Montaje y caracterización de un driver externo para la generación de flujo oscilatorio sub-kilohercios en microcanales

Summary

El protocolo demuestra un método conveniente para producir flujo oscilatorio armónico de 10-1000 Hz en microcanales. Esto se realiza interconectando un diafragma de altavoz controlado por computadora con el microcanal de manera modular.

Abstract

La tecnología microfluídica se ha convertido en una herramienta estándar en los laboratorios químicos y biológicos tanto para el análisis como para la síntesis. La inyección de muestras líquidas, como reactivos químicos y cultivos celulares, se logra predominantemente a través de flujos constantes que generalmente son impulsados por bombas de jeringas, gravedad o fuerzas capilares. El uso de flujos oscilatorios complementarios rara vez se considera en aplicaciones a pesar de sus numerosas ventajas, como se ha demostrado recientemente en la literatura. La importante barrera técnica para la implementación de flujos oscilatorios en microcanales es probablemente responsable de la falta de su adopción generalizada. Las bombas de jeringa comerciales avanzadas que pueden producir flujo oscilatorio, a menudo son más caras y solo funcionan para frecuencias inferiores a 1 Hz. Aquí, se demuestra el montaje y operación de un aparato basado en altavoces de bajo costo, tipo plug-and-play, que genera flujo oscilatorio en microcanales. Se pueden lograr flujos oscilatorios armónicos de alta fidelidad con frecuencias que van desde 10-1000 Hz junto con un control de amplitud independiente. Se pueden lograr amplitudes que van desde 10-600 μm en todo el rango de operación, incluidas amplitudes > 1 mm a la frecuencia de resonancia, en un microcanal típico. Aunque la frecuencia de oscilación está determinada por el altavoz, ilustramos que la amplitud de oscilación es sensible a las propiedades del fluido y la geometría del canal. Específicamente, la amplitud de oscilación disminuye con el aumento de la longitud del circuito del canal y la viscosidad del líquido, y en contraste, la amplitud aumenta con el aumento del grosor y la longitud del tubo del altavoz. Además, el aparato no requiere características previas para ser diseñado en el microcanal y es fácilmente desmontable. Se puede utilizar simultáneamente con un flujo constante creado por una bomba de jeringa para generar flujos pulsátiles.

Introduction

El control preciso del caudal de líquido en microcanales es crucial para aplicaciones de laboratorio en un chip, como la producción de gotas y la encapsulación¹, la mezcla ^2,3 y la clasificación y manipulación de partículas en suspensión ^4,5,6,7. El método predominantemente utilizado para el control de flujo es una bomba de jeringa que produce flujos constantes altamente controlados que dispensan un volumen fijo de líquido o un caudal volumétrico fijo, a menudo limitado a un flujo completamente unidireccional. Las estrategias alternativas para producir flujo unidireccional incluyen el uso de la cabeza gravitacional⁸, las fuerzas^{capilares 9} o el flujo electro-osmótico¹⁰. Las bombas de jeringa programables permiten un control bidireccional dependiente del tiempo de los caudales y los volúmenes dispensados, pero se limitan a tiempos de respuesta superiores a 1 s debido a la inercia mecánica de la bomba de jeringa.

El control de flujo a escalas de tiempo más cortas desbloquea una gran cantidad de 6,11,12,13,14,15 de posibilidades que de otro modo serían inaccesibles debido a cambios cualitativos en la física de flujo. El medio más práctico de aprovechar esta variada física de flujo es a través de ondas acústicas o flujos oscilatorios con períodos de tiempo que van desde ^{10-1- 10-9} s o 10¹ -10⁹ Hz. Se accede al extremo superior de este rango de frecuencia utilizando dispositivos de onda acústica a granel (BAW; 100 kHz-10 MHz) y onda acústica superficial (SAW; 10 MHz-1 GHz). En un dispositivo BAW típico, todo el sustrato y la columna de fluido vibran aplicando una señal de voltaje a través de un piezoeléctrico unido. Esto permite rendimientos relativamente altos, pero también da como resultado un calentamiento a amplitudes más altas. En los dispositivos SAW, sin embargo, la interfaz sólido-líquido oscila aplicando voltaje a un par de electrodos interdigitados modelados sobre un sustrato piezoeléctrico. Debido a las longitudes de onda muy cortas (1 μm-100 μm), partículas tan pequeñas como 300 nm pueden ser manipuladas con precisión por la onda de presión generada en los dispositivos SAW. A pesar de la capacidad de manipular partículas pequeñas, los métodos SAW se limitan a la manipulación de partículas locales, ya que la onda se atenúa rápidamente con la distancia de la fuente.

En el rango de frecuencia de 1-100 kHz, los flujos oscilatorios generalmente se generan utilizando elementos piezoeléctricos que están unidos a un microcanal de polidimetilsiloxano (PDMS) sobre una cavidad diseñada^16,17. La membrana PDMS por encima de la cavidad estampada se comporta como una membrana vibratoria o tambor que presuriza el fluido dentro del canal. En este rango de frecuencia, la longitud de onda es mayor que el tamaño del canal, pero las amplitudes de velocidad de oscilación son pequeñas. El fenómeno más útil en este régimen de frecuencias es la generación de flujos de flujo acústicos/viscosos, que son flujos constantes rectificados causados por la no linealidad inherente al flujo de líquidos con inercia¹⁸. Los flujos de flujo constante generalmente se manifiestan como vórtices contrarrotatorios de alta velocidad en las cercanías de obstáculos, esquinas afiladas o microburbujas. Estos vórtices son útiles para mezclar^19,20 y separar partículas de 10 μm de tamaño de la corriente de flujo²¹.

Para frecuencias en el rango de 10-1000 Hz, tanto la velocidad del componente oscilatorio como su flujo viscoso constante asociado son considerables en magnitud y útiles. Los flujos oscilatorios fuertes en este rango de frecuencia se pueden utilizar para el enfoque inercial²², facilitar la generación^{de gotas 23} y pueden generar condiciones de flujo (números de Womersley) que imitan el flujo sanguíneo para estudios in vitro . Por otro lado, los flujos de transmisión son útiles para la mezcla, el atrapamiento de partículas y la manipulación. El flujo oscilatorio en este rango de frecuencias también se puede lograr utilizando un elemento piezoeléctrico unido al dispositivo como se describió anteriormente²³. Un obstáculo importante para implementar flujos oscilatorios a través de un elemento piezoeléctrico unido es que requiere que las características se diseñen de antemano. Además, los elementos del altavoz enlazados no son desmontables, y se debe unir un nuevo elemento a cada dispositivo²⁴. Sin embargo, tales dispositivos presentan la ventaja de ser compactos. Un método alternativo es el uso de una válvula de relé electromecánica²⁰. Estas válvulas requieren fuentes de presión neumáticas y software de control personalizado para su operación y, por lo tanto, aumentan la barrera técnica para las pruebas y la implementación. Sin embargo, tales dispositivos permiten la aplicación de la amplitud y frecuencia de presión establecidas.

En este artículo, se describe la construcción, operación y caracterización de un método fácil de usar para generar flujos oscilatorios en el rango de frecuencia de 10-1000 Hz en microcanales. El método ofrece numerosas ventajas, como un montaje rentable, facilidad de operación y listo para interactuar con canales microfluídicos estándar y accesorios como bombas de jeringa y tubos. Además, en comparación con enfoques similares anteriores²⁵, el método ofrece al usuario un control selectivo e independiente de las frecuencias y amplitudes de oscilación, incluida la modulación entre formas de onda sinusoidales y no sinusoidales. Estas características permiten a los usuarios implementar fácilmente flujos oscilatorios y, por lo tanto, facilitan la adopción generalizada en una amplia gama de tecnologías y aplicaciones microfluídicas actualmente existentes en los campos de la biología y la química.

Protocol

1. Diseño y fabricación rápida de moldes de prototipos

1. Abra AutoCAD en un PC. Seleccione Archivo en la barra de tareas, luego seleccione Abrir y busque y haga clic en un archivo de modelo tridimensional (3D) del molde de canal que tiene .dxf o .dwg extensión.
2. Seleccione todo el modelo haciendo clic y arrastrando un cuadro a su alrededor. Exporte el diseño como un archivo .stl seleccionando Archivo | Exportar, luego Otros formatos y elegir .stl en el cuadro desplegable. 
3. Cargue el archivo en una impresora estereolitográfica de resina (SLA) de alta precisión como Formlabs FORM3. Vierta la resina en la cámara de resina e inicie la impresión y produzca el molde con los pasos más pequeños del eje Z (25 micras para la resina FORMLABS CLEAR).
4. Espere a que se complete la impresión automática de piezas.
   NOTA: Los moldes con características tan pequeñas como 0,1 mm se pueden fabricar de esta manera.
5. Después de retirar la pieza de la resina, agitarla en isopropanol durante 5 minutos para eliminar cualquier resina restante.
6. Secar el molde con aire o gas nitrógeno durante 2 min.
   NOTA: Las fabricaciones de moldes microfluídicos convencionales con obleas de silicio y la fotolitografía con cualquier fotorresistente SU8 o KMPR también se pueden utilizar para producir un molde con características más pequeñas.
7. Curar el molde seco a 60 °C en luz UV durante un máximo de 1 h.

2. Fabricación de microcanales PDMS

1. Coloque el molde sobre una lámina de papel de aluminio. Para facilitar la delaminación de PDMS, cubra el molde con liberación de molde de silicona en 1 o 2 pasadas.
2. Vierta la resina PDMS y el reticulante en una taza desechable en la proporción de 10: 1 por peso y mezcle con una cuchara desechable.
3. Vierta la mezcla resultante sobre el molde para producir una película del espesor requerido. Para evitar la deformación de la pared del canal grande, mantenga el espesor pdmS de más de 5 mm o 3-4 veces el espesor máximo de la característica.
4. Coloque el molde con PDMS vertido en la cámara de desgasificación y cierre la tapa. Asegúrese de que la junta tórica selle herméticamente la cámara.
5. Cierre la válvula de escape y encienda la bomba de vacío para iniciar la desgasificación.
6. Desgasifica la mezcla vertida en una bomba de vacío durante más de 4-6 ciclos con una duración aproximada de 5 minutos. Retire manualmente las burbujas restantes (en esquinas y zanjas) con un alambre fino.
7. Ajuste la temperatura del horno a 80 °C y deje que se precaliente. Coloque la mezcla en el horno a 80 °C durante 2 h para curar.
8. Retire el molde curado del horno y déjelo a temperatura ambiente durante 10 minutos para que se enfríe.
9. Usando un bisturí, corte cuidadosamente los bordes del molde. Para una delaminación óptima, use una jeringa para inyectar isopropanol entre el molde y el PDMS curado.
10. Despegue el PDMS curado del molde y córtelo en dispositivos individuales con una cuchilla de afeitar. El tamaño de cada dispositivo debe oscilar entre 10 mm x 10 mm y 30 mm x 70 mm para unirse con el portaobjetos de vidrio.
11. Haga un orificio de 1.0-3.0 mm de diámetro en la entrada y salida usando un punzón de biopsia.
12. Encienda el generador de plasma de radiofrecuencia (RF) de mano. Para activar el portaobjetos de vidrio, pase constantemente el electrodo de alambre sobre un portaobjetos de vidrio seco limpio varias veces durante 2 minutos. Mantenga un espacio de alambre a vidrio de aproximadamente 5 mm. Coloque el lado del dispositivo del PDMS curado en contacto con el portaobjetos de vidrio activado y luego colóquelo en un horno de 80 °C durante 2 h.
13. Corte los tubos de entrada y salida de polietileno a la longitud requerida e insértelos en los orificios de entrada y salida.
14. Para evitar el desprendimiento del tubo durante la operación, aplique sellador de silicona en la superficie de contacto y deje curar durante 2 h para asegurar el tubo.

3. Conjunto del controlador oscilatorio

1. Sujete los extremos del clip de cocodrilo de un par de cables de cocodrilo a pasador a los terminales de un altavoz. Aquí se utilizó un altavoz de 15 W con un cono de 8 cm, aunque también se pueden usar otros altavoces.
2. Coloque el chip controlador auxiliar en un contenedor aislante. Inserte los extremos del pasador en los zócalos de los tornillos del chip controlador auxiliar y apriete firmemente con un destornillador para garantizar la conectividad.
3. Conecte un extremo de un cable auxiliar al chip controlador y el otro extremo a un puerto auxiliar en una computadora o teléfono inteligente.
4. Conecte un adaptador de corriente continua (CC) de 12 V a la fuente de alimentación. Encienda el chip controlador conectando el extremo coaxial del adaptador de CC a la toma de corriente.
5. Usando un navegador de Internet, navegue a un sitio web generador de tonos en línea (por ejemplo, https://www.szynalski.com/tone-generator/ ).
6. Escriba la frecuencia deseada (5-1200 Hz) en la aplicación en línea. Desplácese por la barra de volumen hasta la cantidad requerida (por ejemplo, 100%).
7. Haga clic en el símbolo generador de tipo de onda y seleccione la forma de onda deseada (seno, cuadrado, triángulo, diente de sierra). Tenga en cuenta que el valor predeterminado es una forma de onda sinusoidal. Pulse Reproducir para accionar el altavoz.

4. Conjunto del adaptador

NOTA: El conjunto completo del adaptador de altavoz a tubo se ilustra con el esquema de la Figura 1.

1. Fije el altavoz (Figura 1(I)) en el soporte del altavoz impreso en 3D (Figura 1(II)) (consulte speakermount.stl en el archivo complementario 1) pegando una cinta sobre la superficie curva y a ambos lados del soporte.
2. Oriente el altavoz verticalmente con la superficie del cono del altavoz hacia arriba. Coloque el adaptador impreso en 3D (Figura 1(III)) (consulte speakertubeadapter.stl en el archivo complementario 2) concéntricamente en el cono del altavoz.
3. Aplique el sellador de silicona generosamente a lo largo de los bordes del adaptador y deje curar durante 2 h.
4. Coloque el altavoz y el soporte del altavoz en el escenario del microscopio y coloque la cinta adhesiva para evitar el movimiento durante la operación.
5. Corte una punta de micropipeta de 200 μL aproximadamente a 2 cm de su extremo estrecho y deseche la mitad más ancha de la punta. El extremo cónico estrecho servirá como un sello de cuña para la fijación reversible.
6. Conecte el tubo de polietileno (Figura 1(V)) a la salida del microcanal (Figura 1(VI)) roscando primero a través de la punta de la micropipeta (Figura 1(IV)), y luego a través del extremo coaxial del adaptador y finalmente saliendo por el lateral.
7. Cuña firmemente el extremo estrecho de la punta de la pipeta en el extremo coaxial del adaptador para crear un sello hermético desmontable.

5. Funcionamiento de la configuración experimental para flujos oscilatorios en microcanales

1. Agregue partículas trazadoras en un vial de solución de glicerol al 22% en peso/peso (p/p) para producir una suspensión neutramente flotante con una fracción de volumen de poliestireno al 0,01%-0,1% en líquido a 20 °C. Mezclar vigorosamente agitando para producir una suspensión homogénea.
2. Cargue una jeringa de entrada de 1 ml con 1 ml de muestra. Monte y sujete la jeringa cargada en una bomba de jeringa automática. Inserte la aguja de la jeringa en el tubo de entrada del dispositivo para crear un sello estanco.
3. Asegúrese de que el tubo de salida se enruta a través del conjunto del adaptador y en un depósito (consulte la sección anterior sobre el conjunto del adaptador).
4. Encienda la bomba de la jeringa. Usando la pantalla táctil, seleccione el tipo de jeringa como Becton-Dickinson 1 mL. A continuación, seleccione Infundir. A continuación, seleccione el caudal requerido (0-1 mL/min) o el volumen de caudal (< 1 mL).
5. Inicie el flujo constante utilizando la bomba de jeringa. Espere hasta que haya fluido suficiente volumen de líquido y el tubo de salida se llene de líquido hasta el altavoz.
   NOTA: La amplitud oscilatoria para un ajuste dado no variará con el flujo de transporte constante si el tubo de salida está cebado.
6. Seleccione una frecuencia, amplitud y forma de onda requeridas en la aplicación generador de tonos como se describe en el paso 3.5 y presione Reproducir para generar flujo oscilatorio dentro del microcanal.

6. Observación y medición de amplitud

1. Monte el dispositivo en el microscopio. Configure la configuración óptica seleccionando una lente objetivo con un aumento entre 10x y 40x ajustando el plano focal y posicionando el escenario.
2. Para obtener mediciones en un plano focal bien definido, asegúrese de que la profundidad de campo de la lente del objetivo sea menor que la profundidad del canal por un factor de 5 o más.
3. Para observar el flujo oscilatorio, utilice una cámara de alta velocidad con una velocidad de fotogramas de al menos el doble de la frecuencia de oscilación calculada utilizando el teorema de muestreo de Nyquist. Para una resolución prácticamente útil de la forma de onda, mida al menos 10 puntos por período de tiempo utilizando una velocidad de fotogramas > 10 veces la de la frecuencia de oscilación.
4. Alternativamente, para observar solo los efectos rectificados o a largo plazo de los flujos pulsátiles, realice imágenes estroboscópicas ajustando la frecuencia de observación a cualquier divisor perfecto de la frecuencia de oscilación.
5. Para imágenes directas y estroboscópicas, utilice una cámara equipada con un obturador global para evitar el efecto gelatina. En cualquier caso, mantenga el tiempo de exposición considerablemente más pequeño que el período de tiempo de oscilación (por un factor de 10 o más) para evitar rayas.
6. Para medir la amplitud de oscilación sin una cámara de alta velocidad, grabe a una velocidad de fotogramas mantenida cerca pero no igual a la velocidad de fotogramas estroboscópica (por ejemplo, 49 fotogramas/s para una señal de 50 Hz). Esto da como resultado una oscilación altamente ralentizada a partir de la cual se puede medir con precisión la amplitud.
7. Observe y registre las mediciones de amplitud.

Results

Para ilustrar la capacidad y el rendimiento de la configuración anterior, se presentan resultados representativos del flujo oscilatorio en un microcanal lineal simple con una sección transversal cuadrada. El ancho y la altura del canal son de 110 μm y su longitud es de 5 cm. En primer lugar, describimos el movimiento de las partículas trazadoras de poliestireno esférico y cómo se pueden utilizar para comprobar la fidelidad de la señal oscilatoria, así como el rango de amplitudes de oscilación alcanzables. Luego discutimo...

Discussion

Hemos demostrado el montaje (ver protocolo pasos críticos 3 y 4) y operación (ver protocolo pasos críticos 5 y 6) de un aparato basado en altavoces externos para la generación de flujo oscilatorio con frecuencias en el rango de 10 a 1000 Hz en dispositivos microfluídicos. El seguimiento de partículas trazadoras en suspensión es necesario para determinar la fidelidad del movimiento armónico, así como para calibrar el rango de amplitudes de oscilación alcanzables en el rango de frecuencias de funcionamiento. La curva ampli...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oscilador Ensamblaje de Driver
Cable de caimán a pin	Adafruit	3255	Pequeño clip de cocodrilo a cable de puente macho (12)
Cable auxiliar	Adafruit	2698	3,5 mm Cable estéreo macho/macho 1 m
Chip controlador	Damgoo	TPA3116	50w+50w Amplificador de audio de 2 canales (bluetooth y AUX)
DC adaptador	Adafruit	798	12 V DC 1A Adaptador de corriente de conmutación regulado
Punta de micropipeta	VWR Signature	37001-532	200 ul Punta de micropipeta
Sellador de silicona	Loctite	908570	Sellador impermeable de silicona transparente (80 ml)
Altavoz	Drok	6843996	Altavoz de 4,5 pulgadas 4 Ohm 40 W
Soporte de			altavozImpreso en 3D a partir de 'speakermount.stl' en archivos complementarios
		de altavoz a tubo	impreso en 3D a partir de 'speaketubeadapter.stl' en archivos complementarios
Microchannel Manufacture
biopsia	Miltex	15110	Punzón de biopsia con émbolo (1 - 4 mm)
Desgasificador
Vaso
Cuchara
Portaobjetos de vidrio	VWR Signature	16004-430	3" x 1" prelimpieza de 1 mm de espesor
			Si - SU-8 o impreso en 3D
Horno	Fischer Scientific		Isotemp
PDMS resina y reticulante	Dow Chemical	4019862	Sylgard 184 PDMS resina y reticulante (500 g)
Tubo de polietileno	Becton Dickinson Intramedic	427440	Tubo de polietileno (PE 60 - PE 200)
Hojas de afeitar	VWR	55411-050 Hojas de	afeitar industriales de un solo filo Generador
plasma RF	Electro-Technic Products	BD - 20	Generador de alta frecuencia
Liberación de molde de silicona	CRC	03301	Liberación de molde de silicio de grado alimenticio (16 oz)
Observación y caracterización
Cámara	Edgertronic		SC2 +
Lente	Nikon		Plan Fluor 10x
Microscopio	Nikon		Ti Eclipse etapa manual
Agujas	Becton Dickinson	305175	Jeringa PrecisionGlide 20G
	Becton Dickinson 1180100555		Monoject 1 ml
Bomba de jeringa	Harvard Apparatus		Doble jeringa bomba de jeringa programable
Partículas trazadoras	Spherotech	PP-10-10	Partículas trazadoras de poliestireno 1 mmm