La búsqueda abierta permite la identificación de glicopéptidos decorados con composiciones de glicanos previamente desconocidas. Dentro de este artículo, se presenta un enfoque simplificado para realizar búsquedas abiertas y posteriores búsquedas de glicopéptidos centrados en glicotecos para muestras bacterianas utilizando Acinetobacter baumannii como modelo.
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Artículo de método
La aplicación de enfoques abiertos basados en la búsqueda para la identificación de glicopéptidos ligados a O de Acinetobacter baumannii
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En este artículo
Resumen
Resumen
La glicosilación de proteínas se reconoce cada vez más como una modificación común dentro de los organismos bacterianos, que contribuye a la fisiología procariota y la infectividad óptima de las especies patógenas. Debido a esto, existe un creciente interés en caracterizar la glicosilación bacteriana y la necesidad de herramientas analíticas de alto rendimiento para identificar estos eventos. Aunque la proteómica de abajo hacia arriba permite fácilmente la generación de datos de glicopéptidos ricos, la amplitud y diversidad de glicanos observados en especies procariotas hacen que la identificación de eventos de glicosilación bacteriana sea extremadamente desafiante.
Tradicionalmente, la determinación manual de las composiciones de glicanos dentro de los conjuntos de datos proteómicos bacterianos hizo de este un análisis en gran medida restringido a expertos específicos del campo. Recientemente, los enfoques abiertos basados en la búsqueda han surgido como una alternativa poderosa para la identificación de modificaciones desconocidas. Al analizar la frecuencia de las modificaciones únicas observadas en las secuencias de péptidos, las técnicas de búsqueda abierta permiten la identificación de glicanos comunes unidos a péptidos dentro de muestras complejas. Este artículo presenta un flujo de trabajo simplificado para la interpretación y el análisis de datos glicoproteómicos, demostrando cómo se pueden utilizar técnicas de búsqueda abiertas para identificar glicopéptidos bacterianos sin conocimiento previo de las composiciones de glicanos.
Usando este enfoque, los glicopéptidos dentro de las muestras se pueden identificar rápidamente para comprender las diferencias de glicosilación. Utilizando Acinetobacter baumannii como modelo, estos enfoques permiten la comparación de composiciones de glicanos entre cepas y la identificación de nuevas glicoproteínas. En conjunto, este trabajo demuestra la versatilidad de las técnicas de búsqueda de bases de datos abiertas para la identificación de la glicosilación bacteriana, lo que hace que la caracterización de estos glicoproteomas altamente diversos sea más fácil que nunca.
Introducción
La glicosilación proteica, el proceso de unión de carbohidratos a moléculas de proteínas, es una de las modificaciones post-traduccionales (PTM) más comunes en la naturaleza 1,2. En todos los dominios de la vida, ha evolucionado una gama de maquinaria compleja dedicada a la generación de glicoproteínas que afectan a una miríada de funciones celulares 1,3,4,5. Mientras que la glicosilación de proteínas ocurre en una gama de aminoácidos 6,7
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Protocolo
NOTA: La preparación y análisis de muestras de glicopéptidos bacterianos se puede dividir en cuatro secciones (Figura 1). Para este estudio se evaluó la glicosilación de tres cepas secuenciadas de A. baumannii (Tabla 1). Las bases de datos Proteome FASTA de cada una de estas cepas son accesibles a través de Uniprot. Consulte la Tabla 2 para conocer la composición de los búferes utilizados en este protocolo.
1. Preparación de muestras de proteínas para análisis proteómicos
- Aislamiento de muestras de proteoma de interés
- Si usa células e....
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Resultados
Para ilustrar la utilidad de la búsqueda abierta para el análisis de glicopéptidos bacterianos, se evaluó la diversidad química de los glicanos ligados a O dentro de tres cepas de A. baumannii-AB307-0294, ACICU y D1279779. Los glicoproteomas ligados a O son muy variables entre las cepas de A. baumannii, ya que los glicanos utilizados para la glicosilación se derivan de los loci de cápsula altamente variables 44,45,46.
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Discusión
La búsqueda abierta es un método eficaz y sistemático para la identificación de modificaciones desconocidas. Si bien la identificación de glicanos desconocidos dentro de muestras de proteoma bacteriano ha sido tradicionalmente una tarea que requiere mucho tiempo y está técnicamente especializada, los desarrollos recientes de herramientas como MSfragger21,41 y Byonic 31,38 ahora permiten la identificación .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
N.E.S cuenta con el apoyo de una beca futura del Consejo Australiano de Investigación (FT200100270) y una subvención arc Discovery Project (DP210100362). Agradecemos a la Instalación de Espectrometría de Masas y Proteómica de Melbourne del Instituto de Ciencia Molecular y Biotecnología Bio21 por el acceso a la instrumentación de EM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 14 G Kel-F Estilo de punto de buje 3 | Hamilton company | hanc90514 | |
| 2-Chloroacecetamide | Sigma Aldrich Pty Ltd | C0267-100G | |
| Acetonitrilo | Sigma Aldrich Pty Ltd | 34851-4L | |
| Hidróxido de amonio (28%) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 338818-100ML | |
| BCA Reactivo de ensayo de proteínas A | Pierce | 23228 | |
| Reactivo de ensayo de proteínas BCA B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | Un proveedor alternativo para el material C8 es Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Ácido fórmico | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| Metanol Fisher Chemical | M/4058/17 | ||
| SDB-RPS Empore SPE (sulfonato de fase reversa) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | Un proveedor alternativo para SDB-RPS es Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Desoxicolato de sodio | Sigma Aldrich Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| ácido trifluoroacético | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris Clorhidrato de 2-carboxietil fosfina | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hidroximetil)aminometano | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| Mezcla de tripsina/proteasa Lys-C | Promega | V5073 | |
| Concentrador de vacío | Labconco | 7810040 | |
| material | ZIC-HILICLa resina 1504580001 Merck | para su uso en columnas SPE de un solo uso se puede obtener vaciando una columna de forma más grande y utilizando la resina libre |
Referencias
- Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
- Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
- Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N.
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Reimpresiones y permisos
