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Artículo de método

Modelado de señalización Wnt no canónica paracrina in vitro

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DOI:

10.3791/63247

⸱

10 de diciembre de 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Keck School of Medicine of USC, 2Department of Pediatrics, Keck School of Medicine of USC, 3Heart Institute, Children’s Hospital Los Angeles

En este artículo

Resumen

El presente estudio describe un método altamente reproducible y manejable para estudiar eventos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro. Este protocolo se aplicó para evaluar el impacto de la señalización paracrina Wnt5a en células murinas de la cresta neural y mioblastos.

Resumen

La señalización Wnt no canónica regula la organización intracelular del filamento de actina y la migración polarizada de las células progenitoras durante la embriogénesis. Este proceso requiere interacciones paracrinas complejas y coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Dado que estas interacciones pueden ocurrir entre varios tipos de células de diferentes linajes, la evaluación in vivo de defectos específicos de células puede ser un desafío. El presente estudio describe un método altamente reproducible para evaluar la señalización paracrina no canónica de Wnt in vitro. Este protocolo fue diseñado con la capacidad de (1) realizar evaluaciones funcionales y moleculares de la señalización Wnt no canónica entre dos tipos de células de interés; (2) diseccionar el papel de las moléculas de envío de señales versus moléculas receptoras de señales en la vía de señalización Wnt no canónica; y (3) realizar experimentos fenotípicos de rescate con enfoques moleculares o farmacológicos estándar.

Este protocolo se utilizó para evaluar la señalización Wnt no canónica mediada por células de la cresta neural (NCC) en mioblastos. La presencia de NCC se asocia con un mayor número de filopodios citoplasmáticos positivos para faloidina y lamellipodia en mioblastos y una mejor migración de mioblastos en un ensayo de cicatrización de heridas. El eje Wnt5a-ROR2 se identificó como una vía de señalización Wnt no canónica crucial entre NCC y progenitores de cardiomioblastos del segundo campo cardíaco (SHF). En conclusión, este es un protocolo altamente manejable para estudiar los mecanismos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro.

Introducción

La señalización Wnt no canónica es una vía conservada evolutivamente que regula la organización del filamento celular y la migración direccional. Esta vía ha sido implicada en múltiples procesos biológicos, incluyendo la morfogénesis tisular embrionaria 1,2,3, la angiogénesis linfática y vascular 4,5,6,7, y el crecimiento y metástasis del cáncer 8,9,10 . A nivel celular, la señalización Wnt no canónica se lleva a cabo a través de interacciones paracrinas coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Estas interacciones ocurren frecuentemente entre células de diferentes linajes o tipos e involucran una red molecular diversa que incluye hasta 19 ligandos y múltiples receptores, correceptores y efectores de transducción de señales aguas abajo11. Para complicar aún más este proceso de señalización, estudios previos han demostrado que las combinaciones ligando-receptor pueden variar de manera dependiente del contexto y del tejido 12,13, y que los mismos ligandos fuente que impulsan la señalización Wnt no canónica en las células receptoras de señales pueden ser producidos por múltiples tipos de células emisoras de señales 14,15 . Dada la complejidad celular y molecular asociada con la señalización Wnt no canónica, la capacidad de estudiar mecanismos individuales y clínicamente relevantes in vivo ha sido limitada.

Se han hecho intentos para estudiar la señalización Wnt no canónica utilizando técnicas de cultivo celular in vitro. Por ejemplo, los ensayos de cicatrización de heridas realizados en monocapas celulares se han utilizado para evaluar funcionalmente la migración direccional celular 4,16,17,18,19. Se han utilizado técnicas de inmunotinción para realizar análisis espaciales de la expresión de proteínas de superficie para evaluar cambios no canónicos inducidos por Wnt en morfología celular 7,10, arquitectura y polarización asimétrica18,19,20. Aunque estos enfoques han proporcionado herramientas importantes para caracterizar fenotipos relacionados con Wnt en células receptoras de señales, la falta de componentes de envío de señales en estos protocolos limita su capacidad para modelar con precisión los mecanismos de señalización paracrina observados in vivo. Como resultado, sigue existiendo una necesidad crítica de desarrollar sistemas in vitro que permitan una evaluación robusta y reproducible de las interacciones de señalización paracrina entre las células emisoras y receptoras de señales de la vía Wnt no canónica, particularmente aquellas de diferentes tipos celulares.

Con este fin, el objetivo principal de este estudio fue establecer un protocolo para modelar interacciones de señalización Wnt paracrinas no canónicas in vitro. Desarrollamos un sistema de cocultivo sin contacto que recapitula los componentes de envío y recepción de señales de estas interacciones y permite el uso de enfoques moleculares, genéticos o farmacológicos estándar para estudiar de forma independiente mecanismos específicos de ligando-receptor en la vía Wnt no canónica. Los mecanismos de señalización Wnt mediada por NCC se examinaron en mioblastos utilizando líneas celulares murinas establecidas. Como prueba de principio, este modelo se utilizó para corroborar los hallazgos de estudios previos in vivo en ratones que implican el eje Wnt5a-ROR2 como una vía de señalización Wnt no canónica relevante entre NCCs 21 y progenitores de cardiomioblastos SHF 3,22,23.

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Protocolo

1. Expansión preexperimental y paso de células

  1. Cultivo celular C2C12:
    1. Preparar 500 ml de medio de cultivo C2C12 combinando el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina.
    2. Descongele un vial de células C2C12 en un baño maría a 37 °C. Mientras las células C2C12 se están descongelando, agregue 5 ml de medio C2C12 a un tubo cónico de 15 ml. Transfiera inmediatamente las células descongeladas al tubo de 15 ml utilizando una pipeta P1000.
      NOTA: Las células C2C12 son células de mioblastos murinos que se han utilizado y validado previamente como línea celular primaria para modelar progenitores de cardiomioblastos.
    3. Mezclar suavemente las células C2C12 en el tubo cónico con una pipeta serológica. A continuación, añadir todo el volumen de células descongeladas en medio C2C12 (6 ml) a un matraz de 75cm2 .
    4. Añadir 6 ml de C2C12 medio fresco al matraz para obtener un volumen total de 12 ml. Gire suavemente el matraz de forma que la solución celular y de medios cubra todo el fondo del matraz. Colocar el matraz en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5%CO2) para permitir que las células se adhieran.
    5. Permita que las células se expandan en la incubadora hasta que alcancen ~ 60% de confluencia.
      NOTA: Esto se puede determinar retirando periódicamente las células de la incubadora y verificando rápidamente su confluencia bajo un microscopio. Asegúrese de minimizar el tiempo que se extraen las células de la incubadora.
  2. Paso de células C2C12:
    1. Calentar el C2C12 medio, 500 ml de 1x PBS y tripsina-EDTA al 0,25% en un baño maría a 37 °C. Después de que los reactivos se hayan calentado, transfiera todos los reactivos a la campana de cultivo celular.
    2. Introducir el matraz que contiene las células C2C12 en la campana de cultivo celular. Enjuagar suavemente el matraz que contiene las células C2C12 con 1x PBS caliente dos veces.
      1. Incline el matraz en un ángulo de 45° y aspire el medio C2C12 con una pipeta de vidrio conectada a la aspiración al vacío. Mientras mantiene un ángulo de 45°, añadir con cuidado 10 ml de PBS 1x tibio a la esquina del matraz con una pipeta serológica. Coloque el matraz plano sobre la superficie y mueva suavemente el matraz con movimientos circulares para asegurarse de que el 1x PBS se lave sobre toda la monocapa de células.
        NOTA: Tenga cuidado de no interrumpir la monocapa C2C12 mientras aspira el medio.
    3. Retire el 1x PBS después del segundo lavado. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz, mover suavemente el matraz como se ha descrito anteriormente para permitir que la solución de tripsina-EDTA se extienda sobre la mayor cantidad posible de monocapa y colocar el matraz en la incubadora durante 2 min.
    4. Después de 2 minutos de incubación, retire el matraz de la incubadora y golpee suavemente para desprender las células restantes.
    5. Añadir 9 ml de medio C2C12 al matraz con una pipeta serológica para calmar la tripsina. Usando la pipeta serológica, enjuague suavemente las células con el medio y recoja los 10 ml de suspensión de células tripsinizadas. Añadir 10 ml de la suspensión celular a un tubo cónico fresco de 15 ml y centrifugar a 100 × g durante 5 min.
    6. Devuelva el tubo cónico a la campana de cultivo celular y retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio conectada a la aspiración al vacío. Mientras aspira el sobrenadante, tenga cuidado de no interrumpir el pellet celular en la parte inferior del tubo cónico. Para hacer esto, deje ~ 0.2 ml del sobrenadante en el tubo cónico. Resuspender las células en 10 ml de medio C2C12 fresco.
    7. Para una evacuación adicional, añadir 1 ml de células resuspendidas en un matraz de 75 cm2 . Añadir 11 ml de C2C12 medio al matraz con una pipeta serológica y colocar el matraz en la incubadora.
  3. Cultivo de células STO:
    1. Prepare el medio de cultivo STO haciendo 500 ml de DMEM con 7% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 2 nM de L-glutamina.
    2. Prepare gelatina al 0,1% agregando 0,5 g de gelatina en polvo a una botella que contenga 500 ml de agua de grado tisular o esterilizada en autoclave. Añadir 7 ml de solución de gelatina al 0,1% en un matraz de 75cm2 . Gire el matraz de forma que la solución de gelatina cubra todo el fondo del matraz. Deje incubar el matraz durante 30 minutos a temperatura ambiente en la campana de cultivo celular.
    3. Después de 30 minutos de incubación, retire el exceso de gelatina con una pipeta conectada a la aspiración al vacío. Deje que los matraces permanezcan en la incubadora durante otros 30 minutos antes de su uso.
    4. Descongele un vial de células STO en un baño maría a 37 °C. Con una pipeta P1000, transfiera inmediatamente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo STO recién preparado.
      NOTA: Las células STO son fibroblastos embrionarios murinos que se utilizan rutinariamente como células alimentadoras en protocolos de cultivo celular.
    5. Mezclar suavemente las células en el tubo cónico con una pipeta serológica. Añadir todo el volumen (6 ml) de células a un matraz recubierto de gelatina de 75cm2 . Gire el matraz para asegurarse de que la suspensión celular esté bien distribuida a lo largo de la parte inferior del matraz.
    6. Añadir 6 ml de STO medio fresco al matraz para obtener un volumen total de 12 ml. Gire el matraz como se ha descrito anteriormente para asegurarse de que las células y el medio estén bien distribuidos a lo largo de la parte inferior del matraz. Colocar el matraz en la incubadora a 37 °C para permitir que las células se adhieran. Permita que las células proliferen en la incubadora hasta que alcancen ~ 60-70% de confluencia.
  4. Pasando células STO:
    1. Medio de células STO calientes, 1xPBS y tripsina-EDTA al 0,25% en un baño maría a 37 °C.
    2. Enjuagar suavemente el matraz que contiene células STO con 1x PBS caliente dos veces, como se describe en el paso 1.2.2.1.
    3. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz con una pipeta P1000. Introducir el matraz en la incubadora a 37 °C durante 5 min.
    4. Después de 5 minutos de incubación, retirar el matraz de la incubadora. Golpee suavemente el matraz para separar las células adherentes.
    5. Añadir 9 ml de medio STO al matraz para apagar la tripsina y recoger los 10 ml de suspensión de células tripsinizadas como se ha descrito anteriormente. Añadir 10 ml de la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 100 × g durante 5 min.
    6. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 10 ml de medio STO como se describió anteriormente. Para una evacuación adicional, añadir 1 ml de células resuspendidas en un matraz de 75 cm2 . Añadir 11 ml de medio STO, girar el matraz para asegurar una distribución uniforme de las células y el medio a lo largo de la parte inferior del matraz y colocar el matraz en la incubadora.
  5. Cultivo de células STO inactivas y preparación del medio basal de células O9-1:
    1. Preparar el medio de cultivo basal de células O9-1 mezclando 500 ml de DMEM con 15% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 2 nM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales mínimos, piruvato de sodio de 1 nM y 55 μM de beta-mercaptoetanol.
    2. Prepare la solución de mitomicina C en 1x PBS a una concentración de 0.5 mg/ml agregando 4 ml de 1x PBS directamente a un vial de mitomicina C. Pipetear la solución varias veces con una pipeta P1000. Para disolver aún más la mitomicina C en 1x PBS, coloque el vial en un mezclador de vórtice o balancín de sobremesa durante 45 min a 1 h.
    3. Inactivar las células STO tratando las placas STO con una concentración final de 0,01 mg/ml de mitomicina C añadida al medio STO estándar. Colocar las placas STO dentro de la incubadora durante 2 h, teniendo cuidado de proteger de la luz el matraz que contiene mitomicina C minimizando el tiempo pasado fuera de la incubadora. Después del tratamiento con mitomicina, lavar las células en 1x PBS dos veces como se describe en el paso 1.2.2.1.
      NOTA: La mitomicina C inhibe la proliferación de células STO para que puedan usarse para generar medio acondicionado durante varios días sin llegar a ser demasiado confluentes en el matraz.
    4. Después de retirar el 1x PBS, añadir 12 ml de medio de cultivo basal O9-1 a los cultivos celulares STO inactivados e incubarlos durante 24 h. Recoja el medio de cultivo basal STO + O9-1 condicionado e inactivado y colóquelo en tubos cónicos de 50 ml envueltos en papel de aluminio para protegerlo de la luz.
    5. Añadir 12 ml de medio de cultivo basal fresco O9-1 a los cultivos de células STO inactivadas como se describió anteriormente. Repita este paso añadiendo medio de cultivo basal O9-1 fresco a los mismos flancos que contienen las células STO inactivadas cada 24 h.
      NOTA: Después del tratamiento con mitomicina C, las células STO inactivadas no pueden proliferar; por lo tanto, los matraces que contienen las células STO inactivadas pueden reutilizarse para generar medio acondicionado.
    6. Conservar los tubos cónicos de 50 ml envueltos en papel de aluminio que contienen medio de cultivo basal STO + O9-1 inactivado y acondicionado a 4 °C hasta que se haya recogido un total de 500 ml del medio.
  6. Cultivo celular O9-1:
    1. Preparar el medio de cultivo celular O9-1 utilizando 500 ml de medio basal STO + O9-1 condicionado, y añadir 103 unidades de factor inhibidor de la leucemia (LIF) y 25 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos (básico-FGF).
    2. Preparar matraces recubiertos de gelatina al 0,1% como se describe en los pasos 1.3.2-1.3.3.
    3. Descongele un vial de células O9-1 en un baño maría a 37 °C. Transfiera inmediatamente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo O9-1 recién preparado.
      NOTA: La línea celular O9-1 es la única línea celular de cresta neural estable y multipotente que se ha generado a partir del ratón. Esta línea celular se usa comúnmente en experimentos in vitro de cresta neural.
    4. Mezclar suavemente las células con una pipeta serológica. Añadir los 6 ml de células completas a un matraz recubierto de gelatina de 75 cm2 .
    5. Añadir 6 ml de medio de cultivo de O9-1 al matraz para obtener un volumen total de 12 ml. Colocar el matraz en la incubadora a 37 °C para permitir que las células se adhieran. Permita que las células proliferen en la incubadora hasta que alcancen ~ 60-70% de confluencia.
  7. Pasando células O9-1:
    1. Medio de crecimiento O9-1 caliente, 1x PBS y tripsina-EDTA al 0,25% en un baño maría a 37 °C.
    2. Enjuague suavemente la placa que contiene células O9-1 con PBS caliente 1x dos veces como se describe en el paso 1.2.2.1.
    3. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz y colocarlo en la incubadora a 37 °C durante 5 min.
    4. Después de 5 minutos de incubación, retire el matraz de la incubadora y golpee suavemente el matraz para separar las células adherentes.
    5. Añadir 9 ml de medio de crecimiento de O9-1 al matraz para calmar la tripsina. Recoja 10 ml de la suspensión de células tripsinizadas y agregue 10 ml de esta suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 5 min.
    6. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 10 ml de medio de crecimiento O9-1. Para una evacuación adicional, añadir 1 ml de células resuspendidas a un matraz de75 cm 2 . Añadir 11 ml de medio de cultivo O9-1 y colocar el matraz que contiene las células en 12 ml de medio en la incubadora a 37 °C.

2. Recubrimiento de células en un sistema de cocultivo

  1. Cámaras celulares de recubrimiento C2C12:
    1. Después de la tripsinización (como se describe en el paso 1.2), resuspender el pellet de células C2C12 en 10 ml de medio C2C12. Diluir las células en una proporción de 1:20 en medio C2C12 eliminando 0,5 ml de las células C2C12 resuspendidas y añadiéndolas a un nuevo tubo cónico de 15 ml que contenga 9,5 ml de medio C2C12 fresco. Mezclar suavemente la suspensión con una pipeta serológica.
    2. Agregue 1 ml de células C2C12 diluidas 1:20 a cada pocillo de un nuevo pocillo de 4 cámaras usando una pipeta P1000 y coloque el pocillo de 4 cámaras en la incubadora.
  2. Insertos de celda O9-1 de recubrimiento:
    1. Después de la tripsinización, resuspender el pellet de células O9-1 en 10 ml de medio de crecimiento O9-1. Diluir las células en una proporción de 1:20 en medio de crecimiento O9-1 eliminando 0,5 ml de las células C2C12 resuspendidas y añadiéndolas a un nuevo tubo cónico de 15 ml que contiene 9,5 ml de medio de crecimiento O9-1 fresco. Mezclar suavemente la suspensión con una pipeta serológica.
    2. Coloque un solo inserto permeable (consulte la Tabla de materiales) dentro de cada pocillo de un nuevo pocillo de 4 cámaras lleno con 1 ml de medio de cultivo O9-1.
      NOTA: Este pocillo de 4 cámaras debe ser diferente del que contiene las células C2C12 del paso 2.1.3.
    3. Añadir 300 μL de la suspensión de células O9-1 diluidas a cada inserto utilizando una pipeta P1000. Asegúrese de que la parte inferior de cada inserto esté sumergida dentro del pozo lleno con 1,3 ml de medio de crecimiento O9-1. Colocar el pozo en la incubadora a 37 °C.
  3. (Opcional). Realizar el derribo de ARNip en las células O9-1 o C2C12.
    1. Realizar la eliminación del gen por siRNA 18-24 h después de placar insertos de células O9-1 o pozos de cámara celular C2C12.
      1. Diluir el ARNip y el reactivo de transfección en un medio sérico reducido (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes y las concentraciones deseadas para el experimento. Mezclar suavemente el ARNip diluido y el reactivo de transfección (1:1) e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 7 min.
        NOTA: En este protocolo, se utilizaron concentraciones de 50 nM, ya que se determinó que esta concentración de siRNA resultaba en una reducción suficiente de la expresión génica objetivo.
      2. Agregue los complejos siRNA-lípido a los insertos celulares O9-1 o a los pocillos de la cámara celular C2C12 según lo determinado por el diseño experimental e incube las células con los complejos siRNA-lípidos durante ~ 36-48 h.

3. Realización del ensayo de heridas y evaluación cuantitativa de la migración de mioblastos

  1. Ensayo de herida:
    1. Permita que los insertos de células O9-1 y los pocillos de la cámara celular C2C12 se adhieran y proliferen en la incubadora hasta que ambas células estén en ~ 70-80% de confluencia antes de proceder con esta parte del protocolo. Si las células crecen >90% confluentes, no proceda con el ensayo de rasguño, ya que las células simplemente se desprenderán del pozo.
    2. Calentar 1x PBS y C2C12 medio colocándolos en un baño maría a 37 °C.
    3. Retire bien el medio sobrenadante de la cámara C2C12 y lave las células una vez con 1x PBS. Retire el 1x PBS e inmediatamente rasque las células con una punta de pipeta P10 estéril.
      1. Pase la punta de pipeta P10 estéril firmemente en una sola dirección para abarcar toda la longitud o anchura de la monocapa celular (por ejemplo, de derecha a izquierda, de arriba a abajo). Asegúrese de rascar cada pocillo que contenga células solo una vez.
        NOTA: Para optimizar los resultados de rascado, rasque pocillos de diferentes condiciones experimentales a un nivel similar de confluencia. Para hacer esto, asegúrese de que cada pocillo de 4 cámaras tenga células para cada condición experimental requerida (por ejemplo, control negativo # 1, control positivo # 2). Además, utilice una nueva pipeta estéril P10 para cada rasguño y aplique una cantidad similar de fuerza a la pipeta cada vez. No intente crear más de un rasguño en cada pozo.
      2. Después de rascarse, agregue rápidamente 1 ml de 1x PBS al pozo con una punta de pipeta P1000. Repita este proceso para cada pozo que se rayará.
        NOTA: Dada la variabilidad asociada con cada rasguño, se recomienda que se utilicen múltiples pocillos (n = 3) para la creación de heridas en cada condición experimental. Trabaje de manera expedita, ya que es fundamental minimizar la duración durante la cual las celdas están sin 1x PBS durante estos pasos. Después de retirar 1x PBS de cada pozo, no se debe tomar más de 5 s para generar una herida en cada pozo.
    4. Después de generar una herida y agregar 1x PBS nuevamente en cada pocillo, tome una imagen del rasguño usando un microscopio invertido de campo claro y use esta imagen como el tamaño de la herida de referencia (tiempo 0). Para tomar imágenes, realice los pasos siguientes:
      1. Encienda la computadora y el microscopio (consulte la Tabla de materiales) presionando el botón de encendido. Coloque la diapositiva de la cámara en el escenario y gire el dial del objetivo a un aumento de 5x.
      2. Abra el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el icono del software en el escritorio del equipo. Haga clic en la pestaña Cámara en la pantalla de inicio del software. Haga clic en el botón Live para visualizar las celdas en la pestaña AxioCam IC .
      3. Asegúrese de que el filtro de luz esté completamente extendido para permitir que la luz pase a la cámara y a la pantalla de la computadora. Mueva y/o gire manualmente la diapositiva de la cámara para colocar el área de la herida en el centro de la imagen en vivo en la pestaña AxioCam IC .
      4. Para tomar imágenes, haga clic en ajustar para abrir una nueva pestaña junto a la pestaña AxioCam IC que contiene la imagen.
      5. Para guardar esta imagen fija, haga clic en archivo en la parte superior izquierda de la página de inicio del software | guarde como | escriba el nombre del archivo en el cuadro de nombre de archivo. Guarde la figura en formato de imagen Carl Zeiss (*.czi) (la configuración predeterminada) y seleccione escritorio en la barra de la izquierda para guardar el archivo en el escritorio como un archivo .czi, que solo se puede abrir en el programa de software Zen lite 2012.
      6. Para guardar la imagen como una .tiff, haga clic en archivo | guardar como | escriba el nombre de archivo en el cuadro nombre de archivo. Guarde la figura como archivo de imagen etiquetado (*.tiff) haciendo clic en el botón Guardar como tipo y seleccionando *.tiff en el menú desplegable.
        NOTA: El formato .tiff se puede abrir en cualquier software de procesamiento de imágenes.
      7. Cambie manualmente la diapositiva de la cámara para tomar 2-3 imágenes más en otros puntos de la herida en el mismo pozo.
        NOTA: En total, esto dará como resultado 3-4 imágenes no superpuestas y de gran aumento de la herida en cada pozo.
    5. Retire el 1x PBS de cada pocillo y agregue 1 ml de medio C2C12.
      NOTA: Tenga cuidado de no pipetear demasiado agresivamente al extraer o agregar soluciones a la cámara después de la generación de la herida, ya que esto puede hacer que las células se desprendan bien de la cámara. Además, incline bien la cámara para que la aspiración y la reintroducción de soluciones se puedan hacer en las esquinas de cada pocillo para minimizar la interrupción de la monocapa celular.
    6. Ensamble el sistema de cocultivo de insertos de pozo colocando manualmente los insertos que contienen las células O9-1 en cada pocillo del pozo de la cámara. Empuje suavemente los insertos hacia abajo en el pozo de tal manera que la parte inferior del inserto se encuentre justo encima de las células C2C12 subyacentes. Devuelva las construcciones de inserción de pozo a la incubadora.
      NOTA: No permita que la parte inferior del inserto toque físicamente e interrumpa mecánicamente las celdas C2C12 subyacentes.
    7. Permita que las células migren durante un total de 9-12 h. Para determinar el tiempo óptimo de migración, verifique las células a las 6 h después de la creación de la herida, luego cada 2-3 h a partir de entonces. Termine el experimento cuando las células en condiciones de control o control positivo comiencen a cubrir completamente la herida.
      NOTA: Dada la naturaleza sin contacto de la construcción, no es necesario retirar el inserto suprayacente de los pozos al verificar la progresión de la migración del intervalo. La variabilidad migratoria se observará dependiendo de factores tales como los tipos de células utilizadas en este ensayo, la densidad celular en el momento de la generación de la herida, el ancho de la herida creada y las condiciones experimentales de las células manipuladas (por ejemplo, eliminación de genes, adición de proteínas recombinantes). Las concentraciones de estos reactivos deben determinarse experimentalmente con la orientación de las recomendaciones del fabricante.

4. Tinción por inmunofluorescencia e imágenes de mioblastos migratorios

  1. Terminación del ensayo de migración y deconstrucción del sistema de inserción del pozo:
    1. Retire los insertos de células O9-1 después de un período de migración de 9-12 h (o tiempo alternativo designado por las condiciones experimentales). Aspirar cuidadosamente el medio C2C12 con una pipeta P1000. Agregue 0.5 ml de 1x PBS a los pocillos de la cámara y tome imágenes finales de las células después de la migración.
    2. Aspire cuidadosamente todos los 0,5 ml de 1x PBS mezclado con medio y retire las cámaras de plástico de los pozos de la cámara siguiendo las instrucciones del kit, dejando el portaobjetos subyacente que contiene las células C2C12.
      NOTA: Tenga cuidado de no interrumpir las células C2C12 adherentes al portaobjetos cuando retire los pocillos de la cámara.
  2. Realización de inmunotinción:
    1. Coloque inmediatamente el portaportaobjetos en un portaportaobjetos que contenga 4% de paraformaldehído (PFA) e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vierta el PFA al 4% y agregue 1x PBS (1x PBST) que contiene Triton X-100% al portaportaobjetos para lavar el portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vierta el 1x PBST y agregue 1x PBS al soporte de la diapositiva para lavar el portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita este paso una vez más para un total de dos lavados 1x PBS.
    2. Retire la diapositiva del portaobjetos. Traza los bordes exteriores de la diapositiva con un bolígrafo hidrófobo para crear un límite hidrófobo alrededor de la diapositiva y evitar que las soluciones se derramen de la diapositiva. Tenga cuidado de no interrumpir las células adherentes.
    3. Agregue una solución bloqueadora de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (diluida en 1x PBS) al portaobjetos (~0.5 ml por portaobjetos). Asegúrese de que la solución está contenida dentro del límite hidrofóbico creado en el paso 4.2.4. Incubar el portaobjetos durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara de portaobjetos humidificada.
      NOTA: Aunque el bloqueo de BSA no es necesario para la inmunotinción de faloidina, este paso en el protocolo permite el acoplamiento con la tinción de anticuerpos de fluorescencia.
    4. Después de bloquear durante 1 h, vierta la solución bloqueadora del portaobjetos, agregue el anticuerpo faloidina (diluido a 1:200 en una solución bloqueadora de BSA al 1% agregando 5 μL del anticuerpo a 995 μL de solución de BSA) al portaobjetos e incube a 4 °C durante la noche. Una vez más, asegúrese de que la solución está contenida dentro del límite hidrofóbico creado en el paso 4.2.4. Dado que el anticuerpo faloidina está conjugado con el colorante Alexa Fluor-488, minimice la exposición a la luz del reactivo de anticuerpos antes y después de agregarlo al portaobjetos.
    5. Al día siguiente, coloque la diapositiva en un portaportaobjetos protegido de la exposición a la luz (p. ej., envuelva el portaportaobjetos en papel de aluminio o use un portaportaobjetos no transparente). Lave las celdas en el portaportaobjetos con 1x PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita el lavado para un total de tres lavados de 10 minutos.
    6. Agregue un medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y monte las guías con cubreobjetos de vidrio. Obtener imágenes de las células que han migrado utilizando un microscopio de fluorescencia estándar.

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Resultados

Efectos de los NCC sobre la capacidad migratoria de los mioblastos murinos
Este ensayo se aplicó por primera vez para evaluar el impacto de los NCC en la capacidad migratoria de los mioblastos. La figura 1 describe el modelo esquemático del ensayo. Para probar este impacto, se realizaron ensayos de rasguño con mioblastos que se cultivaron de forma aislada (sin inserciones NCC) en comparación con los cultivados en presencia de inserciones. Como control positivo, se agregar...

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Discusión

La vía de señalización no canónica Wnt/polaridad celular plana (PCP) es una vía de señalización celular de importancia crítica que ha sido implicada en múltiples procesos de desarrollo 24,25 y de enfermedad24,26. Durante el desarrollo embrionario, la señalización Wnt no canónica implica una red expansiva de señales moleculares de células emisoras de señales que finalmente inducen cambios en la mo...

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Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por los premios NIH F30HL154324 a O.T. y K08HL121191 y R03HL154301 a S.R.K. Los autores desean reconocer que el esquema de la Figura 1 de este manuscrito fue creado con biorender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-MercaptoethanolSigma AldrichM-7522
Medio de montaje antidecoloración con DAPIVector LaboratoriesH-1200-10Almacenado a 4 & grados; C
Albúmina sérica bovinaSanta Cruz Biotechnologysc-2323Almacenado a 4 & grados; C
C2C12 línea celular de mioblastos murinosATCCCRL-1772
Matraces de cultivo celular, 75 cm2156499ThermoFisher Scientific
, 4 pocillosThermoFisher Scientific154526
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM), glucosa alta (4,5 g/L), L-glutamina (2 mM)Corning10-017-CVAlmacenado a 4 & grados; C
Tubos de centrífuga cónicos Falcon, 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Soporte permeable Falcon para placa de 24 pocillos con 0.4 y micro; Membrana de PET transparenteCorning353095
Suero fetal bovinoFisher ScientificW3381EAlmacenado en alícuotas de 50 mL a -20 ° C
Solución de gelatina, 0.1%ATCCPCS-999-027Almacenado a 4 & grados; C
Puntas de pipeta graduadas y estériles, 10 y micro; LUSA Scientific1111-3810
Factor inhibidor de la leucemia (LIF), 106 unidades/mLMillipore SigmaESG1106
L-glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
MEM aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) 100xGibco11140-050
Medio esencial mínimo (MEM)Corning10-022-CV
Mitomicina CRoche10107409001
Cubreobjetos antiadherentes para vidrios para automóviles, 24 x 55 mmLínea celular de cresta neural Springside ScientificHRTCG2455
O9-1Millipore SigmaSCC049
Opti-MEM I, 1xGibco31985-070
Paraformaldehído solución en PBS, 4%Santa Cruz Biotechnologysc-281692Almacenado a 4 & grados; C
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina y 10.000 μ g/mL de estreptomicina)Fisher ScientificW3470HAlmacenado en alícuotas de 10 mL a -20 ° C
Phalloidin-iFluor 488Abcamab176753Almacenado a -20 ° C, Mantener fuera de la luz
Solución salina tampón de fosfato (PBS), 1x, sin calcio ni magnesio, pH 7.4Corning21-040-CVAlmacenado a 4 & grados; C
Factor de crecimiento de fibroblastos humanos recombinante-básico (rhFGF-básico)R& D Systems233-FB-025
Proteína Wnt5a recombinante humano/ratónR& D Systems645-WN-010
Piruvato de sodio, 100 mMGibco11360-070
Placa de Petri cuadrada con rejillaThomas Scientific1219C98
STO celdas alimentadoras de fibroblastos murinosATCCCRL-1503
Triton X-100 soluciónSigma AldrichX100-100ML
Tripsina-EDTA, 0,25%Fisher ScientificW3513CAlmacenado a 4 & grados; C
Microscopio de fluorescencia Zeiss Apotome.2Carl Zeiss AG
Microscopio óptico Zeiss Axio Vert.A1 invertidoCarl Zeiss AG
Zen lite 2012 software de microscopíaCarl Zeiss AGsoftware de imagen
Sistema de portaobjetos de cámara de

Referencias

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093(2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719(2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
  6. Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
  13. Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).
  14. Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
  15. Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305(2016).
  16. Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
  17. Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456(2010).
  18. Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
  19. Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).
  20. Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
  21. Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).
  22. Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
  23. Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
  24. Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).
  26. Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
  27. Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
  28. Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).
  29. Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
  30. Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
  31. Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).
  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  33. Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).

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