Imágenes de autofluorescencia para evaluar el metabolismo celular

Resumen

Este protocolo describe imágenes de fluorescencia y análisis de las coenzimas metabólicas endógenas, nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD). Las imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD proporcionan un método no destructivo sin etiquetas para evaluar el metabolismo celular.

Resumen

El metabolismo celular es el proceso por el cual las células generan energía, y muchas enfermedades, incluido el cáncer, se caracterizan por un metabolismo anormal. La nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y el dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD) son coenzimas de reacciones metabólicas. NAD(P)H y FAD exhiben autofluorescencia y pueden aislarse espectralmente por excitación y longitudes de onda de emisión. Ambas coenzimas, NAD(P)H y FAD, pueden existir en una configuración libre o unida a proteínas, cada una de las cuales tiene una vida útil de fluorescencia distinta, el tiempo durante el cual el fluoróforo permanece en el estado excitado. Las imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) permiten cuantificar la intensidad de fluorescencia y la vida útil de NAD(P)H y FAD para el análisis sin etiquetas del metabolismo celular. La intensidad de fluorescencia y los microscopios de por vida se pueden optimizar para obtener imágenes de NAD(P)H y FAD seleccionando las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas. Las perturbaciones metabólicas por cianuro verifican los protocolos de imágenes de autofluorescencia para detectar cambios metabólicos dentro de las células. Este artículo demostrará la técnica de imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD para medir el metabolismo celular.

Introducción

El metabolismo es el proceso celular de producción de energía. El metabolismo celular abarca múltiples vías, incluyendo la glucólisis, la fosforilación oxidativa y la glutaminólisis. Las células sanas utilizan estas vías metabólicas para generar energía para la proliferación y la función, como la producción de citoquinas por las células inmunes. Muchas enfermedades, incluyendo trastornos metabólicos, cáncer y neurodegeneración, se caracterizan por un metabolismo celular ^alterado1. Por ejemplo, algunos tipos de células cancerosas tienen tasas elevadas de glucólisis, incluso en presencia de oxígeno, para generar moléculas para la síntesis de ácid....

Protocolo

1. Revestimiento celular para imágenes

1. Aspire el medio a partir de un matraz T-75 confluente al 80-90% de células MCF-7, enjuague las células con 10 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y agregue 2 ml de tripsina al 0,25% (1x) para separar las células del fondo del matraz.
2. Incubar el matraz a 37 °C durante ~4 min. Revise las células bajo el microscopio para confirmar el desprendimiento.
3. Agregue inmediatamente 8 ml de medio de cultivo para desactivar la tripsina.
4. Recoger las células en un tubo cónico (15 ml o 50 ml). Cuente las células usando un hemocitómetro.
5. Centrifugar las célula....

Resultados

La línea celular epitelial de cáncer de mama, MCF-7, se cultivó en DMEM suplementada con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Para las imágenes de fluorescencia, las células se sembraron a una densidad de 4 × ¹⁰⁵ células por plato de imágenes con fondo de vidrio de 35 mm 48 h antes de la toma de imágenes. Las células fueron fotografiadas antes y después del tratamiento con cianuro utilizando los protocolos mencionados anteriormente. El objetivo del experimento con cianuro es confi.......

Discusión

La intensidad de la autofluorescencia y las imágenes de por vida han sido ampliamente utilizadas para evaluar el metabolismo en las ^{células21,55}. FLIM es de alta resolución y, por lo tanto, resuelve células individuales, lo cual es importante para los estudios de cáncer porque la heterogeneidad celular contribuye a la agresión tumoral y la resistencia a los medicamentos7,39,41,44,45,46,58.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-desoxi-d-glucosa (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050;
Antibiótico Antimicrobiano (pen-strep)	Gibco	15240096
muestras de células	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 línea de cáncer
CellProfiler Broad	Institute	N/A	Software de análisis de imágenes
Tubo cónico	VWR	89039-664	Tubo cónico de 15 mL
DMEM	ThermoFisher	11965092	Medios de cultivo
Espejo dicroico FAD	Semrock	FF495-Di03-25x36	495 nm
Filtro de emisión FAD	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
Filtro de excitación FAD	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Microscopio de fluorescencia de por vida	3i	N/A
Plato con fondo de vidrio	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Láser multifotónico	coherente	N/A	2P Láser coherente, sintonizable 680 nm-1080 nm
Espejo dicroico NAD(P)H	Semrock	FF409-Di03-25x36	409 nm
Filtro de emisiones NAD(P)H	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
Filtro de excitación NAD(P)H	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Cianuro de potasio	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Software de adquisición de imágenes
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Software de análisis de la vida útil de la fluorescencia
Incubadora superior de etapa	okoLab	N/A
Tripsina	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Microesferas Yg (20.0 & m)