Artículo de método

La aplicación de enfoques abiertos basados en la búsqueda para la identificación de glicopéptidos ligados a O de Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/63242

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2 de noviembre de 2021

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1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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La búsqueda abierta permite la identificación de glicopéptidos decorados con composiciones de glicanos previamente desconocidas. Dentro de este artículo, se presenta un enfoque simplificado para realizar búsquedas abiertas y posteriores búsquedas de glicopéptidos centrados en glicotecos para muestras bacterianas utilizando Acinetobacter baumannii como modelo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glicosilación de proteínas se reconoce cada vez más como una modificación común dentro de los organismos bacterianos, que contribuye a la fisiología procariota y la infectividad óptima de las especies patógenas. Debido a esto, existe un creciente interés en caracterizar la glicosilación bacteriana y la necesidad de herramientas analíticas de alto rendimiento para identificar estos eventos. Aunque la proteómica de abajo hacia arriba permite fácilmente la generación de datos de glicopéptidos ricos, la amplitud y diversidad de glicanos observados en especies procariotas hacen que la identificación de eventos de glicosilación bacteriana sea extremadamente desafiante.

Tradicionalmente, la determinación manual de las composiciones de glicanos dentro de los conjuntos de datos proteómicos bacterianos hizo de este un análisis en gran medida restringido a expertos específicos del campo. Recientemente, los enfoques abiertos basados en la búsqueda han surgido como una alternativa poderosa para la identificación de modificaciones desconocidas. Al analizar la frecuencia de las modificaciones únicas observadas en las secuencias de péptidos, las técnicas de búsqueda abierta permiten la identificación de glicanos comunes unidos a péptidos dentro de muestras complejas. Este artículo presenta un flujo de trabajo simplificado para la interpretación y el análisis de datos glicoproteómicos, demostrando cómo se pueden utilizar técnicas de búsqueda abiertas para identificar glicopéptidos bacterianos sin conocimiento previo de las composiciones de glicanos.

Usando este enfoque, los glicopéptidos dentro de las muestras se pueden identificar rápidamente para comprender las diferencias de glicosilación. Utilizando Acinetobacter baumannii como modelo, estos enfoques permiten la comparación de composiciones de glicanos entre cepas y la identificación de nuevas glicoproteínas. En conjunto, este trabajo demuestra la versatilidad de las técnicas de búsqueda de bases de datos abiertas para la identificación de la glicosilación bacteriana, lo que hace que la caracterización de estos glicoproteomas altamente diversos sea más fácil que nunca.

Introducción

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La glicosilación proteica, el proceso de unión de carbohidratos a moléculas de proteínas, es una de las modificaciones post-traduccionales (PTM) más comunes en la naturaleza 1,2. En todos los dominios de la vida, ha evolucionado una gama de maquinaria compleja dedicada a la generación de glicoproteínas que afectan a una miríada de funciones celulares 1,3,4,5. Mientras que la glicosilación de proteínas ocurre en una gama de aminoácidos 6,7, los eventos de glicosilación ligados a N y O son dos formas dominantes observadas en la naturaleza. La glicosilación ligada a N implica la unión de glicanos a un átomo de nitrógeno de residuos de asparagina (Asn), mientras que en la glicosilación ligada a O, los glicanos se unen a un átomo de oxígeno de residuos de serina (Ser), treonina (Thr) o tirosina (Tyr)7. A pesar de las similitudes en los residuos dirigidos por los sistemas de glicosilación, las diferencias dentro de los glicanos unidos a las proteínas dan como resultado que la glicosilación sea la clase químicamente más diversa de PTM que se encuentra en la naturaleza.

Mientras que los sistemas de glicosilación eucariota poseen diversidad de glicanos, estos sistemas suelen estar restringidos en el número de carbohidratos únicos utilizados. La diversidad resultante se deriva de cómo estos carbohidratos se organizan en glicanos 8,9,10,11,12. En contraste, las especies bacterianas y arqueas poseen una diversidad de glicanos prácticamente ilimitada debido a la gran variedad de azúcares únicos generados dentro de estos sistemas 2,10,13,14,15,16,17. Estas diferencias en la diversidad de glicanos observadas en todos los dominios de la vida representan un desafío analítico significativo para la caracterización e identificación de eventos de glicosilación. Para la glicosilación eucariota, la capacidad de anticipar las composiciones de glicanos ha facilitado el creciente interés en la glicobiología; sin embargo, no ocurre lo mismo con la glicosilación bacteriana, que todavía está restringida en gran medida al estudio por parte de laboratorios especializados. A medida que la accesibilidad de la instrumentación de espectrometría de masas (EM) ha aumentado en las biociencias, los enfoques basados en la EM son ahora el método principal para el análisis glicoproteómico.

La EM se ha convertido en la herramienta por excelencia para la caracterización de la glicosilación, con enfoques de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba que ahora se usan comúnmente para caracterizar las glicoproteínas6. Mientras que la proteómica de arriba hacia abajo se utiliza para evaluar los patrones globales de glicosilación de proteínas específicas18,19, los enfoques de abajo hacia arriba se utilizan para permitir la caracterización específica de glicopéptidos glicocunos, incluso a partir de mezclas complejas 6,20,21,22,23. Para el análisis de glicopéptidos, la generación de información informativa de fragmentación es esencial para la caracterización de eventos de glicosilación24,25. Una gama de enfoques de fragmentación es ahora rutinariamente accesible en los instrumentos, incluida la disociación inducida por colisión basada en trampas de iones de resonancia (IT-CID), la disociación inducida por colisión de tipo haz (CID) y la disociación por transferencia de electrones (ETD). Cada enfoque posee diferentes fortalezas y debilidades para el análisis de glicopéptidos25,26, con un progreso significativo en la última década en la aplicación de estos enfoques de fragmentación para analizar la glicosilación 6,20. Sin embargo, para el análisis de glicosilación bacteriana, la limitación crítica no ha sido la capacidad de fragmentar glicopéptidos, sino más bien la incapacidad de predecir las posibles composiciones de glicanos dentro de las muestras. Dentro de estos sistemas, la naturaleza desconocida de diversos glicanos bacterianos limita la identificación de glicopéptidos, incluso con herramientas de búsqueda centradas en la glicosilación ahora comunes para el análisis de glicopéptidos eucariotas, como O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 y GlycReSoft29. Para superar este problema, se requiere un método de búsqueda alternativo, con el uso de herramientas de búsqueda abiertas que emergen como un enfoque poderoso para el estudio de la glicosilación bacteriana30.

La búsqueda abierta, también conocida como búsqueda ciega o comodín, permite la identificación de péptidos con PTM desconocidos o inesperados 21,30,31,32. Las búsquedas abiertas utilizan una variedad de técnicas computacionales, incluidas búsquedas de modificación seleccionadas, búsquedas en bases de datos de varios pasos o búsquedas tolerantes de masa amplia 33,34,35,36,37. Aunque la búsqueda abierta tiene un gran potencial, su uso se ha visto obstaculizado típicamente por el aumento significativo de los tiempos de análisis y la pérdida de sensibilidad de la detección de péptidos no modificados en comparación con las búsquedas restringidas31,32. La disminución en la detección de coincidencias péptido-espectrales (PSM) no modificadas es el resultado del aumento de las tasas de PSM falsos positivos asociadas con estas técnicas, lo que requiere un filtrado más estricto para mantener las tasas de falso descubrimiento (FDR) deseadas33,34,35,36,37 . Recientemente, varias herramientas han estado disponibles que mejoran significativamente la accesibilidad de la búsqueda abierta, incluyendo Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 y MSFragger21,41. Estas herramientas permiten la identificación robusta de eventos de glicosilación al reducir significativamente los tiempos de análisis e implementar enfoques para manejar composiciones heterogéneas de glicanos.

Este artículo presenta un método simplificado para la identificación de glicopéptidos bacterianos mediante búsqueda abierta, utilizando como modelo el patógeno nosocomial Gram-negativo, Acinetobacter baumannii. A. baumannii posee un sistema de glicosilación ligado a O conservado responsable de la modificación de múltiples sustratos proteicos, conocido como sistema de glicosilación de la proteína PglL 42,43,44. Mientras que proteínas similares son dirigidas para la glicosilación entre cepas, el sistema de glicosilación PglL es muy variable debido a la biosíntesis del glicano utilizado para la glicosilación de proteínas que se deriva del locus de la cápsula (conocido como K-locus)44,45,46. Esto da como resultado diversos glicanos (también conocidos como unidad K), derivados de unidades K polimerizadas únicas o limitadas, que se agregan a sustratos proteicos 30,44,46. Dentro de este trabajo, se utiliza el uso de la herramienta de búsqueda abierta, MSfragger, dentro del software FragPipe, para identificar glicanos a través de cepas de A. baumannii. Al combinar la búsqueda abierta y la curación manual, se pueden realizar "búsquedas centradas en los glicanos" para mejorar aún más la identificación de glicopéptidos bacterianos. En conjunto, este enfoque de identificación de múltiples pasos permite la identificación de glicopéptidos sin una amplia experiencia en la caracterización de nuevos eventos de glicosilación.

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Protocolo

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NOTA: La preparación y análisis de muestras de glicopéptidos bacterianos se puede dividir en cuatro secciones (Figura 1). Para este estudio se evaluó la glicosilación de tres cepas secuenciadas de A. baumannii (Tabla 1). Las bases de datos Proteome FASTA de cada una de estas cepas son accesibles a través de Uniprot. Consulte la Tabla 2 para conocer la composición de los búferes utilizados en este protocolo.

1. Preparación de muestras de proteínas para análisis proteómicos

  1. Aislamiento de muestras de proteoma de interés
    1. Si usa células enteras, asegúrese de que las células se hayan lavado con una solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los posibles contaminantes proteicos presentes en los medios. Congele las células enteras después del lavado y guárdelas a -80 °C hasta que sea necesario.
    2. Si se utilizan muestras fraccionadas (como preparaciones de membrana), asegúrese de que los reactivos utilizados no interfieran con el análisis de MS (LC-MS) de cromatografía líquida aguas abajo50.
    3. Si se han utilizado detergentes, como dodecil-sulfato de sodio (SDS), Triton X-100, NP-40 o lauroilsarcosina, retire estos detergentes utilizando precipitación de acetona, métodos de preparación de muestras SP351 o columnas de limpieza proteómica comercial como S-traps52. Alternativamente, sustituya los detergentes incompatibles con un detergente compatible con MS o removible, como el desoxicolato de sodio (SDC) o el octil glucopiranósido.
    4. Asegúrese de que todos los artículos de plástico y cristalería que se utilizarán para la preparación de muestras no hayan sido esterilizados en autoclave. La cristalería y los plásticos en autoclave suelen estar muy contaminados con compuestos de pequeño peso molecular, como los polímeros, que se detectan fácilmente dentro de la EM.
  2. Solubilización de muestras de células enteras
    1. Resuspend ~ 10 mg de células lavadas y congeladas al instante en 200 μL de tampón de lisis de desoxicolato de sodio recién preparado (tampón de lisis SDC: 4% SDC en 100 mM Tris, pH 8.5).
      NOTA: Los inhibidores de la proteasa se pueden agregar al tampón de lisis SDC para limitar la degradación de proteínas.
    2. Hervir las muestras durante 10 min a 95 °C con agitación (2000 rpm en un termomezclador), y luego dejar en hielo durante 10 min. Repita este proceso dos veces para garantizar una lisis y solubilización eficientes de las muestras.
      NOTA: Las muestras se pueden almacenar a largo plazo en este punto a -80 °C. Si se almacena, se resolubilice calentando a 95 °C antes de su posterior procesamiento.
  3. Cuantificar las concentraciones de proteínas de la muestra utilizando un ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA)53. Almacene muestras en hielo mientras realiza la cuantificación para limitar la degradación de proteínas.
    NOTA: Para el análisis de proteoma total, 20-100 μg de proteína es más que suficiente para nano LC-MS, que generalmente requiere menos de 2 μg de digestión de proteína por análisis. La preparación del exceso de péptido permite el análisis de réplica o el fraccionamiento adicional si se requiere una cobertura proteómica profunda. Para el análisis basado en el enriquecimiento de glicopéptidos mediante cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), se requieren 100-500 μg de proteína.
  4. Reducir y alquilar muestras.
    1. Añadir 1/10 del volumen de 10x tampón de reducción/alquilación (100 mM Tris 2-carboxietilo fosfina clorhidrato; 400 mM 2-cloroacetamida en 1 M Tris, pH 8.5) a las muestras para una concentración final de 1x e incubar muestras en la oscuridad durante 30 min a 45 °C con agitación a 1.500 rpm.
      NOTA: Verifique el pH del tampón de reducción / alquilación 10x para garantizar un pH de aproximadamente 7.0-8.0 antes de agregar a las muestras, ya que un pH más bajo hará que la SDC se precipite.
  5. Gire brevemente las muestras y agregue las proteasas Tripsina/ Lys-C (~10 μL, resuspendidas en 100 mM Tris, pH 8.5) para una relación proteasa:proteína final de 1:100. Incubar los digestos durante la noche a 37 °C con agitación a 1.500 rpm (hasta 18 h). Para garantizar una digestión completa de las proteínas, use una proporción de proteasa/proteína tripsina/Lys-C de 1:50 a 1:200.
  6. Rescure agregando 1.25 volúmenes de isopropanol 100% a las muestras. Vórtice las muestras durante 1 minuto para mezclarlas y girarlas brevemente hacia abajo.
    NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -20 °C para ser procesadas posteriormente.
  7. Acidifique las muestras agregando 0.115 volúmenes de ácido trifluoroacético (TFA) al 10%; concentración final de ~ 1% TFA), vórtice las muestras y gírqueles brevemente hacia abajo.

2. Procesamiento de muestras de proteoma

  1. Limpieza peptídica de muestras de proteoma
    1. Prepare una punta de extracción de fase inversa de estirenodivinilbenceno (SDB-RPS) para cada muestra como se describió anteriormente54.
      1. Empíricamente, para unir 50 μg de péptido, extirpe tres discos SDB-RPS de una membrana SDB-RPS de 47 mm2 usando una aguja roma (14 G). Para cantidades de péptidos más grandes, aumente el número de discos en consecuencia.
    2. Antes de usar SDB-RPS Stage Tips, prepare las puntas agregando secuencialmente al menos diez volúmenes de lecho de los siguientes tampones y haciendo girar el tampón a través de la columna por centrifugación (25 ° C, 3 min, 500 × g) o empujando el tampón a través de la columna aplicando presión suavemente con una jeringa.
      1. Humedezca las puntas con 150 μL de 100% acetonitrilo.
      2. Lavar las puntas con 150 μL de metanol al 30%, 1% TFA en 18.2 MΩ H2O.
      3. Equilibrar las puntas con 150 μL de isopropanol al 90%, 1% TFA equilibrado con 18,2 MΩ H2O.
    3. Cargue las muestras (que contienen 50% de isopropanol, 1% de TFA) en las puntas de etapa SDB-RPS por centrifugación (25 °C, 3 min, 500 × g) o aplicando presión suavemente con una jeringa.
    4. Lave las puntas de etapa SDB-RPS con los siguientes tampones por centrifugación (25 °C, 3 min, 500 × g) o aplicando presión suavemente con una jeringa.
      NOTA: Se pueden usar lavados adicionales o tampones alternativos para eliminar contaminantes no peptídicos, como el uso de acetato de etilo en lugar de isopropanol55.
      1. Lavar las puntas con 150 μL de isopropanol al 90%, 1% TFA.
      2. Lavar las puntas con 150 μL de TFA al 1% en 18,2 MΩ H2O.
    5. Eluya los péptidos de las puntas de etapa SDB-RPS con 150 μL de hidróxido de amonio al 5% en acetonitrilo al 80% por centrifugación o aplicando presión suavemente con una jeringa. Recoger las muestras en tubos individuales.
      NOTA: Prepare hidróxido de amonio al 5% en acetonitrilo al 80% en un recipiente de plástico inmediatamente antes de usarlo dentro de una campana de humos.
    6. Secar los péptidos eluidos por centrifugación al vacío a 25 °C.
      NOTA: Si se realiza el enriquecimiento HILIC, el 1-10% de los eluidos peptídicos se pueden eliminar en este punto, secar y utilizar como controles de entrada de proteoma total.
  2. Enriquecimiento de muestras de glicopéptidos
    1. Prepare los consejos de etapa de la cromatografía líquida de interacción hidrófila zwitteriónica (ZIC-HILIC) como se describió anteriormente54,56.
      1. Brevemente, extraiga un disco C8 de una membrana47 mm 2 C8 con una aguja roma (14 G) y empaque el disco en una punta P200 para crear una frita. Agregue aproximadamente 5 mm de material ZIC-HILIC, resuspendido en acetonitrilo al 50%, 50% 18.2 MΩ H2O, sobre la fritada aplicando presión suavemente con una jeringa.
    2. Antes de usar ZIC-HILIC Stage Tips, acondicione la resina agregando secuencialmente los siguientes tampones y aplicando presión suavemente con una jeringa.
      NOTA: Para garantizar la integridad de la capa de pseudo-agua en la superficie de la resina ZIC-HILIC (necesaria para enriquecer los glicopéptidos), la resina siempre debe permanecer húmeda. Al lavar la resina, siempre deje ~ 10 μL de solvente por encima de la resina y asegúrese de que los lavados / muestras se canalicen directamente en este solvente residual.
      1. Equilibrar la resina con 20 volúmenes de lecho (200 μL) de tampón de elución ZIC-HILIC (0,1% TFA en 18,2 MΩ H2O).
      2. Lavar la resina con 20 volúmenes de lecho (200 μL) de tampón de preparación ZIC-HILIC (95% acetonitrilo en 18,2 MΩ H2O).
      3. Lavar la resina con 20 volúmenes de lecho (200 μL) de tampón de carga/lavado ZIC-HILIC (80% acetonitrilo, 1% TFA equilibrado con 18.2 MΩ H2O).
    3. Resuspender las muestras digeridas secas (a partir de la etapa 2.1.6) en tampón de carga/lavado ZIC-HILIC a una concentración final de 4 μg/μL (por ejemplo, para 200 μg de péptido, resuspend en 50 μL de tampón de carga/lavado ZIC-HILIC). Vórtice brevemente durante 1 min para asegurar que las muestras se resuspendan, y gire hacia abajo durante 1 min a 2.000 × g a 25 °C.
    4. Cargue la muestra de péptido resuspendido en una columna ZIC-HILIC condicionada.
      1. Lave tres veces con 20 volúmenes de cama (200 μL) de tampón de carga/lavado ZIC-HILIC (para un total de 60 lavados de volumen de cama) aplicando presión suavemente con una jeringa.
      2. Eluye glicopéptidos con 20 volúmenes de lecho (200 μL) de tampón de elución ZIC-HILIC en un tubo de 1,5 ml aplicando suavemente presión con una jeringa y luego secando el eluido mediante centrifugación al vacío a 25 °C.

3. LC-MS de muestras enriquecidas con proteoma/glicopéptido

  1. Resuspend las muestras en Buffer A* (2% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) a una concentración final de 1 μg/μL (por ejemplo, para 50 μg de péptido, resuspend en 50 μL de Buffer A*).
  2. Cargue las muestras en un HPLC/UPLC acoplado a un MS para permitir la separación e identificación de glicopéptidos.
    NOTA: Los parámetros de la columna, incluido el diámetro interior, la longitud, los caudales, el tipo de resina de cromatografía y las cantidades requeridas de inyección de péptidos, deben optimizarse para la configuración analítica y la longitud del gradiente que se utilizará; para ver un ejemplo de cómo llevar a cabo la optimización de las configuraciones analíticas, véase57.
  3. Supervise la recopilación de los datos de EM resultantes, asegurándose de que los datos se recopilan con los parámetros deseados.
    NOTA: Para el análisis composicional, la fragmentación del CID es suficiente. Debido a la adición de glicanos a los glicopéptidos, los iones glicopéptidos se observan típicamente con una mayor m / z y menor densidad de carga que los péptidos no glicosilados. Para garantizar que estos iones sean observables, permita un rango de masa MS1 de 400 a 2.000 m/z.
  4. Fragmento de iones seleccionados utilizando CID, asegurando la recolección de iones fragmentos bajos en m/z que contienen iones de oxonio importantes para la caracterización de glicanos.
    NOTA: La fragmentación de los glicopéptidos utilizando CID está influenciada tanto por las secuencias de péptidos como de glicanos, así como por la energía aplicada durante la fragmentación 25,58,59. Si bien se puede utilizar una gama de diferentes energías de colisión, una estrategia óptima para fragmentar glicopéptidos es el uso de energías de colisión escalonadas que combinan el uso de múltiples energías de colisión 25,59,60.
  5. Utilice métodos de fragmentación alternativos, si están disponibles, como ETD para la localización del sitio, o IT-CID para ayudar en la determinación de las composiciones de glicanos.
    NOTA: Ninguno de estos enfoques de fragmentación es esencial para el análisis de composición, pero se puede recopilar para permitir un mayor interrogatorio de los glicopéptidos de interés.

4. Análisis de muestras enriquecidas con proteoma/glicopéptido

  1. Prefiltración de archivos de datos para permitir la búsqueda en FragPipe
    1. Si se han adquirido análisis ETD o IT-CID dentro de conjuntos de datos, filtre estos eventos de análisis de los archivos de datos mediante MSConvert61 antes de buscar con FragPipe.
      NOTA: Para los parámetros de búsqueda abiertos que se describen a continuación, solo se requieren datos CID de tipo haz.
  2. Realización de búsquedas abiertas en FragPipe
    1. Abra FragPipe y haga clic en la pestaña Flujo de trabajo . En el menú desplegable del flujo de trabajo, seleccione la opción Abrir búsqueda y haga clic en Agregar archivos para importar los archivos de datos que se buscarán en FragPipe (Figura 2A).
    2. Haga clic en la ficha Base de datos e inicie el administrador de descargas haciendo clic en Descargar. Esto permite descargar bases de datos de proteomas de Uniprot utilizando un ID de proteoma de Uniprot. Haga clic en la opción Agregar señuelos y contaminantes dentro del administrador de descargas para incorporar señuelos y proteínas contaminantes en las bases de datos.
    3. Para obtener umbrales FDR más estrictos, haga clic en la ficha Validación y modifique el valor Filtro e informe de 0,01 al FDR requerido.
      NOTA: La configuración predeterminada de FragPipe asegurará un FDR del 1% a nivel de proteína.
    4. Haga clic en la ficha MSfragger . Dentro del cuadro Coincidencia de picos , aumente la tolerancia de masa del precursor de los 500 Da predeterminados a 2.000 Da para permitir la identificación de grandes modificaciones (Figura 2A).
    5. Haga clic en la ficha Ejecutar y defina la ubicación de las salidas de FragPipe. Haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la búsqueda.
  3. Utilizando los PSM identificados en todos los conjuntos de datos (contenidos en las salidas de psm.tsv de FragPipe), identifique los glicanos potenciales trazando la frecuencia de las masas delta observadas dentro de los conjuntos de datos (Figura 3). Cree gráficos de masa delta a partir de salidas de MSfragger utilizando los scripts R accesibles a través de la adhesión PRIDE PXD027820.
    NOTA: El postprocesamiento mínimo de los resultados de búsqueda abierta se lleva a cabo dentro de estos scripts, ya que el propósito principal de estos scripts es ayudar en la visualización de perfiles de masa delta. Es importante destacar que la observación de abundantes masas delta por sí sola no es una prueba de que una modificación sea un glicano potencial, ya que la asignación de masas delta como glicanos requiere un análisis más detallado de los eventos MS2 correspondientes.
  4. Para permitir la caracterización de glicopéptidos dentro de las muestras, concéntrese en las identificaciones de masa delta de alta confianza, correspondientes a asignaciones con hiperpuntuaciones altas.
    1. Para ayudar a evaluar los espectros de glicopéptidos, utilice herramientas de anotación de péptidos, como el Anotador Espectral de Péptidos Interactivo63, que permite la asignación de iones asociados a péptidos dentro de los espectros, lo que permite la identificación manual de los iones asociados a glicanos (Figura 4).
      NOTA: Dentro de los conjuntos de datos presentados aquí, las hiperpuntuaciones de >30 se consideran de alta puntuación, ya que corresponden a puntuaciones dentro del 50% superior de todos los glicopéptidos identificados (Figura 5).
  5. Con glicopéptidos de alta confianza asignados, identifique los iones asociados a glicanos comúnmente observados (Figura 4) para mejorar la identificación de glicopéptidos.
    NOTA: Al incorporar iones asociados a glicanos dentro de las búsquedas, conocidas como búsquedas centradas en glicanos, se puede mejorar la calidad de las asignaciones de glicopéptidos.
    1. Haga clic en la pestaña MSfragger de FragPipe, incorpore las masas delta determinadas de los glicanos observados en las secciones Modificaciones de variables y Desvíos de masa. Agregue estas masas escribiendo valores en las secciones Modificaciones de variables y Desvíos de masa con masas individuales separadas con un /. Agregue las masas de fragmentos asociadas a glicanos de estos glicanos en la sección de mods Glico/Labile de MSFragger.
      NOTA: La Figura 2B describe la información clave requerida para una búsqueda centrada en glicanos de la cepa AB307-0294 de A. baumannii .
  6. Cargue todos los datos de EM asociados con estudios proteómicos en repositorios proteómicos centralizados como los repositorios PRIDE o MASSIVE.
    NOTA: Todos los datos asociados con este estudio se han depositado en el repositorio proteómico pride y se puede acceder a través de la adhesión PRIDE: PXD027820.

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Resultados

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Para ilustrar la utilidad de la búsqueda abierta para el análisis de glicopéptidos bacterianos, se evaluó la diversidad química de los glicanos ligados a O dentro de tres cepas de A. baumannii-AB307-0294, ACICU y D1279779. Los glicoproteomas ligados a O son muy variables entre las cepas de A. baumannii, ya que los glicanos utilizados para la glicosilación se derivan de los loci de cápsula altamente variables 44,45,46.

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Discusión

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La búsqueda abierta es un método eficaz y sistemático para la identificación de modificaciones desconocidas. Si bien la identificación de glicanos desconocidos dentro de muestras de proteoma bacteriano ha sido tradicionalmente una tarea que requiere mucho tiempo y está técnicamente especializada, los desarrollos recientes de herramientas como MSfragger21,41 y Byonic 31,38 ahora permiten la identificación ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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N.E.S cuenta con el apoyo de una beca futura del Consejo Australiano de Investigación (FT200100270) y una subvención arc Discovery Project (DP210100362). Agradecemos a la Instalación de Espectrometría de Masas y Proteómica de Melbourne del Instituto de Ciencia Molecular y Biotecnología Bio21 por el acceso a la instrumentación de EM.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
14 G Kel-F Estilo de punto de buje 3Hamilton companyhanc90514
2-ChloroacecetamideSigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
AcetonitriloSigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
Hidróxido de amonio (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA Reactivo de ensayo de proteínas APierce23228
Reactivo de ensayo de proteínas BCA BPierce23224
C8 Empore SPESigma Aldrich Pty Ltd66882-UUn proveedor alternativo para el material C8 es Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Ácido fórmicoSigma Aldrich Pty Ltd5.33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
Metanol Fisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (sulfonato de fase reversa)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-UUn proveedor alternativo para SDB-RPS es Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Desoxicolato de sodioSigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
ácido trifluoroacéticoSigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Tris Clorhidrato de 2-carboxietil fosfinaSigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris(hidroximetil)aminometanoSigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
Mezcla de tripsina/proteasa Lys-CPromegaV5073
Concentrador de vacíoLabconco7810040
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Referencias

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