Los ensayos ACT1-CUP1 determinan las sensibilidades específicas del sustrato de los mutantes espliceosomales en levaduras en ciernes

Resumen

El ensayo ACT1-CUP1, un ensayo de crecimiento de cobre, proporciona una lectura rápida del empalme del ARN mensajero precursor (pre-ARNm) y el impacto que los factores de empalme mutante tienen en la función espliceosomal. Este estudio proporciona un protocolo y destaca la personalización posible para abordar la cuestión de empalme de interés.

Resumen

Las mutaciones introducidas en el espliceosoma o su sustrato han contribuido significativamente a nuestra comprensión de las complejidades de la función espliceosomal. Ya sea relacionada con la enfermedad o seleccionada funcionalmente, muchas de estas mutaciones se han estudiado utilizando ensayos de crecimiento en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae (levadura). El ensayo de crecimiento de cobre específico de empalme, o ensayo ACT1-CUP1, proporciona un análisis exhaustivo de la mutación a nivel fenotípico. El ensayo ACT1-CUP1 utiliza reporteros que confieren tolerancia al cobre cuando se empalma correctamente. Por lo tanto, en presencia de cobre, los cambios en la viabilidad de la levadura se correlacionan con los cambios en la producción de ARNm a través del empalme. En un experimento típico, el espliceosoma de levadura es desafiado con diferentes reporteros de empalme sin consenso y la mutación del factor de empalme de interés para detectar cualquier impacto sinérgico o antitético en el empalme. Aquí se da una descripción completa de la preparación de la placa de cobre, el recubrimiento de las células de levadura y la evaluación de los datos. Se describe una selección de experimentos complementarios, destacando la versatilidad de los reporteros ACT1-CUP1. El ensayo ACT1-CUP1 es una herramienta útil en la caja de herramientas de empalme gracias a la lectura directa de los efectos mutacionales y las posibilidades comparativas del uso continuo en el campo.

Introducción

El espliceosoma es una gran máquina biológica que cataliza la eliminación de intrones, regiones no codificantes en el ARN mensajero precursor (pre-ARNm)^1,2. La caracterización del efecto de un mutante de un solo punto en 1 de las casi 100 proteínas y 5 ARN no codificantes es a menudo ambigua cuando se estudia la proteína o el ARN de forma aislada. El cambio en la función del componente mutado se puede evaluar mejor in vivo en el contexto del espliceosoma completo y funcional.

El ensayo de crecimiento de cobre descrito aquí es un indicador rápido de la eficiencia de empalme en Saccharomyces cerevisiae o levadura en ciernes. Desarrollado por C.F. Lesser y C. Guthrie y publicado en 1993, este ensayo combina la facilidad de trabajar con un organismo modelo simple y la lectura directa de la viabilidad celular³. La viabilidad se correlaciona con qué tan bien los espliceosomas en estas células pueden reconocer y empalmar la transcripción del reportero.

Este ensayo de crecimiento de cobre se denomina más comúnmente ensayo ACT1-CUP1. El nombre ACT1-CUP1 se origina a partir de los dos genes fusionados para crear un reportero de eficiencia de empalme. ACT1 es el gen de la actina de la levadura, que está altamente expresado y tiene un intrón empalmado eficientemente ^4,5. Cup1p es un quelante de cobre que secuestra cobre en la célula para evitar la interferencia con las funciones celulares regulares ^6,7,8. El reportero ACT1-CUP1 contiene estos genes en secuencia tal que CUP1 está en el marco de lectura adecuado solo si se produce un empalme previo al ARNm del intrón de ACT1 (Figura 1). La proteína de fusión resultante contiene los primeros 21 aminoácidos de actina y la proteína Cup1p de longitud completa, lo que aumenta la viabilidad de la levadura en un ambiente rico en cobre³. Por lo tanto, un aumento en la cantidad de empalme del reportero da como resultado una mayor concentración de Cup1p y una mayor resistencia al cobre (Figura 1). En comparación con otros genes reporteros, CUP1 afecta la viabilidad celular incluso a niveles bajos, tiene un amplio rango de sensibilidad y puede usarse para seleccionar directamente mutaciones de empalme ^3,6,7. Además, CUP1 no es esencial para el crecimiento estándar de la levadura y, por lo tanto, la homeostasis celular no se ve afectada durante la configuración de este ensayo. Complementario a los ensayos de deleción o crecimiento de temperatura, ACT1-CUP1 proporciona información sobre los efectos sobre el empalme en condiciones óptimas de crecimiento de levadura.

El espliceosoma reconoce su sustrato a través de tres secuencias intrónicas, a saber, el sitio de empalme de 5' (5' SS), el sitio de ramificación (BS) y el sitio de empalme de 3' (3' SS). Se han generado numerosos reporteros ACT1-CUP1 que contienen secuencias no consensuadas en estos sitios. Una selección de los reporteros ACT1-CUP1 más comunes se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1. Como el espliceosoma interactúa con cada sitio de empalme de forma única en diferentes puntos del ciclo de empalme, la robustez del espliceosoma se puede probar en diferentes pasos en función de qué informador sin consenso se utiliza. Los reporteros sin consenso se nombran por la posición mutada dentro del intrón y la base a la que fue mutado. Por ejemplo, A3c es un reportero con una mutación en el SS 5', específicamente la posición 3 de la adenosina de consenso a una citosina. Este reportero interactuará fuertemente con las mutaciones del espliceosoma que afectan la selección y el uso de 5' SS. En su estudio inicial, Lesser y Guthrie determinaron qué mutaciones 5' SS inhibían el empalme³. Más tarde, el mismo año, Burgess y Guthrie publicaron reporteros sin consenso en los tres sitios de empalme en una pantalla supresora de mutaciones en la ATPasa Prp16p⁹. Comparando el consenso con los reporteros sin consenso, el ensayo ACT1-CUP1 ha sido una clave importante para comprender la robustez y selectividad del espliceosoma de levadura e inferir la función de los espliceosomas de otros eucariotas.

A medida que los reporteros ACT1-CUP1 sin consenso sensibilizan al espliceosoma a una mayor perturbación, el impacto de una sola mutación del factor de empalme puede caracterizarse a través de los reporteros que impacta positiva o negativamente. Esto se ha aplicado al empalme de preguntas de investigación de varias maneras. En primer lugar, el ensayo ACT1-CUP1 puede y ha sido utilizado como una pantalla genética para mutaciones en los factores de empalme. Por ejemplo, Prp8p, la proteína de empalme más grande, sirve como una plataforma sobre la cual el núcleo de ARN del espliceosoma cataliza la reacción de empalme. Esto se dedujo, en parte, a través de cómo los mutantes Prp8p mejoraron o redujeron el empalme de diferentes reporteros ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Otros componentes proteicos del espliceosoma también se han investigado utilizando ACT1-CUP1, incluyendo Hsh155p, Cwc2p, Cef1p y Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Los umbrales energéticos para Prp16p y otras cuatro ATPasas involucradas en la transición espliceosomal también se han estudiado con este ensayo 9,26,27,28,29,30. Los ARN nucleares pequeños (snRNAs) también se han estudiado ampliamente utilizando ACT1-CUP1 para identificar las secuencias de pre-ARNm que coordinan y los cambios en la estructura secundaria que sufren los snRNAs durante el empalme 3,31,32,33,34,35,36,37.

El ensayo ACT1-CUP1 requiere una cepa de levadura donde todas las copias del gen CUP1 han sido eliminadas. Como CUP1 puede tener un alto número de copias ^6,38, la preparación de una cepa knock-out completa puede requerir múltiples rondas o un cribado extenso. Como resultado, las cepas de levadura cup1Δ a menudo se han compartido entre laboratorios, al igual que los reporteros.

Si se evalúan mutaciones en un factor de empalme a partir de una copia plásmida, el gen de tipo salvaje para este factor debe ser eliminado. Además, el fondo de levadura debe permitir la selección de al menos dos plásmidos, uno que contenga un reportero ACT1-CUP1, históricamente en un plásmido de selección de nutrientes de leucina, y otro que contenga una mutación o perturbación en la maquinaria de empalme que se estudiará (Figura 2). Por lo general, en un solo ensayo, varias cepas de levadura, cada una con la perturbación de empalme de consulta (QSP) y un reportero diferente, probarán el impacto de la consulta en el empalme.

Las variables independientes en el ensayo ACT1-CUP1 permiten al investigador evaluar la gravedad de un QSP. Estas variables independientes son la concentración de cobre y la selección de múltiples reporteros de empalme sin consenso. En primer lugar, como las cepas de levadura se cultivan en placas que contienen un rango de concentraciones de cobre (Figura 2), la configuración del ensayo incluye la selección del gradiente de concentraciones utilizadas. Los estudios pueden utilizar un gradiente de concentración de cobre de curso para obtener una lectura inicial de la viabilidad y luego repetir el ensayo con un gradiente más fino para identificar diferencias sutiles de viabilidad. La segunda variable es la amplia gama de reporteros ACT1-CUP1 posibles de probar (Figura 1 y Tabla 1). Si el QSP afecta la viabilidad de la levadura de manera diferente en presencia de un informador sin consenso versus de tipo salvaje, se puede concluir que el QSP afecta un paso en el empalme o una región del espliceosoma importante durante el reconocimiento o procesamiento de esa región del intrón.

La caja de herramientas de levadura es extensa, y el ensayo ACT1-CUP1 es una parte integral de la investigación de empalme. El ensayo ACT1-CUP1 a menudo se realiza junto con un análisis genético, estructural y / o bioquímico más profundo sobre el impacto de un QSP. Como estos estudios más detallados generalmente tienen un procedimiento más largo y / o un precio más alto, un enfoque frecuente es la detección de mutantes interesantes con ACT1-CUP1 primero.

Aquí se proporciona un protocolo de ensayo ACT1-CUP1, incluida la preparación de la placa de cobre. Este ensayo proporciona a los investigadores una respuesta inicial al efecto de un QSP en el empalme y qué regiones intrónicas se ven más afectadas por la perturbación.

Protocolo

1. Construcción de la cepa de levadura

1. Generar u obtener una cepa de S. cerevisiae cuyo fondo incluya leu2 y cup1Δ. Para generar este fondo, utilice el método de levadura bien establecido que emplea acetato de litio y ADN monocatenario³⁹.
   NOTA: Las cepas de levadura haploide pueden contener una, dos o más copias de CUP1 ^6,38. Consulte la información genómica de la cepa de levadura seleccionada al diseñar cebadores knock-out para flanquear la(s) ubicación(es) del gen CUP1.
2. Realizar una transformación de levadura para incorporar el QSP ya sea a través de la incorporación genómica o en un plásmido. Utilizar un protocolo bien establecido como los descritos en investigaciones previas^40,41,42.
3. Realizar una transformación de levadura con la(s) cepa(s) resultante(s) del paso 1.2. para agregar el plásmido reportero ACT1-CUP1 deseado.
   NOTA: Las células deben mantenerse en placas y medios de leucina (-Leu) para asegurar la retención de los plásmidos reporteros ACT1-CUP1 después de esta transformación.
4. Realice los pasos 1.2. y 1.3. para cada QSP y cada plásmido reportero ACT1-CUP1 que se vaya a probar, incluidas las cepas de control.

2. Preparación de la placa de cobre

1. Seleccione un rango de concentración de cobre que se adapte a los reporteros que se someterán a la prueba (consulte la Tabla 1 para la letalidad de los reporteros de uso frecuente).
   NOTA: Un ejemplo de un rango de concentración de cobre integral es 30 concentraciones diferentes de cobre de 0 mM, 0.025 mM, 0.05 mM, 0.075 mM, 0.1 mM, 0.15 mM, 0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM y 2,5 mM Cu²⁺.
2. Hacer una solución madre de 1 M CuSO₄ y filtro estéril a través de un filtro estéril PES (polietersulfona) de 0,22 μm.
3. Por placa de cobre deseada, prepare una dilución de 2 ml del stock de CuSO₄ en agua estéril.
   NOTA: Como la placa con 0 mM Cu 2+ siempre será analizada y fotografiada como referencia, se recomienda hacer dos placas de 0 mM Cu²⁺, una al principio y otra al final del paso de recubrimiento (paso 3.4.).
   1. Calcule la cantidad de existencias para la concentración final deseada de cobre en 40 ml del volumen de la placa (Tabla suplementaria 1).
   2. Agregue la cantidad calculada de agua estéril y 1 caldo de CuSO₄ M a un tubo estéril de 2 ml.
4. Placas de vertido para el ensayo ACT1-CUP1.
   NOTA: Una alternativa al protocolo a continuación es combinar inicialmente el medio y el agar en un recipiente grande y alícuota después de esterilizarlos en autoclave en recipientes más pequeños para lograr diferentes concentraciones de cobre para cada placa. Cualquiera que sea el método que se tome, es importante asegurarse de que la concentración del medio sea consistente entre todas las placas a pesar de que cada una tenga una concentración de cobre diferente.
   1. Etiquete cada plato vacío para ser vertido con la concentración final de cobre que contendrá. Prepare al menos una placa cuadrada por concentración de cobre para ser probada.
   2. Etiquete una botella de 100 ml por concentración de cobre a analizar.
   3. A cada botella, agregue 790 mg de agar (2% p/v de agar) y una barra de agitación.
   4. En un vaso de precipitados grande, combine el medio de crecimiento -Leu para que se viertan todas las placas de cobre. Por placa a hacer, disuelva 265 mg de base de nitrógeno de levadura (YNB) y 64 mg de mezcla de abandono menos leucina (y cualquier otro nutriente que pueda ser necesario para mantener el plásmido QSP en las células) en 34 ml de agua desionizada.
   5. Agregue 34 ml de la solución de medios de cultivo -Leu a cada botella de 100 ml preparada y tapa con papel de aluminio. Etiquete la lámina con la concentración de cobre prevista.
   6. Autoclave para esterilizar y disolver el agar utilizando el ciclo líquido recomendado para el autoclave.
   7. Tan pronto como sea posible, agregue 4 ml de glucosa al 20% p/v (filtrada estéril) a cada botella.
   8. Haga coincidir las etiquetas y agregue las diluciones de 2 ml de CuSO₄ a su botella prevista.
      NOTA: Como se pueden hacer decenas de placas de cobre al mismo tiempo, cada una con una concentración diferente, etiquetar todas las botellas, tubos y placas claramente con la concentración de cobre prevista evitará confusiones durante el vertido de la placa.
   9. Use una placa de agitación para mezclar durante ~ 30 s y vierta o pipete 35 ml en la placa etiquetada, evitando burbujas. Dejar enfriar antes de almacenar o usar.
      NOTA: Con frecuencia, las placas se fabrican 1 día o 2 días antes del ensayo y se almacenan a 4 °C hasta unas horas antes de su uso. Las placas deben estar a temperatura ambiente (RT) antes de que comience el recubrimiento (paso 3.4.).

3. Ensayo ACT1-CUP1

1. Raye las cepas deseadas en placas de -Leu.
   NOTA: Si se trabaja con crioexistencias, se debe tener cuidado para garantizar que las células se reactiven lo suficiente del almacenamiento antes del recubrimiento. Un procedimiento recomendado para esto es salir del stock criogénico y dejar que crezca durante 3-5 días a 30 ° C. Luego, retome una pequeña muestra y déjela crecer durante otros 2-3 días a 30 ° C.
2. Cultive cultivos nocturnos en 10 ml de medios.
   1. Preparar los medios de cultivo -Leu utilizando las mismas proporciones que se describen en el paso 2.4.2. Por 10 ml de medio, agregue 66 mg de base de nitrógeno de levadura (YNB) y 16 mg de mezcla de abandono menos leucina a 9 ml de agua desionizada. Pasar a través de un filtro estéril PES de 0,22 μm.
   2. Por cepa de levadura, añadir 9 ml de medios de cultivo -Leu y 1 ml de glucosa al 20% p/v (filtrada estéril) a un tubo cónico estéril de 50 ml.
   3. Usando un palo estéril o una punta de pipeta, reúna una pequeña muestra de levadura (~ 1 mm redonda) e inocule el medio.
   4. Agitar todos los cultivos nocturnos a 180 rpm y 30 °C.
      NOTA: Si está disponible, se pueden usar rotadores en lugar de un agitador.
3. Diluir las cepas a un OD₆₀₀ 0.5 ± 0.05 en 10% de glicerol.
   1. Por cepa, añadir 100 μL de cultivo a una cubeta que contenga 900 μL de agua.
   2. Mida el OD₆₀₀ con un espectrofotómetro.
   3. Calcular la dilución requerida para estar en un OD₆₀₀ de 0.5 en un volumen final de 2 mL.
   4. Diluir cada cepa a OD₆₀₀ 0.5 en glicerol al 10% (estéril).
   5. Vuelva a medir el OD₆₀₀ para confirmar que la densidad celular está dentro del rango deseado de 0,5 ± 0,05.
4. Coloque las tensiones en las placas de cobre.
   NOTA: Se puede utilizar una variedad de métodos para chapar las cepas, incluido el pipeteo manual de volúmenes de 5-10 μL, el uso de un pipetor repetido o multicanal, o el estampado con un replicador de pines. Este último método se describe a continuación, aunque la mayoría de los pasos serán similares independientemente del método.
   1. Establezca un lugar de trabajo estéril y un quemador Bunsen encendido.
   2. Para un replicador de 48 pines, pipetear 200 μL de cada cepa diluida en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos. Llene los espacios vacíos en la cuadrícula de 6 x 8 con 200 μL de glicerol al 10% (estéril).
      NOTA: Un ejemplo de un esquema de recubrimiento para nueve cepas de levadura se encuentra en la Tabla Suplementaria 2.
   3. Sumerja el replicador en una placa poco profunda de etanol al 95% (v / v) y llama para esterilizar. Deje enfriar durante al menos 2 minutos después de que la llama se extinga para evitar que el calor choque las células.
   4. Coloque cuatro placas cerca del quemador y retire las tapas.
   5. Sumerja el replicador en la placa de 96 pocillos y levántelo en un movimiento rápido.
   6. Coloque suavemente sobre el plato y balancee ligeramente hacia adelante y hacia atrás para facilitar una buena transferencia.
   7. Levante en un movimiento rápido y colóquelo exactamente en la misma orientación en la placa de 96 pocillos.
   8. Repita para hasta otros tres platos. Repita el proceso de sumergir el replicador en etanol, flamear para esterilizar y esperar a enfriar cada cuatro placas.
   9. Después de que se haya plateado una placa, muévala con un movimiento suave hacia un lado, pero aún dentro del paraguas de esterilización de la llama.
      NOTA: Se recomienda hacer las diluciones de levadura y el recubrimiento cerca de una llama. Las placas pueden contaminarse fácilmente durante el secado.
   10. Deje que las placas se sequen completamente antes de colocar las tapas, generalmente 3-5 min.
   11. Incubar las placas durante 3 días a 30 °C.

4. Recopilación y análisis de datos

1. Retire las placas de la incubadora e inspecciónelas visualmente.
2. Grabe las imágenes de las placas con una cámara disponible u otro sistema de imágenes digitales.
3. Registrar (o puntuar) para cada cepa se observa el último crecimiento visible de la concentración de cobre.
   NOTA: Las células son capaces de empalmar y permanecer viables hasta esa concentración. Para mantener la consistencia, utilice siempre el mismo método, ya sea a simple vista o a partir de las imágenes de la placa, para marcar la última concentración de cobre viable. Las colonias muy pequeñas a veces son visibles a simple vista, pero no en la imagen. La diferencia entre la inspección visual directa o la grabación de imágenes es pequeña, generalmente un paso en el gradiente. Como las imágenes de las colonias se utilizan a menudo en las publicaciones, se recomienda puntuar por las imágenes.
4. Combine datos de múltiples ensayos ACT1-CUP1 para la misma cepa para sacar conclusiones sobre cómo el QSP afecta el empalme.
   NOTA: Las cifras de publicación suelen mostrar imágenes de las colonias de levadura a una concentración de 0 mM Cu²⁺ , la última concentración viable de cobre y la concentración posterior donde la colonia ha muerto. Los datos también se pueden mostrar como un gráfico de barras con barras de error para la desviación estándar entre réplicas. No es necesario normalizar los datos, pero sí establecerán la viabilidad del control del factor de empalme WT en 1 y compararán el efecto de la(s) mutación(es) introducida(s).

Resultados

Los ensayos de crecimiento, como ACT1-CUP1, requieren la evaluación visual y comparativa de múltiples colonias. Aquí, cada cepa se cultivó hasta la saturación durante la noche, se diluyó a un OD₆₀₀ de 0.5 y se chapó en 20 placas que contienen un rango de concentraciones de cobre de 0 mM a 1.1 mM_CuSO4 (Figura 3). Este rango es menor que el enumerado en el protocolo, ya que permitió la evaluación completa del impacto de los QSP y los reporteros ACT1-CUP1 utilizados y desc...

Discusión

ACT1-CUP1 es un ensayo de crecimiento, y se debe tener cuidado para garantizar que las diferencias de crecimiento observadas solo puedan atribuirse a defectos de empalme. Todas las cepas deben manipularse de manera similar antes del enchapado, incluyendo tener una longitud y un tipo similares de crecimiento y condiciones de almacenamiento. Si se utilizan cepas sensibles a la temperatura, los ensayos ACT1-CUP1 solo deben realizarse en condiciones en las que esas cepas crezcan de manera comparable al tipo silvestre. Relaci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Tubos de microcentrífuga estériles de 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Tubos de centrífuga estériles de 50 mL	Fisher Scientific	07-201-332	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Microplaca de fondo redondo de 96 pocillos	Fisher Scientific	07-200-760	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Etanol de 190 grados	Fisher Scientific	22-032-600	O artículo comparable de otro fabricante.
Sistema de filtro de 500 mL (0,22 y micro; m)	Productos científicos CellTreat	229707	o artículo comparable de un fabricante diferente.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Cualquier agar de grado molecular funcionará.
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Mechero Bunsen	Humboldt	PN6200.1	O artículo comparable de otro fabricante.
Densímetro de celda	VWR	490005-906	U otro dispositivo espectral que pueda medir la absorbancia a 595 nm.
Sulfato de cobre Pentahidratado	Fisher Scientific	LC134051	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Sistema de imagen digital	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (utilizado para la Figura 3),  Amersham ImageQuant 800, o artículo comparable de un fabricante diferente.
Mezcla de gota (-Leu)	USBiológico Ciencias de la Vida	D9525	Utilice la mezcla de gota adecuada para su experimento. Es posible que también utilice un marcador de nutrientes de levadura para la perturbación de su consulta. En ese caso, la mezcla de abandono debe ser para ese marcador y Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Software cuantificador de banda de gel	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (utilizado para la figura 5A) o artículo comparable de un fabricante diferente.
Cámara de mano	Nikon	D3500	O artículo comparable de otro fabricante.
Dispositivo de imágenes de gel de infrarrojo cercano	Cytiva 29238583		Amersham Typhoon NIR (utilizado para la Figura 5a) o un artículo comparable de un fabricante diferente.
Abrazadera de laboratorio	Fisher Scientific	05-769-7Q	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Soporte y abrazadera de laboratorio	Fisher Scientific	12-000-101	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Barras agitadoras magnéticas	Fisher Scientific	14-513-51	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Replicador de pines	VP Scientific	VP 407AH
Cubetas semimicro desechables	VWR	97000-590	O artículo comparable de otro fabricante.
Agitador	JEIO Tech	IST-3075	O artículo comparable de un fabricante diferente.
Espectrofotómetro	Biowave	80-3000-45	O cualquier espectrofotómetro que pueda medir la absorbancia a 600 nm.
Placas cuadradas	VWR	102091-156	También se pueden utilizar placas circulares, aunque son más difíciles si se utiliza un replicador de pines.
Plato de agitación	Fisher Scientific	11-520-16S	O un artículo comparable de un fabricante diferente.
Base de nitrógeno de levadura	USBiological Life Sciences	Y2025	O artículo comparable de un fabricante diferente.