Aquí, hemos utilizado la tinción de rojo alizarina para mostrar que la exposición al acetato de plomo causa un cambio de masa ósea en las larvas de pez cebra. Este método de tinción se puede adaptar a la investigación de la pérdida ósea en larvas de pez cebra inducida por otros tóxicos peligrosos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La pérdida ósea inducida químicamente debido a la exposición al plomo (Pb) podría desencadenar una serie de impactos adversos en los sistemas esqueléticos humanos y animales. Sin embargo, los efectos y mecanismos específicos en el pez cebra siguen sin estar claros. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio y puede ayudar a visualizar el hueso e ilustrar la masa mineral esquelética. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar la pérdida ósea inducida por acetato de plomo (PbAc) en larvas de pez cebra mediante el uso de tinción de rojo de alizarina. Los embriones de pez cebra fueron tratados con una serie de concentraciones de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 y 120 h después de la fecundación. La tinción esquelética de montaje completo se realizó en larvas a los 9 días posteriores a la fertilización, y el área total teñida se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los resultados indicaron que los tejidos mineralizados se tiñeron de rojo, y el área teñida disminuyó significativamente en el grupo de exposición a PbAc, con un cambio dependiente de la dosis en la mineralización ósea. Este artículo presenta un protocolo de tinción para investigar los cambios esqueléticos en los defectos óseos inducidos por PbAc. El método también se puede utilizar en larvas de pez cebra para la detección de la pérdida ósea inducida por otros productos químicos.
Introducción
Estudios recientes han confirmado que la osteoporosis debida a glucocorticoides, inhibidores de la aromatasa y consumo excesivo de alcohol es común 1,2. El plomo (Pb) es un metal tóxico que se encuentra en las plantas, el suelo y los ambientes acuáticos3. Aunque los efectos adversos de Pb en el cuerpo humano han atraído mucha atención, su impacto irreversible en el hueso necesita ser investigado más a fondo. La intoxicación por plomo causa una amplia gama de cambios patológicos tanto en el esqueleto en desarrollo como en el adulto, que afectan las actividades normales de la vida. Los es....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por el Instituto de Cuidado de Animales del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.
1. Cría de peces y recolección de embriones 14
- Alimente a los peces tres veces al día; Asegúrese de que el pez cebra se mantenga a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h.
- Separe los peces adultos machos y hembras mediante tablas de aislamiento en tanques de desove en una proporción de macho a hembra de 2: 1 por la noche.
- A la mañana siguiente, retire las tablas de aislamiento a las 9:....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La tinción de rojo alizarina es un método sensible y específico para medir los cambios en la mineralización ósea en larvas de pez cebra. En este estudio, hemos observado que PbAc tuvo efectos adversos sobre las larvas de pez cebra, incluyendo muerte, malformación, disminución de la frecuencia cardíaca y acortamiento de la longitud corporal. Además, se evaluaron las áreas de esqueleto mineral de las larvas de pez cebra para examinar la pérdida ósea inducida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A), much.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El pez cebra es un modelo adecuado para estudiar la enfermedad metabólica ósea. En comparación con los modelos de roedores, los modelos de pez cebra son relativamente rápidos de establecer, y la medición de la gravedad de la enfermedad es más fácil. En larvas de pez cebra de tipo salvaje, la mineralización del esqueleto de la cabeza ocurre a 5 dpf y el esqueleto axial a 7 dpf15. Por lo tanto, los huesos craneales como PS, OP, CB y NC están bien desarrollados a 9 dpf. Después de que las larvas se d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81872646; 81811540034; 81573173) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.5) | Solarbio, Beijing, China | 21 | para retener |
| la solución fija de paraformaldehído al 4% | BBI, Shanghai, China | 14 | tejidos de fijación |
| 10x tampón PBS | BBI, Shanghai, China | 15 | para la fijación |
| del 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | eliminando el pigmento |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | AKX, Jiangsu, China | 4 | |
| 95% Etanol anhidro | Enox, Jiangsu, China | 2 | decolorante |
| Rojo de alizarina (pureza 99.5%) | Solarbio, Beijing, China | 1 | tinción |
| Incubadora bioquímica | Yiheng, Shanghai, China | 3 | criando embriones de pez cebra |
| Báscula electrónica | Sartorius, Alemania | 5 | pesaje de las materias primas sólidas |
| Glicerina (pureza 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | almacenamiento del pescado manchado |
| ImageJ (software) | EE. UU | 9 | análisis digital |
| KOH (pureza 99.9%) | Sigma,America | 10 | solución blanqueadora |
| acetato de plomo trihidrato (pureza 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (pureza 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | solución |
| de limpieza NIS-Elements F (software) | Nikon, Japón | 13 | observando y tomando fotos |
| Pipa | AKX, Jiangsu, China | 18 | extracción de embriones y placas de solución |
| (24 pocillos) | Corning,América | 17 | contenedor para teñir placas de embriones |
| (6 pocillos)Corning,América | 16 | contenedor para la cría de embriones | |
| Mesa de agitación | Beyotime, China | 19 | mezclando la solución |
| Microscopio estereoscópico | Nikon, Japón | 20 | observando y tomando fotos |
| Pez cebra | Centro de Experimentación de Pez Cebra de la Universidad de Soochow, Suzhou, China | 22 | animales experimentales |
Referencias
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbau....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
