Manipulación subcelular espaciotemporal del citoesqueleto de microtúbulos en el embrión de ratón vivo preimplantacional utilizando fotostatinas

Resumen

Los inhibidores típicos de los microtúbulos, utilizados ampliamente en la investigación básica y aplicada, tienen efectos de gran alcance en las células. Recientemente, las fotostatinas surgieron como una clase de inhibidores de microtúbulos fotoconmutables, capaces de manipular instantáneamente, reversible y espaciotemporalmente precisa de microtúbulos. Este protocolo paso a paso detalla la aplicación de fotostatinas en un embrión de ratón preimplantacional vivo en 3D.

Resumen

El citoesqueleto de microtúbulos forma el marco de una célula y es fundamental para el transporte intracelular, la división celular y la transducción de señales. La interrupción farmacológica tradicional de la red de microtúbulos ubicuos utilizando, por ejemplo, nocodazol puede tener consecuencias devastadoras para cualquier célula. Los inhibidores de microtúbulos fotoconmutables reversiblemente tienen el potencial de superar las limitaciones al permitir que los efectos de los medicamentos se implementen de una manera controlada espaciotemporalmente. Una de esas familias de medicamentos son las fotostatinas a base de azobenceno (PST). Estos compuestos son inactivos en condiciones de oscuridad, y al iluminarse con luz UV, se unen al sitio de unión a la colchicina de β-tubulina y bloquean la polimerización del microtúbulo y la rotación dinámica. Aquí, la aplicación de PST en el embrión de ratón preimplantacional vivo de 3 dimensiones (3D) se establece para interrumpir la red de microtúbulos a nivel subcelular. Este protocolo proporciona instrucciones para la configuración experimental, así como parámetros de activación y desactivación de la luz para PST que utilizan microscopía confocal de células vivas. Esto asegura la reproducibilidad y permite a otros aplicar este procedimiento a sus preguntas de investigación. Los fotointerruptores innovadores como los PST pueden evolucionar como herramientas poderosas para avanzar en la comprensión de la red dinámica de microtúbulos intracelulares y para manipular de forma no invasiva el citoesqueleto en tiempo real. Además, los PST pueden resultar útiles en otras estructuras 3D como organoides, blastoides o embriones de otras especies.

Introducción

La arquitectura de los microtúbulos varía ampliamente entre los diferentes tipos de células para admitir diversas funciones ^1,2. Su naturaleza dinámica de crecimiento y contracción permite una rápida adaptación a las señales extra e intracelulares y responder a las necesidades siempre cambiantes de una célula. Por lo tanto, se puede considerar como la "huella morfológica" que juega un papel clave en la identidad celular.

La orientación farmacológica del citoesqueleto de microtúbulos utilizando inhibidores de moléculas pequeñas ha llevado a una gran cantidad de descubrimientos fundam....

Protocolo

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Monash bajo el número de ética animal 19143. Los animales fueron alojados en condiciones específicas de hogar de animales libres de patógenos en la instalación de animales (Monash Animal Research Platform) en estricta conformidad con las pautas éticas.

1. Colección de embriones de ratón preimplantacionales

1. Ratones superovulados y de pareja descritos anteriormente^16,18, en cumplimiento de las directrices institucionales de ética animal.
   NOTA: Las cepas más utilizadas para la recolección d....

Resultados

De acuerdo con el protocolo, los embriones de ratón preimplantacionales fueron microinyectados con ARNc para EB3, marcados con dTomato fluorescente rojo (EB3-dTomato). Esto permite la visualización de microtúbulos en crecimiento a medida que EB3 se une a los microtúbulos polimerizantes más los extremos²⁴.

Los experimentos se realizaron 3 días después de la fertilización (E3) cuando el embrión de ratón está compuesto por 16 células. Se puede utilizar cualquier otra etapa.......

Discusión

La red de microtúbulos es parte integral del funcionamiento interno fundamental de una célula. En consecuencia, esto presenta desafíos en la manipulación de la dinámica de los microtúbulos en los organismos vivos, ya que cualquier perturbación en la red tiende a tener consecuencias generalizadas para todos los aspectos de la función celular. La aparición de compuestos fotoconmutables dirigidos a microtúbulos presenta una forma de manipular con precisión el citoesqueleto a nivel subcelular, con un control superior para la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo aspirador	Sigma-Aldrich	A5177	Para aparato de aspiración bucal
Portaobjetos de cámara - LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
codificación de ARNc para EB3-dTomato	N/A	N/A	Preparado según las instrucciones del fabricante utilizando mMessage in vitro Transcription kit Placas
cultivo - 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Hormona de crecimiento coriónica humana	Sigma-Aldrich	C8554
fluido tubárico humano (HTF)	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Software de análisis de imágenes	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	Para usar con objetivo de inmersión de microscopio
Linterna LED - Luz roja	Celestron	93588
M2 mediano	Sigma-Aldrich	M7167
Ratones - tipo salvaje FVB/N, machos y hembras	N/A	N/A	Hembras de 8-9 semanas de edad. Machos de 2 a 6 meses de edad.
Pipetas microcapilares - Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	Para aparato de aspiración bucal
Tampón de microinyección	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4
Aceite mineral	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Kit de transcripción	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Espectrofotómetro	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM)	medio Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Yegua embarazada suero gonadotropina	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Inhibidores fotoconmutables de la dinámica de los microtúbulos controlan ópticamente la mitosis y la muerte celular. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
Kit de purificación de ARN	Sangon	B511361-0100
Agua ultrapura	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss