolección de la muestra.
2. Centrifugar la sangre para separar el suero a 2.300 x g durante 10 min. Usando una pipeta, preparar alícuotas de suero (200 μL) que se utilizarán para la extracción de ARN en tubos de 1,5 ml.
   NOTA: Si no es posible realizar la extracción de ARN poco después de la recolección de la muestra, las muestras de suero deben almacenarse a -80 °C antes de las aplicaciones posteriores.
3. Pipetear 560 μL de tampón AVL (tampón de lisis viral) preparado que contiene el ARN portador en un tubo de 1,5 ml. Agregue 140 μL de suero a la mezcla de Buffer AVL/ARN portador en el tubo. Mezclar por vórtice de pulso durante 15 s.
4. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego centrifugar brevemente la muestra para recoger el contenido en el fondo del tubo. Añadir 560 μL de etanol (96%-100%) a la muestra y mezclar por vórtice de pulso durante 15 s. Después de mezclar, centrifugar la muestra para recoger el contenido en el fondo del tubo.
5. Añadir con cuidado 630 μL de la solución a partir del paso 9.4 a la columna de centrifugado sin humedecer el borde. Después de este paso, cierre la tapa y centrifugar a 6.000 x g durante 1 min. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml y deseche el tubo de recolección usado que contiene el filtrado.
6. Abra con cuidado la columna de centrifugado y repita el paso 9.5. Abra con cuidado la columna de centrifugado y añada 500 μL de tampón AW1 (tampón de lavado 1). Cierre la tapa y centrifugar a 6.000 x g durante 1 min. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml y deseche el tubo de recolección usado que contiene el filtrado.
7. Abra con cuidado la columna de centrifugado y añada 500 μL de tampón AW2 (tampón de lavado 2). Cierre la tapa y centrifugar a 20.000 x g durante 3 min. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml y deseche el tubo de recolección usado que contiene el filtrado.
8. Para evitar la contaminación por tampón residual AW2, que podría causar problemas en las reacciones enzimáticas aguas abajo, coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml y deseche el tubo de recolección usado con el filtrado. Centrifugar a 20.000 x g durante 1 min.
9. Coloque la columna de centrifugado en un tubo limpio de 1,5 ml y deseche el tubo de recolección usado con el filtrado. Abrir con cuidado la columna de centrifugado y añadir 60 μL de tampón AVE (tampón de elución) equilibrado a temperatura ambiente. Después de este paso, cierre la tapa e incube a temperatura ambiente durante 1 minuto.
10. Centrifugadora a 6.000 x g durante 1 min. El ARN eluyido se puede utilizar como entrada para NASBA y RT-qPCR en paralelo.
11. Siga los pasos 8.3 a 8.11 para realizar la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos y las reacciones libres de células basadas en papel utilizando 1 μL de ARN del paciente extraído, asegurándose de incluir reacciones de control negativas y positivas. Después de las reacciones, prepare la placa de reacción de 384 pocillos y ejecute el ensayo en el dispositivo lector de placas portátil a 37 °C (ver detalles en el Protocolo suplementario).
    NOTA: Dos concentraciones de ARN de 10⁴ y 10² UFP/ml, extraídas del virus del Zika cultivado, se utilizan como controles positivos para todos los experimentos durante la validación clínica. Además de los controles mencionados anteriormente, es importante incluir también el disparador (10 ng/μL) como control positivo.
12. Al final de cada experimento, los datos sin procesar (archivo .csv) del lector de placas prtable se pueden cargar en una base de datos segura en línea. Además, el lector de placas portátil genera un informe que indica si las muestras son positivas o negativas para el virus Zika (Figura 6); consulte la sección de resultados representativos para ver ejemplos de todos los gráficos obtenidos durante la incubación (Figura 7).
    NOTA: Los usuarios también pueden transferir archivos desde el lector de placas portátil a su propio ordenador a través del USB.

10. Dispositivo lector de placas portátil

1. El dispositivo lector de placas portátil (Figura 8) se puede utilizar como alternativa a un lector de placas convencional²⁴. Para el protocolo y los resultados representativos, véase Protocolo suplementario.

11. RT-qPCR para la detección del virus del Zika

NOTA: Esta sección describe los pasos para realizar la RT-qPCR para la detección del virus del Zika a partir de muestras de pacientes (consulte Protocolo suplementario).

1. Para evitar la contaminación, ensamble los componentes RT-qPCR en un área aislada del proceso de amplificación (por ejemplo, campana limpia). Coloque el tampón RT-qPCR, las enzimas y el cebador/sondas sobre hielo o un bloque frío. Después de esto, agregue las reacciones a una placa de 384 pocillos sobre hielo de acuerdo con la Tabla 9.
   NOTA: Se recomienda el control negativo (control de extracción y control sin plantilla [NTC]) y el control positivo (10⁴ UFP/ml) para todos los experimentos.
2. Después de agregar los reactivos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo (no vórtice) y dispense 6,5 μL en cada pocillo. Añadir 3,5 μL de cada plantilla de ARN por triplicado.
3. Coloque una película de PCR sobre la parte superior de la placa. Centrifugar la placa de 384 pocillos a 600 x g durante 2 min.
4. Coloque la placa en una máquina RT-qPCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo descritas en la Tabla 10. Para analizar los resultados, utilice el software de diseño y análisis de la máquina RT-qPCR y considere el umbral automático y la línea de base (consulte los detalles en el Protocolo suplementario).

Tabla 9: Componentes de RT-qPCR para amplificar el ARN del virus del Zika según el protocolo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades-CDC USA para detectar el virus del Zika a partir de muestras de pacientes³¹.

Tabla 10: Condiciones de ciclismo para RT-qPCR.

Siguiendo la tubería de diseño computacional, la construcción de tres interruptores de punto de apoyo se realizó mediante PCR. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2). La presencia de una banda clara de alrededor de 3.000 pb, aproximadamente del tamaño del gen lacZ acoplado a un interruptor de punto de apoyo, generalmente indica una reacción exitosa. Alternativamente, un carril sin banda, múltiples bandas o una banda del tamaño incorrecto, indica una PCR fallida. En el caso de una PCR fallida, se deben optimizar las condiciones de reacción y/o las secuencias de cebador.

Los interruptores de punto de apoyo ensamblados se examinaron para evaluar cada sensor contra su respectivo ARN de gatillo transcrito in vitro (Figura 3). Mientras que los tres sensores mostraron una mayor absorbancia OD570 , el interruptor 27B (Figura 3A) tuvo la velocidad de encendido más rápida. Los interruptores 33B y, en menor medida, 47B mostraron un aumento de la absorbancia OD570 en ausencia de ARN desencadenante objetivo, lo que indica que estos interruptores poseen alguna actividad de fondo o fugas (Figura 3B, C), un rasgo no deseado en un sensor candidato, ya que puede reducir la especificidad. Para identificar más claramente el sensor con la relación de señal ON/OFF más alta, se calculó el cambio de plegado de la absorbancia OD570 (consulte la sección 5 de información complementaria) y se trazó (Figura 4). A partir de este análisis, queda claro que el interruptor 27B es el sensor que tiene el mejor rendimiento con una relación ON / OFF de alrededor de 60.

La sensibilidad del interruptor de punto de apoyo de alto rendimiento (27B) se evaluó determinando la concentración de ARN más baja requerida para activar el interruptor de punto de apoyo cuando se combina con una reacción NASBA. El gráfico ilustra que los sensores de Zika de mayor rendimiento pueden detectar ARN en concentraciones tan bajas como 1.24 moléculas por μL (equivalente a ~ 2 aM; Figura 5).

Después de identificar y validar el interruptor 27B, los materiales del sensor se distribuyeron a los miembros del equipo en Recife, en el estado brasileño de Pernambuco. En Brasil, la precisión diagnóstica clínica de la plataforma de diagnóstico del virus del Zika se evaluó utilizando muestras de pacientes con el virus del Zika, en paralelo con RT-qPCR para la comparación. Para validar la plataforma de diagnóstico Zika basada en papel, se utilizó el lector de placas portátil, que es capaz de incubar y leer la salida colorimétrica de los sensores basados en papel. El cambio de color de amarillo a púrpura se utiliza para identificar una muestra positiva, mientras que una muestra negativa permanece amarilla (Figura 6). Una opción adicional para visualizar los resultados generados por el lector de placas portátil (Figura 8) es trazar la respuesta colorimétrica para cada reacción basada en papel a lo largo del tiempo. Las muestras se analizaron por triplicado y las que excedieron el umbral (línea roja establecida en 1) se consideraron positivas, mientras que las muestras por debajo del umbral se consideraron negativas (Figura 6 y Figura 7).

Finalmente, para evaluar y comparar el rendimiento clínico del sensor del interruptor del punto de apoyo del Zika con el método estándar de oro actual para diagnosticar la infección por el virus del Zika, todas las muestras de pacientes se analizaron en paralelo con RT-qPCR. La gráfica de amplificación de dos muestras representativas de pacientes se probó por triplicado para la detección del virus Zika mediante RT-qPCR (Figura 9). Las muestras se consideran positivas cuando el valor del umbral del ciclo (Ct) es ≤38; la línea roja indica una muestra positiva y la línea azul indica una muestra negativa para el virus Zika.

Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa para evaluar la calidad de los productos de PCR. Los productos de PCR se analizan en un gel de agarosa al 1% en 1X TAE, ejecutado a 80 V durante 90 min. Una sola banda transparente generalmente indica una reacción exitosa. Carril 1: escalera de ADN de 1 kb; Carriles 2-4: 27B cambian el ADN, el ADN de activación 33B y el ADN de activación 47B, respectivamente. Los números en el lado izquierdo representan el tamaño de la banda en bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Creación de prototipos de tres interruptores de punto de apoyo para sensores Zika basados en papel. El rendimiento de tres sensores de interruptor de punto de ARN basados en papel se midió a 37 °C durante más de 130 min. Cada gráfico contiene dos trazas, una representa el control de solo interruptor, mientras que la otra representa el interruptor y el disparador. Los tres gráficos representan datos adquiridos utilizando los sensores de interruptor de punto de apoyo 27B (A), 33B (B) y 47B (C). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de tres réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los sensores de mayor rendimiento se identifican calculando el cambio de plegado en la absorbancia a 570 nm. El cambio de plegado (o relación máxima de encendido/apagado) se calcula midiendo la relación de absorbancia (OD570) a los 130 min entre el control de solo interruptor y el interruptor más el ensayo CFPS de disparo. Las barras de error representan SEM a partir de tres réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Evaluación de la sensibilidad del switch de alto rendimiento. El ARN del Zika transcrito in vitro se ajusta a las reacciones NASBA. Después de una incubación de 1 h, las reacciones se agregaron a las reacciones PURExpress libres de células en discos de papel en una proporción de 1: 7. Se traza el cambio de pliegue después de 130 min a 37 °C. Esta cifra ha sido reproducida de24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Página de captura del lector de placas portátil cargada con datos de imagen capturados. Esta figura muestra una imagen de muestra de la imagen final capturada por el lector de placas portátil durante una ejecución de recopilación de datos. El sello de fecha/hora original es visible en la parte superior de la imagen. El color amarillo indica control o reacciones negativas, y el color púrpura indica una reacción positiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Modo de análisis de datos. A la izquierda, los usuarios seleccionan los conjuntos de datos que les gustaría trazar; Los gráficos se muestran a la derecha con colores únicos para cada muestra o conjunto de control. La línea roja discontinua sirve como umbral para determinar muestras positivas y negativas. Las muestras analizadas por triplicado que superan el umbral se consideran positivas, mientras que las muestras por debajo del umbral se consideran negativas. Las barras de error representan la desviación estándar (DE) de tres réplicas. Ctrl 1 a Ctrl 5 indica controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. PLUM, un lector de placas portátil. Este lector de placas portátil actúa como un laboratorio en una caja y sirve como un lector de placas con temperatura controlada para incubar y monitorear reacciones colorimétricas. Este dispositivo portátil puede proporcionar mediciones cuantitativas y de alto rendimiento de los sensores de Zika en papel en el sitio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Gráfica RT-qPCR de la amplificación de dos muestras de pacientes analizadas por triplicado para la detección del virus Zika. Las muestras se consideran positivas cuando el valor del umbral del ciclo (Ct) es ≤38. La línea roja punteada sirve como umbral para determinar muestras positivas y negativas. La traza roja indica una muestra positiva y la traza azul indica una muestra negativa. El valor de ΔRn (delta Rn) representa la magnitud normalizada de la señal de fluorescencia detectada por el instrumento RT-qPCR para todas las muestras analizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Cifras suplementarias. Haga clic aquí para descargar estas cifras. 

K.P. y A.A.G. son coinventores de tecnologías relacionadas con el sensor de punto de apoyo basado en papel. Y.G., S.C. y K.P. son cofundadores de LSK Technologies, Inc. y son coinventores de las tecnologías relacionadas con PLUM. M.K., K.P. y A.A.G. son cofundadores de En Carta Diagnostics Ltd. Otros autores no tienen conflictos de intereses. Patentes: Dispositivo PLUM: Y.G., S.C. y K.P. La solicitud de patente fue presentada por la Universidad de Toronto y asignada a LSK Technologies Inc. Solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 62/982,323 presentada el 27 de febrero de 2020; Patente del interruptor de punto de apoyo: A.A.G., P.Y., y J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patent. WO2014074648A3 presentada el 6 de noviembre de 2012; Patente de diagnóstico basada en papel: K.P. y J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" patente estadounidense pendiente No. US15/963.831 presentada el 6 de diciembre de 2013; Patente 1 sobre Zika: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. y J.J.C., "Plataforma portátil de detección de virus e identificación de cepas de bajo costo", Solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 62/403,778 presentada el 4 de octubre de 2016; Patente 2 sobre Zika: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. y J.J.C., "Plataforma portátil de detección de virus e identificación de cepas de bajo costo", Solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 62/341,221 presentada el 25 de mayo de 2016.