Artículo de método

Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra

DOI:

10.3791/63251

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28 de diciembre de 2021

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1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, hemos utilizado la tinción de rojo alizarina para mostrar que la exposición al acetato de plomo causa un cambio de masa ósea en las larvas de pez cebra. Este método de tinción se puede adaptar a la investigación de la pérdida ósea en larvas de pez cebra inducida por otros tóxicos peligrosos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pérdida ósea inducida químicamente debido a la exposición al plomo (Pb) podría desencadenar una serie de impactos adversos en los sistemas esqueléticos humanos y animales. Sin embargo, los efectos y mecanismos específicos en el pez cebra siguen sin estar claros. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio y puede ayudar a visualizar el hueso e ilustrar la masa mineral esquelética. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar la pérdida ósea inducida por acetato de plomo (PbAc) en larvas de pez cebra mediante el uso de tinción de rojo de alizarina. Los embriones de pez cebra fueron tratados con una serie de concentraciones de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 y 120 h después de la fecundación. La tinción esquelética de montaje completo se realizó en larvas a los 9 días posteriores a la fertilización, y el área total teñida se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los resultados indicaron que los tejidos mineralizados se tiñeron de rojo, y el área teñida disminuyó significativamente en el grupo de exposición a PbAc, con un cambio dependiente de la dosis en la mineralización ósea. Este artículo presenta un protocolo de tinción para investigar los cambios esqueléticos en los defectos óseos inducidos por PbAc. El método también se puede utilizar en larvas de pez cebra para la detección de la pérdida ósea inducida por otros productos químicos.

Introducción

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Estudios recientes han confirmado que la osteoporosis debida a glucocorticoides, inhibidores de la aromatasa y consumo excesivo de alcohol es común 1,2. El plomo (Pb) es un metal tóxico que se encuentra en las plantas, el suelo y los ambientes acuáticos3. Aunque los efectos adversos de Pb en el cuerpo humano han atraído mucha atención, su impacto irreversible en el hueso necesita ser investigado más a fondo. La intoxicación por plomo causa una amplia gama de cambios patológicos tanto en el esqueleto en desarrollo como en el adulto, que afectan las actividades normales de la vida. Los estudios han encontrado una asociación entre la exposición crónica a Pb y el daño óseo4, incluyendo estructuras óseas deterioradas5,6, densidad mineral ósea reducida e incluso mayor riesgo de osteoporosis7.

El tejido mineralizado es de gran importancia para la resistencia ósea8, y la deposición de la matriz de mineralización ósea es un índice crítico de la formación ósea9. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio, y la tinción con rojo de alizarina es un procedimiento estándar para evaluar la formación ósea10. De acuerdo con este método, el tejido mineralizado se tiñe de rojo, mientras que todo el resto del tejido permanece transparente. El área teñida se cuantifica mediante análisis de imagen digital11.

El pez cebra es un organismo modelo importante ampliamente utilizado en el descubrimiento de fármacos y modelos de enfermedades. Estudios genéticos en peces cebra y humanos han demostrado similitudes en los mecanismos subyacentes de la morfogénesis esquelética a nivel molecular12. Además, el cribado de fármacos o biomoléculas de alto rendimiento es más factible en grandes nidadas de pez cebra que en modelos murinos, facilitando el estudio mecanicista de moléculas proosteogénicas u osteotóxicas13. La tinción diferencial del esqueleto in toto10 se utiliza con frecuencia en el estudio de la displasia esquelética en pequeños vertebrados y fetos de mamíferos. La tinción de rojo de alizarina se realizó para investigar la toxicidad del desarrollo óseo de los productos químicos en larvas de pez cebra. Aquí, utilizamos el plomo como ejemplo para describir un protocolo para detectar defectos óseos inducidos por acetato de plomo en larvas de pez cebra.

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por el Instituto de Cuidado de Animales del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.

1. Cría de peces y recolección de embriones 14

  1. Alimente a los peces tres veces al día; Asegúrese de que el pez cebra se mantenga a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h.
  2. Separe los peces adultos machos y hembras mediante tablas de aislamiento en tanques de desove en una proporción de macho a hembra de 2: 1 por la noche.
  3. A la mañana siguiente, retire las tablas de aislamiento a las 9:00 AM y recoja los embriones 2 h más tarde.
  4. Colocar los embriones en una incubadora bioquímica mantenida a 28,5 °C antes del experimento.

2. Exposición química

  1. Preparar el caldo madre: pesar el acetato de plomo trihidratado (5 g) y disolverlo en agua ultrapura (50 mL) con agitación.
    PRECAUCIÓN: PbAc es tóxico. Use máscaras contra el polvo adecuadas, ropa protectora y guantes. Realice el experimento bajo una campana extractora.
  2. Seleccione y distribuya aleatoriamente los embriones de pez cebra en placas limpias de 6 pocillos (30 embriones por pocillo en 3 ml de agua de cría de pez cebra; consulte la Tabla 1 para su composición). Tratar los embriones con PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) de 2 a 120 h después de la fecundación (HPF).
    NOTA: Las concentraciones de PbAc se eligieron de acuerdo con los experimentos de determinación del rango de dosis. Los resultados mostraron que la CL50 del acetato de plomo en embriones de pez cebra fue de 41,044 mg/L a 120 hpf. Por lo tanto, la concentración más alta se estableció en la mitad de la LC50 y una serie de soluciones preparadas por dilución 2 veces.
  3. Alimente a las larvas dos veces al día a partir de 5 días después de la fertilización (dpf). Mantener los embriones de pez cebra a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h.
  4. Refresque el medio libre de Pb (agua de cría del pez cebra) cada 24 h hasta 9 dpf.
    NOTA: Al finalizar los experimentos, todas las soluciones que contienen plomo se vertieron en un tanque de líquido designado y fueron tratadas por el centro de gestión de experimentos.

3. Tinción de rojo alizarina

NOTA: Use máscaras contra el polvo adecuadas, ropa protectora y guantes durante todo el proceso de tinción. Las composiciones de todas las soluciones se muestran en la Tabla 1.

  1. Pasos específicos de tinción
    NOTA: El proceso de teñido se llevó a cabo en una placa de 24 pocillos a temperatura ambiente. Después de agregar cada solución, coloque la placa de 24 pocillos en la mesa de agitación a baja velocidad.
    1. Retire 10 larvas de pez cebra al azar de cada grupo a 9 dpf y fije el pescado en 1 ml de paraformaldehído al 2% / solución salina tamponada con fosfato al 2 h.
    2. Decantar la solución y lavar las larvas de pez cebra con 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM de MgCl2 durante 10 min.
    3. Decantar la solución e incubar las larvas en las siguientes soluciones durante 5 min cada una para la detinción: solución de etanol anhidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5) y 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7.5).
    4. Decantar la solución, eliminar el pigmento blanqueando con una solución que consiste en 3% deH2O2y 0,5% de KOH, y observar una vez cada 10 min hasta que el pigmento se elimine por completo.
    5. Enjuague las larvas de pez cebra varias veces con 25% de glicerina / 0.1% de KOH durante 10 minutos cada una hasta que no haya burbujas.
      NOTA: Es importante evitar las burbujas; De lo contrario, las burbujas en el cuerpo del pez cebra aparecerán como un campo de visión negro bajo el microscopio, lo que afectará las observaciones y el análisis cuantitativo.
    6. Manchar las larvas remojando en 1 ml de alizarina al 0,01% durante 50 min.
    7. Decantar la solución y añadir 1 ml de glicerina al 50% / KOH al 0,1% durante 10 minutos para limpiar el fondo. Almacene los peces en 50% de glicerina fresca / 0.1% KOH para su posterior observación.

4. Adquisición de imágenes

  1. Transfiera una larva al portaobjetos de vidrio cada vez, manteniendo la larva en el medio de la gota de líquido.
  2. Observe las larvas bajo un microscopio estéreo.
  3. Encienda la cámara, abra el software (consulte la Tabla de materiales) y mantenga la configuración predeterminada.
  4. Haga clic en AE y elija un tiempo de exposición adecuado (60 ms en este experimento) para obtener la mejor imagen.
  5. Capture todas las imágenes con la misma configuración. Guarde las imágenes en .tif formato para su posterior análisis.

5. Análisis de imágenes

Nota : consulte el archivo suplementario para obtener un ejemplo con un conjunto de gráficos de ejemplo para el análisis de imágenes.

  1. Haga doble clic en el icono ImageJ y analice las imágenes guardadas en el paso 4.5.
    1. Haga clic en Archivo | Abrir para abrir las imágenes guardadas en el paso 4.5.
    2. Haga clic en la imagen | Tipo, seleccione 8 bits.
    3. Haga clic en Editar | Invertir.
    4. Haga clic en Analizar | Calibrar, seleccione OD sin calibrar en la interfaz emergente, marque Calibración global en la parte inferior izquierda de la interfaz inferior y haga clic en Aceptar.
    5. Haga clic en Analizar | Establecer escala | Haga clic para Eliminar escala en la interfaz emergente, marque Global a continuación y haga clic en Aceptar.
    6. Haga clic en Analizar | Establezca Medidas, seleccione el área del elemento en la interfaz emergente, marque el umbral Limitar al umbral a continuación (para medir solo el rango seleccionado) y haga clic en Aceptar.
    7. Haga clic en la imagen | Ajustar| Umbral, deslice el control deslizante en el centro de la interfaz emergente para seleccionar el umbral apropiado (cambie el umbral para cada imagen) para que se seleccionen todos los objetivos que se probarán en una imagen y haga clic en Establecer.
    8. Haga clic en Analizar | Medir. Registre las fechas de cada grupo.
  2. Utilice ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para analizar las diferencias y establezca el nivel de significación en p < 0.001 (***).

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Resultados

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La tinción de rojo alizarina es un método sensible y específico para medir los cambios en la mineralización ósea en larvas de pez cebra. En este estudio, hemos observado que PbAc tuvo efectos adversos sobre las larvas de pez cebra, incluyendo muerte, malformación, disminución de la frecuencia cardíaca y acortamiento de la longitud corporal. Además, se evaluaron las áreas de esqueleto mineral de las larvas de pez cebra para examinar la pérdida ósea inducida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A), much...

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Discusión

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El pez cebra es un modelo adecuado para estudiar la enfermedad metabólica ósea. En comparación con los modelos de roedores, los modelos de pez cebra son relativamente rápidos de establecer, y la medición de la gravedad de la enfermedad es más fácil. En larvas de pez cebra de tipo salvaje, la mineralización del esqueleto de la cabeza ocurre a 5 dpf y el esqueleto axial a 7 dpf15. Por lo tanto, los huesos craneales como PS, OP, CB y NC están bien desarrollados a 9 dpf. Después de que las larvas se d...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81872646; 81811540034; 81573173) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 M Tris-HCl (pH = 7.5)Solarbio, Beijing, China21para retener
la solución fija de paraformaldehído al 4%BBI, Shanghai, China14tejidos de fijación
10x tampón PBSBBI, Shanghai, China15para la fijación
del 35% H2O2Yonghua,Jiangsu,China8eliminando el pigmento
Tubo de centrífuga de 50 mLAKX, Jiangsu, China4
95% Etanol anhidroEnox, Jiangsu, China2decolorante
Rojo de alizarina (pureza 99.5%)Solarbio, Beijing, China1tinción
Incubadora bioquímicaYiheng, Shanghai, China3criando embriones de pez cebra
Báscula electrónicaSartorius, Alemania5pesaje de las materias primas sólidas
Glicerina (pureza 99.5%)BBI,Shanghai,China7almacenamiento del pescado manchado
ImageJ (software)EE. UU9análisis digital
KOH (pureza 99.9%)Sigma,America10solución blanqueadora
acetato de plomo trihidrato (pureza 99.5%)Aladdin,Shanghai,China11
MgCl2 (pureza 99.9%)Aladdin,Shanghai,China12solución
de limpieza NIS-Elements F (software)Nikon, Japón13observando y tomando fotos
PipaAKX, Jiangsu, China18extracción de embriones y placas de solución
(24 pocillos)Corning,América17contenedor para teñir placas de embriones
(6 pocillos)Corning,América16contenedor para la cría de embriones
Mesa de agitaciónBeyotime, China19mezclando la solución
Microscopio estereoscópicoNikon, Japón20observando y tomando fotos
Pez cebraCentro de Experimentación de Pez Cebra de la Universidad de Soochow, Suzhou, China22animales experimentales
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Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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