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Artículo de método

Expresión bacteriana y purificación de la metaloproteinasa-3 de matriz humana mediante cromatografía de afinidad

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DOI:

10.3791/63263

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30 de marzo de 2022

 ,  , 
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La purificación, diálisis y activación de His-tag se emplean para aumentar los rendimientos de la expresión de proteínas del dominio catalítico soluble y activo metaloproteinasa-3 en bacterias. Las fracciones de proteínas se analizan a través de geles SDS-PAGE.

Resumen

Las metaloproteinasas de matriz (MMP) pertenecen a la familia de las proteasas de metzincina con funciones centrales en la degradación y remodelación de la matriz extracelular (ECM), así como interacciones con varios factores de crecimiento y citoquinas. La sobreexpresión de MMP específicos es responsable en varias enfermedades como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades cardiovasculares. Los MMP han sido el centro de atención recientemente como objetivos para desarrollar terapias que puedan tratar enfermedades correlacionadas con la sobreexpresión de MMP.

Para estudiar el mecanismo MMP en solución, se necesitan métodos de expresión y purificación de proteínas recombinantes más fáciles y robustos para la producción de MMP activos y solubles. Sin embargo, el dominio catalítico de la mayoría de las MMP no se puede expresar en Escherichia coli (E. coli) en forma soluble debido a la falta de maquinaria posttraduccional, mientras que los sistemas de expresión de mamíferos suelen ser costosos y tienen rendimientos más bajos. Los cuerpos de inclusión MMP deben someterse al tedioso y laborioso proceso de purificación y repliega extensos, reduciendo significativamente el rendimiento de las MMP en la conformación nativa. Este artículo presenta un protocolo que utiliza células Rosetta2(DE3)pLysS (en adelante, R2DP) para producir el dominio catalítico de la metaloproteinasa-3 de la matriz (MMP-3cd), que contiene una etiqueta His-terminal N seguida de pro-dominio (Hisx6-pro-MMP-3cd) para su uso en la purificación de afinidad. Las células R2DP mejoran la expresión de proteínas eucariotas a través de un plásmido resistente al cloranfenicol que contiene codones normalmente raros en los sistemas de expresión bacteriana. En comparación con la línea celular tradicional de elección para la expresión de proteínas recombinantes, BL21 (DE3), la purificación con esta nueva cepa mejoró el rendimiento de Hisx6-pro-MMP-3cd purificado. Tras la activación y desalinización, el dominio pro se divide junto con la etiqueta His-tag N-terminal, proporcionando MMP-3cd activo para uso inmediato en innumerables aplicaciones in vitro . Este método no requiere equipos costosos o proteínas de fusión complejas y describe la producción rápida de MMP humanos recombinantes en bacterias.

Introducción

La mayoría de las proteínas eucariotas complejas sufren elaboradas modificaciones posttraduccionales después de la expresión, requiriendo un plegamiento de proteínas altamente asistido y cofactores para ser funcionales1. La producción de grandes cantidades de proteína humana soluble en un huésped bacteriano sigue siendo un desafío importante debido a los altos costos y la falta de métodos robustos de expresión y purificación, incluso para experimentos de laboratorio a menor escala2,3. Las MMP, endopeptidasas humanas con gran peso molecular, generalmente se expresan como cuerpos de inclusión insolubles cuando se expresan en E. coli. La extracción de MMP humanas solubles a menudo conduce a un laborioso y lento proceso de solubilización y repliega4.

Las MMP tienen funciones críticas tanto en procesos fisiológicos como patógenos. Las MMP humanas son una familia de 23 endopeptidasas de zinc, categorizadas por estructura y especificidad de sustrato, y expresadas diferencialmente a pesar de un dominio catalítico altamente conservado5,6. Las MMP se secretan como zimogenas inactivas, reguladas a través de la activación posttraduccional y sus inhibidores endógenos, inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP)7,8,9,10. Aunque inicialmente se reconocieron por su papel en el recambio de ECM, las MMP también se han implicado en el desarrollo, la morfogénesis, la reparación de tejidos y la remodelación8. La desregulación de las MMP se ha relacionado notablemente con el cáncer junto con las enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y fibróticas, entre otras enfermedades5,7.

El desarrollo de métodos robustos de producción de MMP a gran escala es fundamental para garantizar el éxito de futuros estudios de mecanismos de MMP a través de ensayos bioquímicos y basados en células. Varias MMP se han expresado previamente en bacterias11, incluidas las MMP marcadas con Hisx6, sin alterar la actividad de MMP12,13,14,15. Sin embargo, estos métodos incluyen pasos tediosos y largos que pueden ser difíciles de replicar.

Las células de mamíferos también se pueden utilizar para expresar muchas proteínas humanas diferentes al tiempo que garantizan las modificaciones posttraduccionales adecuadas16. Aunque el sistema de expresión de mamíferos es una opción ideal para producir proteínas humanas recombinantes con modificaciones post-traduccionales adecuadas, las principales desventajas de este método son los bajos rendimientos iniciales, los costosos medios de crecimiento y reactivos, los largos plazos para alcanzar líneas de expresión estables y el riesgo de contaminación con otras especies como hongos o bacterias2,11 . Además, la producción de MMP en líneas celulares de mamíferos produce impurezas a partir de proteínas celulares asociadas como TIMPs o fibronectinas11. A diferencia del lento crecimiento celular observado en las células de mamíferos, el sistema de expresión bacteriana ofrece una producción de proteínas a gran escala en un corto período de tiempo junto con medios y requisitos de crecimiento más simples. Sin embargo, debido a la falta de otras proteínas celulares asociadas (es decir, TIMP) en los sistemas de expresión bacteriana, las MMP activas a concentraciones más altas están sujetas a degradación a través de la autoproteólisis, lo que resulta en un rendimiento deficiente de MMP17.

Este artículo describe un método detallado para la expresión bacteriana, purificación y activación de Hisx6-pro-MMP-3cd recombinante utilizando E. coli como huésped de expresión debido a su asequibilidad, simplicidad y éxito en la producción de mayores rendimientos de MMPs2,3,18. Dado que E. coli carece de la maquinaria de plegamiento de proteínas y el procesamiento posttraduccional requerido para las MMP recombinantes y otras proteínas complejas, muchas cepas de E. coli han sido diseñadas para superar estas limitaciones, haciendo de E. coli un huésped más adecuado para la expresión de MMP-3cd humano recombinante,19,20 . Por ejemplo, la cepa R2DP utilizada en este estudio mejora la expresión eucariota al suministrar un plásmido resistente al cloranfenicol que contiene codones raramente utilizados en E. coli.

Como se describe en este protocolo, después de la sobreexpresión de cuerpos de inclusión relativamente puros del vector pET-3a (Figura 1) en células R2DP, se extraen y desnaturalizan las proteínas del dominio catalítico Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd)4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 se purificó mediante cromatografía de etiqueta de afinidad. Tras el repliegue y la diálisis, el pro-MMP-3cd (zymogen) fue activado por acetato de 4-aminofenilmercúrico (APMA), y el análisis SDS-PAGE se utiliza para evaluar los rendimientos y la necesidad de una mayor purificación5,21. Este protocolo describe la expresión, purificación y activación de MMP-3cd soluble como ejemplo. Sin embargo, también se puede utilizar como guía para la expresión de otras MMP y proteasas humanas con expresión similar, y mecanismos de activación (Figura 2). Para otras proteínas distintas de MMP-3cd, se recomienda al lector que determine las composiciones tampón óptimas y los métodos para su proteína objetivo antes de intentar este protocolo.

figure-introduction-1
Figura 1: Mapa plásmido del plásmido pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. El vector pET-3a incluye un gen de resistencia a la ampicilina. Una secuencia de etiquetas Hisx6 N-terminal se clona en el vector basado en pET-3a, incluyendo pro-MMP-3cd, para producir la construcción pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd bajo control del promotor T7 entre los sitios de restricción BamHI y NdeI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Expresión bacteriana del plásmido pro-MMP-3cd, purificación, repliegue y activación. 1.1: El plásmido pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd se transformó en células BL21(DE3) o R2DP. 1.2: La expresión de la proteína Pro-MMP-3cd se indujo mediante IPTG. 1.3: La lisis química y la sonicación se utilizan para extraer proteínas Hisx6-pro-MMP-3cd que son principalmente insolubles y se encuentran en los cuerpos de inclusión. La urea se utilizó para desnaturalizar y solubilizar proteínas de los cuerpos de inclusión. 2.1. La proteína Hisx6-pro-MMP-3cd desnaturalizada se purificó mediante cromatografía por afinidad. 3. El Hisx6-pro-MMP-3cd eluido se replegó lentamente durante la diálisis a través de la eliminación gradual de la urea del tampón. 4. Finalmente, la proteína MMP-3cd replegada se activó utilizando APMA mediante la eliminación del dominio propéptido N-terminal. APMA se elimina más tarde de la solución a través de la desalinización. Los números corresponden a las secciones del protocolo que describen estos pasos. Abreviaturas: MMP-3cd = Dominio catalítico de la metaloproteinasa-3 de la matriz; APMA = acetato de 4-aminofenilmercúrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. Expresión MMP

  1. Clonación y transformación de pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd en células R2DP
    1. Digerir el plásmido pET-3a (ver la Tabla de Materiales) con enzimas de restricción NdeI y BamHI en Digest Buffer (ver la Tabla de Materiales). En un volumen total de reacción de 40 μL, agregue 4 μL de Digest Buffer, 33 μL de plásmido de 100 ng / μL y 1.5 μL de cada enzima de restricción y permita que la reacción continúe durante ~ 2 h hasta su finalización a 37 ° C.
    2. Realice una reacción de PCR en la secuencia MMP-3cd para insertar una etiqueta His-terminal N. Utilice 25 μL de mezcla de PCR (véase la Tabla de materiales), 2,5 μL de cebadores de 10 μM (Figura suplementaria S1) y 1,25 μL de la secuencia de inserción de 100 ng/μL. Añadir agua estéril a un volumen de reacción final de 50 μL.
    3. Ejecute el producto de PCR y el vector digerido en un gel de agarosa al 1%. Purifique las bandas de gel utilizando un kit de recuperación de gel (consulte la Tabla de materiales) según el protocolo del fabricante.
    4. Clonar el producto de PCR amplificado en el vector digerido entre los sitios de restricción NdeI y BamHI utilizando DNA Assembly Mix (ver la Tabla de Materiales). Utilice herramientas en línea para determinar el volumen requerido del vector de inserción y corte para un volumen de reacción total de 15 μL.
    5. Descongelar una alícuota de 50 μL de células de alta eficiencia de transformación (ver la Tabla de Materiales) en hielo hasta que se descongele. Medio de crecimiento SOC precalentado (consulte la Tabla de materiales) a 37 °C y placas lb-ampicilina (LB Amp) (consulte la Tabla de materiales).
    6. Añadir 1-2 μL de la reacción de ensamblaje pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd a la alícuota de 50 μL. Incubar en hielo durante 30 min.
    7. Choque térmico de las células incubando a 42 °C durante 30 s. Incubar sobre hielo durante 2 min.
    8. Añadir 950 μL de medio de crecimiento SOC a cada mezcla transformadora. Agitar durante 1 h a 250 rpm y 37 °C.
    9. Placa 100 μL de los transformadores en placas LB Amp e incubar durante la noche a 37 °C.
    10. Inocular cada colonia aislada en 10 mL de LB Amp medio. Agitar durante la noche a 250 rpm y 37 °C.
    11. Extraer ADN plásmido según el protocolo del fabricante para el kit miniprep (consulte la Tabla de materiales). Confirme la secuencia de la construcción utilizando cebadores T7 hacia adelante y hacia atrás (Figura suplementaria S1).
      NOTA: El ADN de construcción pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd se puede almacenar a -20 °C. Cuando esté listo, proceda con la transformación en celdas R2DP.
    12. Descongele una alícuota de 20 μL de células R2DP (ver la Tabla de Materiales) en hielo durante 2-5 min. Medio de crecimiento SOC precalentado a temperatura ambiente y placas LB Amp CamR a 37 °C (consulte la Tabla de Materiales).
    13. Añadir 1 μL de pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd de 100 ng/μL confirmada por secuencia a la alícuota de 50 μL. Revuelva suavemente para mezclar y devuelva el tubo al hielo.
    14. Incubar el tubo en hielo durante 5 min.
    15. Choque térmico de las células incubando a 42 °C durante exactamente 30 s. No agitar.
    16. Coloque las celdas en hielo durante 2 min.
    17. Añadir 80 μL de medio SOC a temperatura ambiente a la mezcla transformadora. Agitar durante 1 h a 250 rpm y 37 °C.
    18. Coloque los transformadores en placas LB Amp CamR e incube durante la noche a 37 °C.
  2. Crecimiento e inducción
    1. Inocular una colonia única y aislada de transformador R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd de una placa LB Amp CamR en 10 mL de medios LB Amp CamR a 37 °C. Agitar a 250 rpm durante la noche (~16 h). Ahorre alícuotas de cada cultivo y prepare existencias de glicerol al 40% (v / v) (consulte la Tabla de materiales) si lo desea.
    2. Por cultivo nocturno, inocular un matraz de 1 L que contenga 500 ml de medio LB Amp CamR a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,05-0,1.
      NOTA: Esto debería devolver las células al crecimiento logarítmico.
    3. Mida el OD600 en varios puntos de tiempo, generalmente durante 3-4 h, hasta que caiga entre 0.4 y 0.6.
    4. Antes de la inducción, alícuota una fracción de cultivo en un tubo de microfuge de 1,5 ml (consulte la Tabla de materiales) y etiquételo como Fracción no inducida. Guárdelo a -80 °C para el análisis del gel. Si no está ejecutando un gel SDS-PAGE, omita este paso y continúe con el paso 1.2.5.
    5. Inducir los cultivos a una concentración final de 1 mM utilizando 1 M de stock de isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (ver la Tabla de Materiales). Continúe incubando en el agitador de 37 °C durante 3-4 h adicionales.
      NOTA: Durante la expresión, el lector debe determinar el óptimo OD600 en el momento de la inducción y la concentración de IPTG. Si el rendimiento disminuye sustancialmente después de la purificación, la concentración de imidazol en los tampones de purificación puede requerir un ajuste, o el pellet celular puede necesitar ser sonicado aún más.
    6. Antes de centrifugar los cultivos, alícuota una fracción de cultivo en un segundo tubo de microfuge de 1,5 ml y etiquételo Fracción inducida. Guárdelo a -80 °C para el análisis del gel. Si no está ejecutando un gel SDS-PAGE, omita este paso y continúe con el paso 1.2.7.
    7. Centrifugar el cultivo celular en botellas cónicas de 250 ml (ver la Tabla de Materiales) a máxima velocidad y 4 °C durante 10 min.
    8. Repita el paso 1.2.7 hasta que los cultivos estén completamente peletizados.
      NOTA: PAUSA: Los pellets celulares se pueden congelar a -80 °C y descongelar más tarde para su posterior procesamiento. De lo contrario, omita este paso y continúe con el paso 1.3.1.
  3. Extracción y solubilización de cuerpos de inclusión
    NOTA: Prepare 10 M de urea fresca, preferiblemente no antes de un día de anticipación, revolviendo bien hasta que se disuelva por completo. No calentar ni autoclave urea; guárdelo a temperatura ambiente.
    1. Vuelva a suspender el pellet (a partir del paso 1.2.8) en tampón de lisis (consulte la Tabla de materiales). Por gramo de pellet, añadir 3 mL de tampón de lisis y resuspender por vórtice o pipeteo. Agitar durante la noche a 4 °C.
    2. Añadir 1,25 ml de desoxicolato de sodio al 10% (p/v) (véase la Tabla de Materiales) por 1 L de cultivo. Agitar a temperatura ambiente durante 30 min a 150 rpm.
    3. Añadir 10 μL de DNasa I (véase la Tabla de Materiales) por 1 L de cultivo. Agitar a temperatura ambiente durante 30 min a 150 rpm.
    4. Centrifugar durante 10 min a 13.000 × g y 4 °C.
    5. Reserve una fracción de Lysed MMP para el análisis de gel. Guárdelo a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 1.3.6.
      NOTA: Después de la centrifugación, el pellet puede ser fibroso y no empaquetado compactamente, por lo que es arriesgado desechar el sobrenadante. Si este es el caso, omita el paso 1.3.6 y continúe con el paso 1.3.7.
    6. Deseche el sobrenadante de las muestras centrifugadas.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto y los gránulos celulares se congelan a -80 °C y se descongelan más tarde. De lo contrario, omita este paso y continúe con el paso 1.3.7.
    7. Resuspend el pellet en cultivo de 100 mL/L de Inclusion Body Buffer (ver la Tabla de Materiales) mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
    8. Durante la sonicación, mantenga las muestras en hielo para evitar el sobrecalentamiento. Sonicar cada muestra durante 6 ciclos de 15 s, salida 5 y 50% de pulso. Permita períodos de descanso de 15 s para enfriar entre ciclos.
      NOTA: Si es necesario, transfiera las muestras a tubos cónicos de 50 ml para una centrifugación adicional (consulte la Tabla de materiales). Centrifugar durante 10 min a 13.000 × g y 4 °C.
    9. Reserve una fracción de Sonicated MMP para el análisis de gel. Guárdelo a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 1.3.11.
    10. Revisa el pellet. Si está fibroso, repita los pasos 1.3.8-1.3.10. Si el pellet es compacto, deseche el sobrenadante y proceda al paso 1.3.12.
      NOTA: La sonicación en Inclusion Body Buffer se puede repetir para recuperar más proteína de los restos celulares lisados. Sin embargo, demasiada sonicación puede causar cizallamiento, lo que perjudica el rendimiento de MMP. El protocolo se puede pausar en esta etapa, y los gránulos celulares se pueden congelar a -80 ° C y descongelar más tarde.
    11. Resuspenda cada pellet de un cultivo de 1 L en 5 mL de Tampón de Solubilización (ver la Tabla de Materiales) mediante pipeteo. Incubar durante al menos 30 min en hielo para permitir que las proteínas se solubilicen.
    12. Reserve una fracción de MMP solubilizado para el análisis de gel. Guárdelo a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 1.3.14.
    13. Centrifugar las células durante 10 min a 13.000 × g y 4 °C. NO DESECHAR EL SOBRENADANTE.
    14. Si se forma/queda un gránulo después de la centrifugación, vierta el sobrenadante en un tubo cónico separado de 50 ml. Resuspend el pellet en otros 5 mL de Tampón de Solubilización (por 1 L de cultivo) mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
    15. Centrifugar durante 10 min a 13.000 × g y 4 °C. NO DESECHAR EL SOBRENADANTE.
    16. Repita los pasos 1.3.13 y 1.3.14 hasta que se forme un poco o ningún gránulo después de la centrifugación o solo quede precipitado gris. Agrupa a los sobrenadantes. Deseche o almacene el pellet a -80 °C para una sonicación adicional.

2. Purificación y repliegue MMP

  1. Purificación de afinidad His-tag (HT)
    1. Según el protocolo del fabricante, llene una columna de flujo por gravedad (consulte la Tabla de materiales) con resina de Ni-NTA bien mezclada (consulte la Tabla de materiales). Permita que la resina se asiente y se separe del tampón de almacenamiento de tal manera que se forme una línea distinta entre las dos capas.
      NOTA: Nunca permita que la resina se seque, ya que el aire penetrará en la resina y dañará el rendimiento de la proteína. Entre usos, realizar el procedimiento de regeneración de resina descrito en la sección 2.2.
    2. Permita que el búfer de almacenamiento se drene. Llene la columna con dos volúmenes de lecho de resina de HT Equilibration Buffer.
    3. Drene el búfer de equilibrio HT y deseche. A medida que la columna se está drenando, centrífuga el extracto de proteína a 13.000 × g durante 1 min y esterilice con un filtro de 0,22 μm (consulte la Tabla de materiales).
    4. Cambie el contenedor de residuos por un tubo cónico de 50 ml etiquetado como HT Flowthrough. Agregue el extracto de proteína preparado a la columna.
    5. Vuelva a aplicar el flujo para maximizar el enlace.
    6. Reserve una fracción de la fracción flowthrough para el análisis de gel. Guárdelo a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 2.1.7.
    7. Lave inmediatamente la resina con 15 ml de tampón de lavado HT (consulte la Tabla de materiales). Recoja el flujo en tubos cónicos de 15 ml (consulte la Tabla de materiales) etiquetados como HT Wash.
      NOTA: Los valores de absorbancia a 280 nm (A280) se obtuvieron mediante espectrofotometría y se utilizaron junto con el peso molecular y el coeficiente de extinción, ε, para estimar las concentraciones de proteínas. Para Hisx6-pro-MMP-3cd desnaturalizado, el peso molecular es de 29.86 kDa, y ε es de 34.38 M-1 cm-1.
    8. Blanking contra HT Wash Buffer, mida y registre el A280. Repita los pasos 2.1.7 y 2.1.8 con fracciones de lavado adicionales. Una vez que el A280 se acerque a la línea de base y se hayan minimizado las impurezas, continúe con el paso 2.1.9.
    9. Reserve una fracción de fracción de lavado para el análisis del gel. Repita para varias fracciones de lavado. Conservar las fracciones a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 2.1.10.
    10. Eluya inmediatamente las proteínas marcadas con His agregando 5 ml de HT Elution Buffer (consulte la Tabla de materiales). Recoja el flujo como fracciones de 0.5-1 ml en tubos de microfuge etiquetados como HT Elution.
    11. Reserve una fracción de fracción de elución para el análisis de gel. Repita para múltiples fracciones de elución. Conservar las fracciones a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 2.1.12.
    12. Si el A280 es >0,3 mg/ml, diluya la fracción con HT Equilibration Buffer (consulte la Tabla de Materiales).
      NOTA: La fracción eluida debe diluirse a un A280 de 0,3 mg/ml o menos para evitar precipitaciones durante la diálisis. El protocolo se puede pausar aquí y las fracciones agrupadas se congelan a -80 ° C y se descongelan más tarde. De lo contrario, omita este paso y continúe con el paso 2.2.1.
  2. Regeneración de resina
    1. Lave la resina con diez volúmenes de lecho de resina de HT Regeneration Buffer (consulte la Tabla de materiales) y diez volúmenes de lecho de resina de agua estéril.
    2. Almacene la resina como una suspensión al 50% en etanol al 20% (v/v) en agua.

3. Repliegue de proteínas

NOTA: Para volúmenes más pequeños, los casetes de diálisis se pueden usar con un menor riesgo de pérdida de muestra. Se requieren tubos de diálisis si se utilizan volúmenes más grandes (consulte la Tabla de materiales).

  1. Diálisis
    NOTA: La concentración óptima de proteínas para la diálisis es de ~0.3 mg/ml. Si se produce una precipitación significativa durante la diálisis, reduzca el gradiente de concentración de urea entre cada diálisis utilizando un método de diálisis gradual y agregue más pasos intermedios (por ejemplo, de 6 M a 5 M, y luego de 5 M a 4 M, en lugar de omitir la etapa de 5 M). Como los ciclos de congelación-descongelación dañan la estructura celular y proteica, es vital minimizar las pausas en el protocolo.
    1. Según el protocolo del fabricante, use la cantidad adecuada de tubos de diálisis de acuerdo con el volumen de muestras de fracción de elución .
    2. Sumergir las fracciones de MMP eluidas en tubos de diálisis en 1 L de Diálisis Buffer 1 (ver la Tabla de Materiales). Revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante no menos de 8 h a 4 °C.
    3. Transfiera a 1 L de tampón de diálisis 2 (consulte la Tabla de materiales). Revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante no menos de 8 h a 4 °C.
    4. Transfiera a 1 L de tampón de diálisis 3 (consulte la Tabla de materiales). Revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante no menos de 8 h a 4 °C.
    5. Transfiera la muestra a nuevos tubos cónicos de 50 ml y etiquételos como MMP dializado.
    6. Examine el tubo en busca de precipitado. Si se ha formado precipitado, centrífuga la muestra durante 1 min a 13.000 × g y 4 °C.
    7. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos cónicos de 15 ml y etiquételos como MMP plegado.
    8. Reserve una fracción para el análisis de gel y etiquétela como MMP plegado. Guárdelo a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 3.1.9.
      NOTA: Si los rendimientos son bajos, el precipitado se puede disolver en HT Equilibration Buffer y los pasos de la sección 3.1 se repiten con tubos de diálisis. Si no se va a realizar un análisis de gel o si el protocolo debe detenerse aquí, congele las muestras a -80 °C y descongele más tarde. Si los rendimientos están en el rango deseado, continúe con el paso 3.2.1.
  2. Reconcentración
    NOTA: Se espera que los coeficientes de extinción para Hisx6-pro-MMP-3cd replegado y desnaturalizado sean los mismos; por lo tanto, los cálculos de A280 no se ven afectados.
    1. Reconcentrar la muestra hasta 0,5 mg/ml. Utilice una celda agitada de 400 ml (consulte la Tabla de materiales) para concentrar la muestra a 15 ml. Para evitar la formación de espuma, use un tubo de reconcentración de 50 ml para concentrarse aún más si es necesario.
      NOTA: Si se forma un precipitado, se puede peletizar y disolver en HT Equilibration Buffer. A continuación, repita las secciones 3.1 y 3.2.1. De lo contrario, continúe con el paso 3.2.2.
    2. Reserve una fracción para el análisis de gel y etiquétela como MMP concentrado.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se congelan a -80 °C y se descongelan más tarde.

4. Activación

  1. Activación del acetato de 4-aminofenilmercúrico (APMA)
    NOTA: APMA es altamente tóxico. Haga una solución madre fresca de 20 mM APMA antes de la activación, y siempre trabaje bajo una campana de humos cuando use APMA. Deseche los residuos de APMA en su contenedor.
    1. Por cada 1 ml de alícuota de MMP (1 mg/ml), añadir 50 μL de 20 mM de APMA (véase la Tabla de materiales) para alcanzar una concentración final de APMA de 1 mM. Incubar durante la noche a 37 °C.
    2. Si se forma un precipitado, centrímelo a máxima velocidad durante 10 min a 4 °C. Guarde el sobrenadante en un tubo de microfuge de 1,5 ml con la etiqueta MMP activado. Deseche el precipitado en un recipiente marcado para los residuos de APMA.
    3. Reservar una fracción para el análisis de gel y etiquetarlo como MMP activado.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se congelan a -80 °C y se descongelan más tarde. Si no realiza el análisis de gel, continúe con el paso 4.2.1. Después de la activación, el peso molecular y el coeficiente de extinción de MMP-3cd son 19,40 kDa y 28,42 M-1 cm-1, respectivamente.
  2. Desalación
    1. Elimine APMA de la muestra MMP-3cd activada con una columna de desalinización de 2 ml (consulte la Tabla de materiales), siguiendo el protocolo del fabricante.
    2. Reservar una fracción para el análisis de gel y etiquetarlo como MMP desalinizado. Guárdelo a -80 °C. Si no realiza el análisis de gel, vaya a la sección 4.3 con las muestras restantes.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se congelan a -80 °C y se descongelan más tarde.
  3. Ejecución de los geles SDS-PAGE
    1. Ejecute todas las fracciones de proteínas en geles SDS-PAGE: Fracción no inducida, Fracción inducida, MMP lisado, MMP sonicado, MMP solubilizado, Fracción de flujo, Fracción de lavado, Fracción de elución, MMP replegado, MMP concentrado, MMP activado y MMP desalinizado.
  4. Almacenamiento a largo plazo de MMP-3
    1. Añadir surfactante no iónico al 0,05% (v/v) (véase la Tabla de Materiales) a las muestras deSaladas de MMP-3cd y almacenarlas a -80 °C.

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Resultados

Al ejecutar muestras en SDS-PAGE, debido a que la proteína se expresa en forma de cuerpos de inclusión insolubles, las fracciones lisadas y sonicadas deben contener poco o ningún extracto de Hisx6-pro-MMP-3cd, ya que la proteína aún no se ha resuelto en urea. La Figura 3 compara las fracciones de elución de purificación his-tag de Hisx6-pro-MMP-3cd de células BL21(DE3) y células R2DP. Las fracciones de elución se agruparon por separado para las células BL21(DE3) y R2DP antes de la diálisis. ...

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Discusión

La producción a gran escala de MMP solubles, humanos y recombinantes sigue siendo una tarea desafiante. Las células de mamíferos pueden expresar MMP funcionales a altos costos y largos tiempos de espera, mientras que E. coli produce rápidamente altas cantidades de cuerpos de inclusión MMP que deben ser purificados y replegados11,16. Las células R2DP aumentan significativamente el rendimiento de los cuerpos de inclusión MMP, lo que permite un proceso de r...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Evette Radisky y Alexandra Hockla en la Clínica Mayo en Jacksonville, Florida, por proporcionar el plásmido pET-3a-pro-MMP-3cd como la plantilla para clonar el gen Hisx6pro-MMP-3cd, y sus comentarios, junto con el Dr. Paul Hartley del Centro de Genómica de Nevada en la Universidad de Nevada, Reno, para la secuenciación del ADN. Los autores también desean agradecer a Cassandra Hergenrader por ayudar con parte de la expresión de proteínas. M.R.-S. desea agradecer la subvención NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience y el PREMIO UNR R&D mICRO SEED Grant Award.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y micro; m filtro estérilSigma AldrichSLGP033RSSe utiliza para eliminar algunos contaminantes del extracto proteico antes de la purificación y evitar que la columna de Ni-NTA se obstruya
Matraces Erlenmeyer de 1 LThermo Fisher ScientificS76106F n/a
Botellas de vidrio de 1 LThermo Fisher Scientific06-414-1Dn/A
Tubos de microfuga de 1,5 mLThermo Fisher Scientific02-682-002N/A
Tubos cónicos de 15 mLThermo Fisher Scientific339650n/a
Aguja biselada de 1 pulgada de 18 gAmazonB07S7VBHM2Se utiliza en combinación con el casete de diálisis
Columna de desalinización de 2 mlThermo Fisher Scientific89890Elimina la APMA tras la activación
Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)Thermo Fisher ScientificAAA1610422n/a
Cojines cónicos para botellas de 250mL Thermo Fisher Scientific05-538-53AEstabilización de botellas cónicas durante la centrifugación de grandes volúmenes
Botellas cónicas de 250 ml ThermoFisher Scientific05-538-53n/a
400 mL de celda agitadaSigma Aldrich UFSC40001Reconcentra un volumen mucho mayor que la unidad de filtro centrífugo. Las células Rosetta2(DE3)pLysS producen grandes volúmenes de proteína que pueden superar el límite de 15 mL de la unidad de filtro centrífugo
Acetato de 4-aminofenilmercúrico (APMA)Sigma AldrichA9563-5GActiva MMP-3 mediante la escisión del propéptido
Jeringa de 5 mLThermo Fisher ScientificNC0829167Se utiliza en combinación con el casete de diálisis
Tubos cónicos de 50 mlThermo Fisher Scientific339650Se utiliza para el almacenamiento en muchos pasos de purificación
Tubo de reconcentración de 50 mlSigma AldrichUFC901024DSe utiliza para reconcentrar muestras de proteínas después de la diálisis o eliminar contaminantes
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-500Ingrediente tampón que solidifica los medios LB esterilizados en autoclave al enfriarse
AmpicilinaThermo Fisher ScientificBP1760-25Antibiótico utilizado con el vector pET3a; utilizado en 100 y micro; g/mL en medios LB
BamHINEBR3136SEnzima de restricción que se utilizará con el vector pET3a
Cloruro de calcio (CaCl2)Thermo Fisher Scientific600-30-23El ion calcio estabiliza la estructura MMP
Esparcidores de célulasThermo Fisher Scientific50-189-7544Se puede utilizar para propagar células a través de una placa de Petri después de la transformación
CloranfenicolThermo Fisher Scientific22-055-125GMAntibiótico utilizado con el vector pET3a; utilizado en 34 y micro; g/mL en medios LB
Tampón de diálisis 1n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 y micro; M ZnCl2, 4 M Urea.
Tampón de diálisis 2n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 y micro; M ZnCl2, 2 M Urea.
Tampón de diálisis 3n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 y micro; M ZnCl2.
Pinzas para diálisisThermo Fisher Scientific68011Se utiliza en combinación con tubos de diálisis de piel de serpiente
Tubos de diálisisThermo Fisher Scientific88243Método de diálisis alternativo que contiene volúmenes de muestra mucho mayores, pero con un mayor riesgo de pérdida de muestras
Tampón de digestiónNEBB7204STampón utilizado en la digestión del vector pET3a
Cubetas desechablesThermo Fisher Scientific21-200-257Se utiliza para medir la OD del cultivo bacteriano durante el crecimiento y la expresión
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificD107125G Ayuda con la desnaturalización de proteínas al reducir cualquier enlace disulfuro Mezcla de
ensamblaje de ADNNEBE2621SSe utiliza para ligar el producto de PCR Hisx6-pro-MMP-3cd y el vector pET3a digerido
DNasa INEBM0303SEndonucleasa para degradar contaminantes desfavorables del ADN que posteriormente podrían afectar a la purificación de proteínas
EtanolThermo Fisher ScientificA995-4n/a
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Thermo Fisher ScientificJ15694-AEUtilizado en la desnaturalización. Previene la oxidación y la posterior formación de enlaces disulfuro Kit de
recuperación de gelPromegaA9281 Aíslay purifica el ADN de los geles de agarosa
GlicerolThermo Fisher ScientificG33-500Se utiliza para hacer reservas de glicerol, que se congelan a -80 °C; C
Columna de flujo por gravedadBioRad7321010Se utiliza para la purificación de Ni-NTA de proteínas marcadas con His de forma recombinante Células
de alta eficiencia de transformaciónNEBC2987Células de alta eficiencia de transformación con mayores posibilidades de éxito para la clonación de la etiqueta His-terminal N-terminal en la construcción pET3a-pro-MMP-3cd
Tampón de elución HTn/an/a20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM de NaCl, 6 M de urea, 250 mM de imidazol. Ajuste el pH a 7,4
HT Tampón de equilibrion/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM de NaCl, 6 M de urea. Ajuste el pH a 7,4
HT Tampón de regeneraciónn/an/a20 mM MES, 0,1 M NaCl. Ajuste el pH a 5.0
HT Tampón de lavadon/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM de NaCl, 6 M de urea, 25 mM de imidazol. Ajuste el pH a 7.4
Ácido clorhídrico (HCl)Thermo Fisher ScientificA144C-212Se utiliza para amortiguar el pH
ImidazolThermo Fisher ScientificAAA1022122Imita el grupo lateral de la histidina. Se utiliza para separar proteínas de unión no específica de la proteína diana marcada con his
Tampón corporal de inclusiónn/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0,5 M Urea. Ajuste el pH a 8.0
Isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG)Thermo Fisher ScientificFERR0392 Reactivo que induce la expresión génica diana en pET3a. Prepare 0,5 mL 1 M alícuotas, filtre, esterilice y almacene en -20 & grados; C
LB Amp CamR mediosn/an/a Paraverter en una botella esterilizable de 1 L o en un matraz de 1 L. Para 1 L, agregue 25 g de caldo LB. Esterilizar en autoclave. Una vez enfriado a menos de 50 grados; C, agregue ampicilina a 100 µ g/mL y cloranfenicol a 34 µ g/mL
LB Amp CamR placasn/an/a Paraverter en placas de Petri estériles. Vierta hasta que la tapa de la placa de Petri esté completamente cubierta. 1 L de medio produce 40-60 placas. Para 1 L: 25 g de caldo LB, 16 g de agar. Esterilizar en autoclave. Una vez enfriado a menos de 50 grados; C, agregue ampicilina a 100 µ g/mL y cloranfenicol a 34 µ g/mL
LB CaldoThermo Fisher ScientificBP1426-2Premezclado con triptona, extracto de levadura y cloruro de sodio
Tampón de lisisn/an/a 50mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,133 g/mL de lisozima, 0,49% v/v Triton X-100. Ajuste el pH a 8.0
LysozymeMP Biomedicals195303utiliza en la extracción de proteínas. Enzima que lisa las paredes celulares bacterianas
Kit de minipreparaciónPromegaA1330Si tiene éxito, extrae la construcción pET3a-pro-MMP-3cd de los transformantes
NdeINEBR0111SEnzima de restricción para ser utilizada con la resina de Ni-NTA vector pET3a
Thermo Fisher ScientificPI88221Se utiliza para unirse a proteínas recombinantes marcadas con his. Esta fuerte interacción puede ser desplazada con concentraciones más altas de imidazol
Tensioactivo no iónicoThermo Fisher Scientific PI28316Storage detergente para prevenir la agregación de MMP. Minimiza las interacciones entre los residuos hidrofóbicos en la superficie de MMP y las moléculas de agua, sin interrumpir la actividad catalítica.
Mezcla de PCRNEBM0492SUn reactivo de PCR para insertar un his-tag N-terminal en el vector pET3a-pro-MMP-3cd
plásmido pETAddgenen/aEl vector pET3a ofrece resistencia a la ampicilina, expresión inducible de un gen diana y secuenciación con cebadores T7
Placas de PetriVWR25384-342Se utiliza para la siembra de transformantes en medios de agar LB
Células R2DPNovagen714033Derivados de BL21 con expresión mejorada de proteínas eucariotas. Contienen ARNt de codones que se han encontrado raros en E. coli
Medios de crecimiento SOCNEBB9020SMedios de crecimiento no selectivos para un crecimiento rápido durante la transformación
Cloruro de sodio (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1Se utiliza en tampones y ayuda con la estabilidad de las proteínas
Desoxicolato de sodioThermo Fisher ScientificPI89905Detergente utilizado en la extracción de proteínas. Tampón
solubilizaciónn/an/a20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM de NaCl, 10 mM de DTT, 6 M de urea. Ajuste el pH a 8.0
Tris baseThermo Fisher ScientificBP152-1Tampón común utilizado en el rango de pH fisiológico. Detergente
sensible a la temperatura Triton X-100Thermo Fisher ScientificM1122980101utilizado para la lisis celular
UreaThermo Fisher ScientificAAJ75826A7Primer agente caotrópico para alterar la estructura secundaria de proteínas
Cloruro de zinc (ZnCl2)Thermo Fisher ScientificAAA162810E Estabiliza la estructura MMP. El ion zinc se encuentra en el sitio catalítico de MMP-3
de de paredes celulares de lisis

Referencias

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