Diseño y microinyección de oligonucleótidos y ARNm antisentido morfolino en embriones de pez cebra para dilucidar la función específica de genes en el desarrollo cardíaco

Zain  Zaki Zakaria; Shahram Eisa-Beygi; Fatiha M. Benslimane; Ramani Ramchandran; Huseyin C. Yalcin

doi:10.3791/63324

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Artículo de método

Diseño y microinyección de oligonucleótidos y ARNm antisentido morfolino en embriones de pez cebra para dilucidar la función específica de genes en el desarrollo cardíaco

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DOI:

10.3791/63324

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9 de agosto de 2022

Zain Zaki Zakaria¹^,² , Shahram Eisa-Beygi³ , Fatiha M. Benslimane¹ , Ramani Ramchandran⁴ , Huseyin C. Yalcin¹

¹Biomedical Research Center, Qatar University, Doha, Qatar, ²Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Science, Qatar University, Doha, Qatar, ³Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin, ⁴Department of Pediatrics, Medical College of Wisconsin

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe el diseño, la preparación y la microinyección de un morfolino de bloqueo traslacional contra un gen cardíaco representativo; Derivados del corazón y la cresta neural expresados2 (mano2) en la yema de embriones de pez cebra recién fertilizados para reducir la función génica. También muestra un rescate transitorio de estos "morfantes" mediante la coinyección de ARNm que codifica este producto génico.

Resumen

El sistema de knockdown basado en oligómeros de morfolinos se ha utilizado para identificar la función de varios productos génicos a través de la pérdida o la reducción de la expresión. Los morfolinos (MO) tienen la ventaja en estabilidad biológica sobre los oligonucleótidos de ADN porque no son susceptibles a la degradación enzimática. Para una eficacia óptima, los MO se inyectan en embriones de 1 a 4 células. La eficacia temporal del knockdown es variable, pero se cree que los MO pierden sus efectos debido a la dilución eventualmente. La dilución de morfolino y la cantidad de inyección deben controlarse estrechamente para minimizar la aparición de efectos fuera del objetivo mientras se mantiene la eficacia en el objetivo. Se deben realizar herramientas complementarias adicionales, como CRISPR/Cas9, contra el gen diana de interés para generar líneas mutantes y confirmar el fenotipo del morfante con estas líneas. Este artículo demostrará cómo diseñar, preparar y microinyectar un morfolino que bloquea la traducción contra hand2 en la yema de embriones de pez cebra en etapa celular 1-4 para derribar la función hand2 y rescatar estos "morfantes" mediante la coinyección de ARNm que codifica el ADNc correspondiente. Posteriormente, se evalúa la eficacia de las microinyecciones de morfolino verificando primero la presencia de morfolino en la yema (coinyectado con rojo de fenol) y luego mediante análisis fenotípico. Además, se discutirá el análisis funcional cardíaco para probar la eficacia del knockdown. Por último, se explicará la evaluación del efecto del bloqueo de la traducción génica inducido por morfolinos a través de Western blot.

Introducción

La utilización del pez cebra como modelo para el estudio del desarrollo y la enfermedad cardiovascular ofrece una variedad de ventajas, incluida la alta conservación de la función génica, la transparencia óptica, el rápido desarrollo cardiovascular y el costo más barato en comparación con^{los modelos in} vivo tradicionales. Los oligonucleótidos morfolinos (MO) son las herramientas de eliminación de genes antisentido más utilizadas para el modelo de pez cebra. Los MO se utilizan con frecuencia para determinar un fenotipo o para sondear la función de los genes. El Dr. James Summerton desarrolló inicialment....