Artículo de método

Diseño y microinyección de oligonucleótidos y ARNm antisentido morfolino en embriones de pez cebra para dilucidar la función específica de genes en el desarrollo cardíaco

DOI:

10.3791/63324

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9 de agosto de 2022

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1Biomedical Research Center, Qatar University, Doha, Qatar, 2Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Science, Qatar University, Doha, Qatar, 3Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin, 4Department of Pediatrics, Medical College of Wisconsin

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe el diseño, la preparación y la microinyección de un morfolino de bloqueo traslacional contra un gen cardíaco representativo; Derivados del corazón y la cresta neural expresados2 (mano2) en la yema de embriones de pez cebra recién fertilizados para reducir la función génica. También muestra un rescate transitorio de estos "morfantes" mediante la coinyección de ARNm que codifica este producto génico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sistema de knockdown basado en oligómeros de morfolinos se ha utilizado para identificar la función de varios productos génicos a través de la pérdida o la reducción de la expresión. Los morfolinos (MO) tienen la ventaja en estabilidad biológica sobre los oligonucleótidos de ADN porque no son susceptibles a la degradación enzimática. Para una eficacia óptima, los MO se inyectan en embriones de 1 a 4 células. La eficacia temporal del knockdown es variable, pero se cree que los MO pierden sus efectos debido a la dilución eventualmente. La dilución de morfolino y la cantidad de inyección deben controlarse estrechamente para minimizar la aparición de efectos fuera del objetivo mientras se mantiene la eficacia en el objetivo. Se deben realizar herramientas complementarias adicionales, como CRISPR/Cas9, contra el gen diana de interés para generar líneas mutantes y confirmar el fenotipo del morfante con estas líneas. Este artículo demostrará cómo diseñar, preparar y microinyectar un morfolino que bloquea la traducción contra hand2 en la yema de embriones de pez cebra en etapa celular 1-4 para derribar la función hand2 y rescatar estos "morfantes" mediante la coinyección de ARNm que codifica el ADNc correspondiente. Posteriormente, se evalúa la eficacia de las microinyecciones de morfolino verificando primero la presencia de morfolino en la yema (coinyectado con rojo de fenol) y luego mediante análisis fenotípico. Además, se discutirá el análisis funcional cardíaco para probar la eficacia del knockdown. Por último, se explicará la evaluación del efecto del bloqueo de la traducción génica inducido por morfolinos a través de Western blot.

Introducción

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La utilización del pez cebra como modelo para el estudio del desarrollo y la enfermedad cardiovascular ofrece una variedad de ventajas, incluida la alta conservación de la función génica, la transparencia óptica, el rápido desarrollo cardiovascular y el costo más barato en comparación conlos modelos in vivo tradicionales. Los oligonucleótidos morfolinos (MO) son las herramientas de eliminación de genes antisentido más utilizadas para el modelo de pez cebra. Los MO se utilizan con frecuencia para determinar un fenotipo o para sondear la función de los genes. El Dr. James Summerton desarrolló inicialmente el sistema de administración de morfolino para la inhibición in vivo de la traducción del ARNm como un intento de desarrollar terapias para los defectos del desarrollo humano 2,3. Los MO se han utilizado para que los organismos modelo in vitro e in vivo eliminen genes e investiguen las consecuencias de esta eliminación en el fenotipo. Esto se hace observando alteraciones en el desarrollo de órganos específicos, por ejemplo, el corazón. La desactivación de genes específicos del corazón en embriones de pez cebra WT condujo a la falla de un latido cardíaco adecuado, lo que atestigua la función indispensable de estos genes para el desarrollo del corazón 4,5. Estos fenotipos fueron rescatados por co-inyección de ARNm para los genes específicos. Un estudio con troponina T cardíaca (Tnnt2) demostró que la expresión de ARNm de tnnt2 de longitud completa podría rescatar fenotipos sarcoméricos causados por la eliminación de morfolino6. Otro estudio reveló que la integridad de las bandas A y los discos Z podría restaurarse mediante la sobreexpresión del ARNm del ortólogo regulador de la cadena ligera de miosina (cmlc2) en los morfantes cmcl2 7.

Los MO se utilizan habitualmente para reducir la expresión génica dirigiéndose al empalme del pre-ARNm o bloqueando la traducción. Los MO que bloquean el empalme se unen e inhiben el pre-ARNm al inhibir el empalme. El bloqueo traduccional ocurre cuando el MO se une a la región 5' no traducida del ARNm complementario para dificultar el ensamblaje de ribosomas. Los MO son el método específico de genes más utilizado para eliminar la expresión génica en modelos in vivo ; también son los agentes bloqueadores de ARNm más eficientes utilizados en cultivos celulares. El morfolino en sí mismo generalmente consiste en una cadena corta (alrededor de 25) de bases de subunidades de morfolino. Cada subunidad de MO incluye una base de ácido nucleico, un anillo de morfolina y un fosforodiamidato no iónico. Los diferentes mecanismos de acción de los dos tipos de MO requieren diferentes pruebas para verificar la eficacia del derribo. En el caso de los MO que bloquean la traducción, el análisis de Western blot es la prueba más fiable de eficacia, ya que la proteína de interés no debe producirse debido al bloqueo del sitio de inicio de la traducción de ATG. Los MO no degradan directamente su ARNm objetivo; En cambio, se unen a regiones específicas e inhiben la expresión hasta que se degradan naturalmente. Sin embargo, los MO que bloquean el empalme modifican el pre-ARNm induciendo la modificación del empalme, que puede analizarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y la electroforesis en gel.

Se deben estandarizar tres partes cruciales del proceso de selección de MO: (i) La curva de dosis de MO debe ajustarse para el reconocimiento fenotípico. La curva de dosis también muestra la dosis letal 50 (DL50: la dosis a la que muere el 50% de los embriones inyectados) para cada MO analizada para mejorar la capacidad de optimizar la "señal" fenotípica frente al "ruido" fuera del objetivo3. ii) La nomenclatura de fenotipado que se haya adaptado debe estar bien documentada; Una descripción fenotípica precisa y fácilmente comprensible es fundamental para proporcionar explicaciones extensas basadas en la literatura existente y la experiencia de los investigadores para facilitar el intercambio de información entre aquellos que no examinaron directamente los embriones. (iii) Tener un lenguaje bien definido facilita la recopilación de datos de forma centralizada de Morpholino Database8.

En los estudios de knockdown de MO para genes cardíacos, la actividad cardíaca y la dinámica del flujo sanguíneo de los animales deben ser monitoreadas para determinar el impacto de los experimentos de knockdown de MO en la función del sistema cardiovascular. Dichos análisis requieren la visualización en tiempo real del sistema cardiovascular a alta resolución. La piel del pez cebra es transparente durante la primera semana de desarrollo, lo que permite la visualización del corazón y la circulación sanguínea a través de la microscopía. Para la evaluación de la función cardíaca, los parámetros fisiológicos más calculados son la frecuencia cardíaca y el gasto cardíaco, así como el acortamiento fraccional, el cambio de área fraccional y la fracción de eyección. Las velocidades del flujo sanguíneo se pueden medir mediante el seguimiento de los glóbulos rojos en movimiento, y estas mediciones se utilizan para determinar los niveles de estrés de cizallamiento, un factor mecanobiológico crucial en las células endoteliales. Dicha evaluación requiere la grabación de películas de lapso de tiempo para los latidos del corazón y el flujo de sangre a través de un microscopio invertido o estereoscópico equipado con una cámara de alta velocidad.

Este artículo muestra cómo diseñar, preparar y microinyectar un morfolino que bloquea la traducción contra un gen de interés en la yema de embriones de pez cebra recién fertilizados para reducir la función del gen. También se mostrará el rescate de estos "morfantes" mediante la coinyección de ARNm que codifica este gen. A continuación, analizaremos la eficacia de las microinyecciones de morfolino a través de caracterizaciones fenotípicas, así como análisis estructurales y funcionales cardíacos. Este enfoque se demostrará en un gen cardíaco ampliamente estudiado, hand2.

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Protocolo

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Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares aceptados de cuidado humanitario de animales bajo la regulación de la IACUC en QU; los animales se mantuvieron en las instalaciones de pez cebra del Centro de Investigación Biomédica de la Universidad de Qatar (QU-BRC). Todos los animales utilizados en estos estudios experimentales estuvieron por debajo de los 3 días posteriores a la fertilización (dpf).

NOTA: Para cada grupo experimental, es aconsejable utilizar al menos 30 embriones para el rigor estadístico. Los grupos experimentales son los siguientes:

Grupo de control: Este grupo incluye embriones cultivados en agua de huevo sin ninguna inyección. Los resultados aquí formarán la línea de base de control.

Grupo de control negativo: En este grupo se incluyen los embriones cultivados en agua de huevo inyectada con MOs revueltos.

Grupo inyectado: En este grupo se incluyen los embriones inyectados con hand2 MO solo y hand2 MO con ARNm hand2 para rescatar el fenotipo. Los resultados confirmarán que los fenotipos observados aparecieron debido a los MOs inyectados. La comparación de los grupos experimentales permitirá evaluar la influencia de la inhibición y el rescate de la mano2 en la función cardíaca con precisión.

1. Diseños de Morpholino para la mano2.

NOTA: Las secuencias de MO pueden ser adaptadas de la literatura 9,10,11. Alternativamente, estos oligonucleótidos pueden ser diseñados en línea por Gene-tools. Gene-tools ofrece un servicio de diseño en línea gratuito y rápido, al que se puede acceder a través de su sitio web12. Un MO personalizado se puede diseñar fácilmente proporcionando información sobre los genes de interés, como información de secuencia o números de accesión. Los siguientes pasos específicos resumen cómo diseñar MO contra hand2 en el pez cebra:

  1. Primero, busque detalles del gen de interés en la base de datos del NCBI. Para la mano 2, en el pez cebra13.
  2. Obtenga el ID de transcripción de ARNm de GenBank de NCBI14.
  3. Obtenga la secuencia de ARNm del NCBI15.
    NOTA: Los oligonucleótidos antisentido modificados con morfolino (MO) para el gen hand2 del pez cebra están disponibles y se publicaron anteriormente. mano2 Secuencia MO 9,10,11: 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3', las secuencias MO utilizadas en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
  4. Obtenga un control negativo de un MO no coincidente o codificado (secuencias similares con cambios aleatorios de pares de bases) de las herramientas génicas16 que se inyectarán. Esto ayudaría a dar fe de la especificidad del fenotipo (s) observado en inyecciones específicas de MO y minimizaría el riesgo de que los efectos observados provengan de un artefacto del procedimiento de inyección.

2. Preparación de la inyección de morfolino

  1. Preparación de existencias
    1. Disolver las existencias de MO con ddH2O; El pirocarbonato de dietilo (DEPC) puede dañar los MO y ser tóxico para los embriones. Por lo tanto, utilice ddH2O sin DEPC. Al realizar el pedido, los MO se entregan en un vial a una concentración de 300 nM.
      NOTA: Si bien Gene Tools recomienda soluciones madre de 1 mM (~ 8 ng / nL), esto puede ser demasiado bajo, especialmente si el morfolino requiere una dosis alta o se mezcla con otros MO. Por lo tanto, es ideal para hacer varias concentraciones de soluciones madre de MO (2 o 3 mM).
    2. Prepare una solución de trabajo de 0,2 mM subdiluyendo la solución de trabajo (es decir, para caldo de 2 mM, dilución 1:10). Prepare 10 μL de solución de trabajo añadiendo solución de Danieaux (7 μL), morfolino de stock (1 μL) y rojo de fenol (2 μL de 10 veces de stock). El rojo fenol le da a la solución un color rojo oscuro para ayudar a rastrear el material inyectado en el embrión.
    3. Mantenga los MO a temperatura ambiente (RT) en recipientes herméticos para evitar la evaporación. No mantenga los MO en hielo en la mesa de trabajo, ya que la solución puede precipitarse. El manejo de RT es el más apropiado.
      NOTA: Gene Tools recomienda uno de los dos métodos de almacenamiento para los MO: La solución de trabajo se puede mantener a -20 °C (durante muchos meses o años) o RT en un tubo sellado para el almacenamiento a largo plazo. Si se mantiene a -20 °C, caliente la solución de oligonucleótidos a 65 °C durante 10 min y vórtice para disolver completamente el morfolino antes de usar (no es necesario calentarlo si se mantiene en RT).
  2. Transcripción in vitro de ARNm
    NOTA: La transcripción in vitro se utilizó para generar el ARNm de Hand2 a partir del clon de ORF marcado con humanos HAND2 (NM_021973) para ser microinyectado en embriones de pez cebra para rescatar el fenotipo debido al derribo de pez cebra hand2 usando morfolinos, los detalles del plásmido utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
    1. Linealizar el ADN plasmídico mediante una enzima de restricción apropiada y purificarlo utilizando un kit de purificación de ADN (Tabla de materiales). Utilice el ADN linealizado purificado como plantilla para la transcripción in vitro para generar ARNm para inyección según las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).
    2. Por último, inyectar 250 pg de ARNm humano para que el gen de interés realice el rescate del fenotipo para comprobar si la falta de un fenotipo se debe efectivamente a la pérdida del gen del pez cebra por MO.
  3. Preparación para inyectarse
    1. Tire de una aguja con un extractor de micropipetas (Tabla de Materiales), siguiendo los pasos 2.3.2-2.3.6.
    2. Utilice tubos capilares de 1 mm con filamentos y un extractor de micropipetas. Encienda la máquina y abra la tapa
    3. Gire la perilla de selección de modo a NO.2 Heater. Con el calentador NO.2 , ajuste la perilla para llevar el calor a 68 °C
    4. Gire la perilla de selección de modo a la posición del Paso 1 . Utilice cuatro pesos (2 Tipo Ligero / 2 Tipo Pesado)
    5. Coloque el capilar en el soporte y cierre la tapa. Presione el botón de inicio para obtener la aguja extraída.
      NOTA: Esto generará agujas capilares con un cono largo
    6. Corta la punta de las agujas brevemente, usando pinzas. Afile la punta de la aguja estirada para facilitar la penetración en los embriones de pez cebra utilizando un biselador capilar durante unos 30 s, lo que da como resultado puntas con diámetros de aproximadamente 15-25 μm.
    7. Calibre la aguja para estimar la cantidad de inyección siguiendo los pasos 2.3.8-2.3.13.
    8. Mezcle brevemente la solución de ARNm/morfolino antes de cargarla en la aguja para disolver las partículas que podrían obstruir la aguja por completo.
    9. Agregue ~ 3-4 μL de solución de MO a la parte posterior de la aguja de inyección con una punta de pipeta con punta de micra. Las agujas de inyección están equipadas con una pequeña zanja para facilitar el relleno capilar.
    10. Confirme que no haya burbujas en la aguja de inyección. Monte la aguja en el microinyector.
    11. Compruebe que la punta de la aguja no esté obstruida y que la solución de MO pueda salir de la aguja presionando el pedal de inyección.
    12. Calibrar el volumen de inyección midiendo el tamaño de las gotas. Coloque la punta de la aguja en aceite mineral en un portaobjetos de micrómetro. Presione el pedal de inyección y ajuste la presión de inyección (expulsión) (psi) y/o el tiempo de inyección (ms) hasta que el diámetro de la gota expulsada sea de 0,1 mm, lo que corresponde a 0,5 nL.
    13. Asegúrese de que el volumen de inyección esté en torno a 0,5-1 nL. Ajuste el volumen cambiando la inyección (expulsión), la presión (psi) o el tiempo (ms).
    14. Para el protocolo de configuración del inyector de picolitros, siga los pasos 2.3.15-2.3.16
    15. Use un inyector de picolitros para inyecciones de pez cebra. Encienda la bomba de alimentación del inyector.
    16. Prepare el inyector de acuerdo con los requisitos que se muestran a continuación:
      1. Balance P: Asegúrese de que el equilibrio P esté alrededor de 0. Asegúrese de que sea ligeramente negativo para evitar que la yema regrese a la aguja, diluyendo la solución de MO en la aguja. Por el contrario, si la contrapresión es demasiado alta, el MO fluirá constantemente fuera de la aguja incluso sin ejercer presión sobre el pedal, lo que resulta en variabilidad e inconsistencias en la dosis inyectada y los fenotipos observados.
      2. P-inyectar: 20-25 psi es ideal; Cambie esto para ajustar el volumen de inyección. Esto puede oscilar entre 10 y 30 psi, pero comience con ~ 20 psi para verificar si ofrece el volumen deseado.
      3. Tiempo de inyección: Asegúrese de reducir el tiempo de inyección a 300 ms. Antes de ajustar el volumen de inyección, realice ajustes en el tiempo de inyección.
    17. Para la inyección de morfolino, siga los pasos 2.3.18-2.3.19.
    18. Prepare la cámara de inyección de la siguiente manera: Prepare agarosa al 2% a partir de 0,6 g de agarosa y 30 ml de medio E3. Vierta la agarosa en una placa de Petri y coloque un molde de inyección sobre la agarosa usando un molde de inyección TU-1. Una vez enfriados en un congelador, se formarán surcos para colocar y estabilizar los embriones (Figura 1A).
      NOTA: La receta de solución madre E3M 60x consta de 5,0 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,16 mM de MgSO4,7H 2O, 0,4 mM de CaCl 2,2H2O en 1 L ddH2O con un pH final de 7,6.
    19. Transfiera los embriones recolectados a los surcos con una pipeta de transferencia, elimine todo el exceso de medio E3 alrededor de los embriones para evitar la flotación de los embriones (Figura 1B).

3. Inyección de solución de MO y ARNm en la yema

  1. Inserte la aguja a través del corion, inyecte cerca del límite de la célula/yema hasta el lado del embrión y presione el pedal de inyección (Figura 1C).
    NOTA: La solución inyectada de MO / rojo de fenol no se difundirá inmediatamente dentro de la yema. Se observará una mancha roja en la yema que se disipa gradualmente. El material inyectado no debe superar más del 10% del tamaño del embrión. Los MO pueden ser microinyectados en la yema de huevos de pez cebra recién puestos hasta en la etapa de 8 células porque los MOs pueden ser fácilmente absorbidos en la corriente citoplasmática del saco vitelino por las células en desarrollo17,18. En las inyecciones de plásmidos o ARNm tapado, la inyección debe realizarse en un solo blastómero de un embrión en etapa de una célula.
  2. Transfiera los embriones a una placa de Petri con medio E3 e incube a 28 °C hasta 3 dpf, con reposición diaria del medio E3. En esa etapa, realice la evaluación fenotípica con un microscopio.
    NOTA: Las soluciones de MO deben diluirse cuidadosamente para cada investigación para establecer la concentración más baja necesaria para inducir un fenotipo específico. También se debe determinar la letalidad embrionaria para cada MO. A concentraciones más altas (por encima de 4-10 ng, dependiendo del MO), los MO tienden a provocar efectos inespecíficos, como la muerte cerebral o celular general.
  3. Co-inyectar MO con 250 pg de ARNm de la mano humana2 de la misma manera para confirmar el rescate del fenotipo inducido por la pérdida del gen de la mano2 del pez cebra por MO.

4. Western blot para verificar el éxito de la eliminación de morfolinos

  1. Recoja los embriones en puntos de tiempo específicos (48 hpf, 72 hpf) y descorione si es necesario usando la enzima Pronasa.
  2. Desyema de los embriones para eliminar la vitelogenina utilizando una metodología previamente conocida19.
    NOTA: La vitelogenina es una fosfolipoglicoproteína que sirve como fuente de nutrientes para el embrión en crecimiento. La electroforesis en gel 2D de alta resolución y la inmunotransferencia Western blot muy mejorada son posibles gracias a la deyolización de los embriones y la eliminación de la vitelogenina.
  3. Realice el Western blot como se describió anteriormente20.

5. Evaluación de la estructura y función cardíaca:

  1. Imágenes en vivo del pez cebra: Imágenes del ventrículo
    NOTA: Se pueden calcular varios parámetros de la función cardíaca/hemodinámica visualizando el corazón latiendo del embrión de pez cebra21,22. Estos parámetros incluyen el gasto cardíaco (CO), la fracción de eyección (FE), el volumen sistólico (SV), el acortamiento fraccional (FS) y el cambio de área fraccional (FAC) (consulte los documentos anteriores que involucran protocolos detallados para la evaluación de la función cardíaca para embriones de pez cebra22,23). Los siguientes pasos explican brevemente cómo calcular esos parámetros para embriones de pez cebra a ~3 dpf, una etapa en la que la piel de estos organismos es transparente, lo que permite la visualización con microscopía de campo claro.
    1. Coloque una gota de solución de metilcelulosa (RT) al 3% en el portaobjetos cóncavo de obtención de imágenes.
    2. Coloque el embrión de pez cebra en el pozo utilizando un gotero de plástico adecuado (Figura 2A, B)
      NOTA: El llenado excesivo del pozo puede causar el desplazamiento de los peces fuera del pozo.
    3. Mezcle suavemente la gota de metilcelulosa al 3% con el medio E3 para estabilizar el embrión eclosionado.
      NOTA: Para preparar una solución de metilcelulosa al 3%, disuelva 3 g de polvo de metilcelulosa en 100 ml de PBS, u otro medio de montaje, en un matraz. Coloque un imán de agitación en el matraz de la mezcla y coloque el matraz en una placa de agitación magnética. Ajuste la velocidad a "baja" y manténgala a 4 °C durante ~ 1 día para disolver todos los grumos. Una vez que la metilcelulosa esté completamente disuelta, alícuota en pequeños tubos y almacenar a -20 °C.
    4. Coloque el pez a su izquierda, con el lado derecho hacia arriba y el punto anterior hacia la izquierda para facilitar la obtención de imágenes inequívocas del ventrículo (Figura 2C).
    5. Bajo el microscopio, amplíe el corazón del embrión con un aumento de 100x y comience a grabar durante ~5 s. Asegúrese de que los bordes de los ventrículos estén dentro de la ventana de imagen (Figura 2D).
    6. Grabe vídeos time-lapse con una cámara de alta velocidad y un microscopio estereoscópico a unos 100 fotogramas por segundo (fps) de todo el embrión (Figura 2C), golpeando el ventrículo (Figura 2D) y moviendo los glóbulos rojos (RBC) en los vasos principales, como la aorta dorsal o la vena cardinal posterior (Figura 2E), para el análisis de la función cardíaca.
    7. Guarde la película en formato de película AVI o en formato de secuencias de imágenes TIFF (o JPEG).
  2. Calcular la frecuencia cardíaca
    1. Calcula el tiempo necesario para grabar dos fotogramas consecutivos. Para 100 fps, el intervalo de tiempo es igual a 0,01 s.
    2. Elija un punto conocido de cualquier ciclo cardíaco registrado (es decir, al final de la diástole o al final de la sístole). Calcule el número de fotogramas necesarios para repetir el ciclo.
    3. Multiplique el intervalo de tiempo del paso 5.2.1 por el número de fotogramas del paso 5.2.2. El resultado es la duración del tiempo (en segundos) de un latido.
    4. Para calcular las pulsaciones por minuto, divida 60 por el número obtenido en el paso anterior. Para embriones normales de 3 dpf, esto debe ser alrededor de 150 lpm (2,5 Hz).
      NOTA: Muchas aplicaciones de software pueden calcular la frecuencia cardíaca automáticamente a partir de registros cardíacos latidos, como ViewPoint24 y DanioVision25.
    5. Analice la estructura cardíaca utilizando una película de lapso de tiempo a aproximadamente 100 fps para revisar todo el corazón y detectar la presencia de edema cardíaco o cualquier otro defecto estructural.
      NOTA: La Figura 3A muestra un corazón embrionario normal de 3 dpf, y la Figura 3B muestra un corazón de 3 dpf con edema cardíaco y defecto del bucle cardíaco (ventrículo alargado).
  3. Calcule el cambio de área fraccionaria (FAC):
    NOTA: El cambio de área fraccional (FAC) es un parámetro utilizado para comparar las áreas ventriculares de fin de diástole y de última sístole para evaluar la contractilidad del ventrículo.
    1. Utilice una película time-lapse de grabación a unos 100 fps para determinar los fotogramas que representan un ciclo cardíaco. Extraiga los fotogramas que muestran el final de la sístole final y la diástole final.
    2. Calcule el área de fin de diástole (EDA) y el área de fin de sístole (ESA) utilizando ImageJ o un software de análisis de imágenes similar.
    3. Utilice la siguiente fórmula para calcular FAC 22,26,27:
      FAC figure-protocol-1
  4. Calcular el acortamiento fraccional (FS):
    NOTA: El acortamiento fraccional (FS) es otro parámetro utilizado para evaluar la contractilidad del ventrículo; para determinar el FS, se deben medir los diámetros telediastólico y telesistólico de los ventrículos21.
    1. Repita el paso 5.3.1
    2. Utilice ImageJ o cualquier otro programa de análisis de imágenes equivalente para medir los diámetros de las paredes ventriculares en los puntos Dd de la diástole final y Ds de la sístole final. En la mayoría de los casos, se emplean diámetros de eje corto para determinar la suavidad fraccional (FS) (Figura 4).
    3. Utilice la siguiente fórmula para calcular FS 22,27:
      FS figure-protocol-2
  5. Cálculo del volumen sistólico (SV):
    NOTA: Para cada latido del corazón, el SV es la cantidad de sangre bombeada desde el ventrículo, que se calcula fácilmente a partir de los volúmenes de fin de diástole y final de sístole de los ventrículos28.
    1. Repita los pasos 5.3.1 y 5.3.2
    2. Mida los diámetros de la diástole final (DL) y de la sístole final (DS) como se muestra en la Figura 4.
      NOTA: Suponiendo que los ventrículos de los corazones de los peces cebra tienen la forma de un prolato esferoidal21,22, el volumen del ventrículo se calcula utilizando la siguiente fórmula.
      Volumen figure-protocol-3
      El SV se puede calcular siguiendo la siguiente fórmula27. El rango normal de SV es de 0,15-0,3 nL para embriones de 2-6 dpf29. Aquí, EDV es el volumen de diástole final y ESV es el volumen de sístole final.
      SV = (EDV - ESV)
  6. Calcular la fracción de eyección (FE):
    NOTA: La FE se define como la fracción de sangre expulsada del ventrículo con cada latidodel corazón 28.
    1. De las fórmulas anteriores, extraiga EDV y ESV para los peces.
    2. Calcule EF de la siguiente manera22,27:
      EF (%) figure-protocol-4
  7. Calcular el gasto cardíaco (CO):
    NOTA: El CO es el volumen de sangre que bombea el corazón28. El CO tiene un valor de 10-55 nL/min para embriones de 2-6 dpf29.
    1. Calcule el SV y la HR como se menciona en las subsecciones 5.5 y 5.2 anteriores.
    2. Utilice la siguiente fórmula para calcular el CO 22,27:
      CO (nL/min) = SV (nL/latido) x FC (latidos/min).
  8. Mida las velocidades de los glóbulos rojos:
    NOTA: La determinación de la velocidad de las células es vital para evaluar el caudal, el diámetro del vaso y calcular la tensión de cizallamiento ejercida sobre las células endoteliales del vaso (es decir, la tensión de cizallamiento, por otro lado, es la fuerza de fricción impuesta a las células endoteliales por la sangre en movimiento). Para embriones de 2-5 dpf, la velocidad media de los glóbulos rojos (RBC) es de unos 300-750 μm/s29. Para medir las velocidades de los glóbulos rojos:
    1. Bajo el microscopio, amplíe la cola del animal con un aumento de 100x. El movimiento de los glóbulos rojos debe ser visible con este aumento (Figura 5A, B).
    2. Comience a grabar durante unos 8 s. Asegúrese de que la aorta dorsal (DA) y la vena cardinal posterior (PCV), las dos arterias axiales más importantes, estén entre 100 y 120 fps dentro de la ventana de imagen. Realice un seguimiento de celdas individuales a partir de fotogramas secuenciales (Figura 5A, B).
    3. Extraiga varios fotogramas con ImageJ u otro software de análisis de imágenes similar.
    4. Calcule la diferencia en la distancia a la que se mueve un RBC individual (Δx).
    5. Determine la diferencia de tiempo entre los fotogramas consecutivos (Δt).
    6. Utilice la siguiente fórmula para la velocidad de los glóbulos rojos22,27:
      Velocidad de los glóbulos rojos (μm/s) figure-protocol-5
      NOTA: La velocidad máxima y media se puede extraer de la repetición de fotogramas consecutivos para celdas individuales21. La velocidad de los glóbulos rojos también representa la velocidad del flujo sanguíneo. Alternativamente, se puede utilizar una variedad de aplicaciones de software disponibles en el mercado para medir automáticamente la velocidad de los glóbulos rojos. ViewPoint24, así como DanioVision25, tienen tales aplicaciones (Figura 5C). Además, hay pocos plugins disponibles con ImageJ, como TrackMate30 y MTrackJ31, compatibles con películas grabadas por encima de 100 fps.
  9. Cálculo del esfuerzo cortante a partir de las velocidades de celda medidas
    Las velocidades medidas de los glóbulos rojos en los vasos sanguíneos también representan las velocidades del flujo sanguíneo (Figura 5C). A partir de estas mediciones, calcule el esfuerzo cortante τ en un recipiente de interés de la siguiente manera con la suposición de flujo de Poiseuille22,27:
    figure-protocol-6
    Donde V es la velocidad media de la sangre (μm/s), μ es la viscosidad de la sangre (dinas/cm2) y D es el diámetro de los vasos (μm). Para embriones de 3 dpf, el esfuerzo cortante en DA 22,26,27 es de aproximadamente 4 dinas/cm2.

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Resultados

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El gráfico de la Figura 6 ilustra el porcentaje promedio de embriones que sobreviven a 24, 48 y 72 hpf tanto para los embriones de MO específicos de HAND2 como para los embriones inyectados con MO codificados de control. Los embriones inyectados por MO de 1 mM (8 ng/μL) y 0,8 mM (6,4 ng/μL) mostraron una reducción significativa en el porcentaje de supervivencia en comparación con los embriones inyectados por MO codificados de control. Esto se observó en cada punto de tiempo medido donde se o...

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Discusión

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La tecnología Morpholino (MO) se ha utilizado ampliamente en peces cebra, xenopus, erizos de mar y, más recientemente, en sistemas modelo de cultivo celular. Con la mayoría de los métodos, junto con los beneficios, también hay trampas de las que el experimentador debe ser consciente. Uno de los principales escollos con la tecnología MO incluye la preocupación de que los efectos fenotípicos observados por el enfoque de eliminación de genes mediados por MO no se deben a la pérdida de funci...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener intereses financieros ni otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

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La publicación de este artículo ha contado con el generoso apoyo de BARZAN HOLDINGS. RR es financiado en parte por R61HL154254 y fondos del Departamento de Pediatría y el Hospital de Niños.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acrilamida 40%SigmaSigma, n.º de cat. C977M88
AgarosaSigma-AldrichSigma-Aldrich n.º de cat. A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagenQiagen n.º de cat. 80204.
alfa TubulinaAbcam Abcam- ab4074Conejo policlonal a alfa Tubulina lote GR3 180877-1 (50 kDa)
Persulfato de amonio grado molecularSigmaSigma, n.º de cat. C991U65
Biseladora capilar BV10Producto de Sutter InstrumentsCatálogo de productos # BV10
Imágenes de quimioluminiscencia Gnomogénico SYNGENE SYNGENE
Cleaver Scientific BlottingCVS10D_OmniPAGEMiniCVS10D_OmniPAGEMini
CoomassieThermo FisherThermo Fisher n.º de C861C44
kit de electroquimioluminiscencia (ECL)Abcam Biochemicals AbcamBiochemicals cat. no ab65623
GlycineSigmaSigma, cat. no C988U91
Cabra anti ConejoAbcamAbcam-  ab6721Cabra Anti-Conejo IgG H& L (HRP) 2nd lote de anticuerpos GR3179871-1
HAND2Herramientas génicasHecho a medida para HAND2 (NM_021973)5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC
AG-3'Hand2
Abcam Abcam- ab10131Lote de anticuerpos anti-HAND2 policlonales de conejo GR143200-9 (24- 26 kDa)
HAND2 (NM_021973) Humano Etiquetado ORF ClonOriGene Technologies, IncRC224436L3Vector: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
Kit de extracción de ADN/ARN/proteínas IBIScientific IBI Scientificcat. no -r Sistema de imagen IB47702
imageniBright CL1000
IsopropanolSigma-AldrichSigma-Aldrich cat. n.º 278475-2L
Tampón de carga de muestras Laemmli (4x)Sigma-AldrichSigma-Aldrich n.º de cat. 70607
MercaptoetanolSigma Sigma, n.º de cat. M6250-1L
Espectrofotómetro de microplacas con la interfaz de software de análisis de datos Gen5Microscopio EpochEpoch
Ziess SteREO Lumar V12 Microscopiofluorescencia Ziess SteREO Lumar V12 Microscopio
Aceite mineralFisher ScientificFisher Scientific n.º de cat. 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Kit de transcripciónThermo FisherThermo Fisher n.º de cat. AM1340para la generación de ARNm
Agua sin nucleasasNew England BiolabsNew England Biolabs n.º de cat. B1500L
PC-100 Extractor de micropipetasNARISHIGE GROUP Producto NARISHIGE GROUPCatálogo de productos # PC-100
Rojo de fenolSigmaSigma, n.º de cat. P-0290
Inyector de picolitroAparato Harvard Catálogoaparatos Harvard # PLI-90A
Pierce Ensayo de ácido bicinconínico (BCA) Kit de ensayo de proteínasThermo FisherThermo Fisher n.º de cat. 23227
PMSF, Inhibidor de la proteasa como inhibidores de la proteasaThermo FisherThermo Fisher n.º de cat. 36978
Ponceau SSigma-AldrichSigma-Aldrich cat. no 10165921001
Cóctel de inhibidores de la proteasaThermo FisherThermo Fisher n.º de cat. 88668
Escalera de proteínasSMOBiOSMOBiO cat. n.º PM2500
Ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)Thermo FisherThermo Fisher n.º cat. 89900
Ringer' s soluciónThermofisherCatálogo No.S25513
SDSSigmaSigma, n.º de cat. 436143
Herramientas genéticasde control estándarSKU: PCO-StandardControl-1005'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT
A-3'- que se dirige a una mutación de intrones de beta-globina humana
Tampón de extracciónSigma-AldrichSigma-Aldrich cat. 21059
TemedIBI científicoIBI cat. n.º C000A52
Tris BaseThermo FisherThermo Fisher cat. no BP-152-500
Tweensigma ciencias de la vida sigmala vida cat. no P2287
Zebra Box Revolution-Danio Cámara del sistema Track con el software EthoVision XT 11.5 Tecnología de lainformación Noldus, NLinformación Noldus, NL
Zeiss Axiocam ERc 5sZeissStemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-CZeissStemi 2000-C
iBright Sistema de de de fluorescencia de ciencias de Tecnología de la

Referencias

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