Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

Summary

Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.

Abstract

El cilio primario es un orgánulo de señalización crítico que se encuentra en casi todas las células que transduce los estímulos de señalización de Hedgehog (Hh) desde la superficie celular. En el precursor de células granulares (GCP), el cilio primario actúa como un centro de señalización fundamental que orquesta la proliferación de células precursoras mediante la modulación de la vía de señalización de Hh. La investigación de la maquinaria de señalización de Hh dependiente del cilio primario se ve facilitada por la manipulación genética in vitro de los componentes de la vía para visualizar su localización dinámica en el cilio primario. Sin embargo, la transfección de transgenes en los cultivos primarios de GCP utilizando los métodos de electroporación actualmente conocidos es generalmente costosa y a menudo resulta en una baja viabilidad celular y una eficiencia de transfección indeseable. Este documento presenta un protocolo de electroporación eficiente, rentable y simple que demuestra una alta eficiencia de transfección de ~ 80-90% y una viabilidad óptima de la celda. Este es un método de modificación genética simple, reproducible y eficiente que es aplicable al estudio de la vía de señalización primaria de Hedgehog dependiente del cilio en cultivos primarios de GCP.

Introduction

Los GCP cerebelosos son ampliamente utilizados para estudiar la maquinaria de la vía de señalización de Hh en tipos de células progenitoras neuronales debido a su alta abundancia y alta sensibilidad a la vía de señalización de Hh in vivo1,2,3,4. En los GCP, el cilio primario actúa como un centro de transducción de señal Hh ^fundamental5 que orquesta la proliferación de las células precursoras6,7,8. La visualización

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con los animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de manejo de animales y el protocolo aprobado por el Departamento de Salud de Hong Kong. Las licencias de experimentación con animales siguiendo la Ordenanza de Animales (Control de Experimentos) (Cap. 340) se obtuvieron del Departamento de Salud del Gobierno de Hong Kong. El trabajo con animales se llevó a cabo de conformidad con la ética de seguridad animal aprobada por la Oficina de Investigación de HKBU y el Comité de Seguridad de Laboratorio. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en est....

Results

Utilizando el Opti-MEM (ver la Tabla de Materiales) como reactivo universal, esta metodología de electroporación propuesta podría lograr una eficiencia de electroporación consistentemente alta a ~ 80-90% (Figura 1). La eficiencia de electroporación del vector Smo-EGFP se determinó en DIV 2 después de la electroporación mediante la cuantificación del porcentaje de células verdes positivas para fluorescencia en todas las células GCP pareadas que expresan la proteína 6 (Pax6). .......

Discussion

La transfección de transgenes en cultivo primario de GCP por electroporación se asocia típicamente con baja viabilidad celular y baja eficiencia de ^{transfección9,10}. Este documento presenta un protocolo de electroporación rentable y reproducible que ha demostrado una alta eficiencia y viabilidad. Además, también demostramos un método sencillo para estudiar la vía de señalización Hh dependiente del cilio primario en células GCP primarias.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 suplemento	Life Technologies LTD	17504044
Filtro de células, 70 µ m	Corning	352350
DNasa I de páncreas bovino	Roche	11284932001
Earle' s Solución salina equilibrada	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, calificado	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I, 100x	Gibco, Life Technologies	35050061	sustituto de L-glutamina
L-cisteína	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Matriz de membrana basal
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papaína, suspensión	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma Aldrich	P6407
SAG Cayman	Chemical	11914-1	Tinción agonista
IF suavizada
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldehído	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Mezcla de anticuerpos primarios
Anti-GFP-cabra ab	Rockland	600-101-215	Factor de dilución: 1 : 1000
Anti-Arl13b monoclonal de ratón ab	NeuroMab	75-287 Factor de	dilución: 1 : 1000
Anti-Pax6 conejo policlonal ab	Covance	PRB-278P Factor de	dilución: 1 : 1000
Mezcla de anticuerpos secundarios
Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG	Invitrogen	A-11055	Factor de dilución: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 burro anti-ratón IgG	Invitrogen	A-31570 Factor de	dilución: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 burro anti-conejo IgG	Invitrogen	A-31573 Factor de	dilución: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Factor de dilución: 1 : 1000
Electroporation
cubetas	Nepagene	CU500
Cubeta de electroporación EPA (espacio de 2 mm)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	medio de suero reducido para transfección
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TIPO II Electroporación in vitro e in vivo	Nepagene	NEPA21	electroporador