Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

Resumen

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

Resumen

La estructura ramificada de la glándula mamaria es altamente dinámica y sufre varias fases de crecimiento y remodelación después del nacimiento. La microscopía intravital en combinación con cirugía de colgajo cutáneo o implantación de ventanas de imagen se ha utilizado para estudiar la dinámica de la glándula mamaria sana en diferentes etapas del desarrollo. La mayoría de las tecnologías de imágenes mamarias se limitan a un marco de tiempo de horas a días, mientras que la mayoría de los procesos de remodelación de la glándula mamaria ocurren en marcos de tiempo de días a semanas. Para estudiar la remodelación de la glándula mamaria, se requieren métodos que permitan el acceso óptico al tejido de interés durante períodos de tiempo prolongados. Aquí, se describe una versión mejorada de la ventana de imágenes mamarias de titanio con una tapa reemplazable (R.MIW) que permite imágenes de alta resolución de la glándula mamaria con una resolución celular de hasta varias semanas. Es importante destacar que el R.MIW proporciona acceso al tejido durante toda la duración del experimento de imágenes intravitales y, por lo tanto, podría usarse para la manipulación local de tejidos, el etiquetado, la administración de medicamentos o la microdisección guiada por imágenes. En conjunto, el R.MIW permite la caracterización de alta resolución de la dinámica celular durante el desarrollo de la glándula mamaria, la homeostasis y la enfermedad.

Introducción

El epitelio mamario es un órgano secretor único presente en los mamíferos, que produce y secreta leche para nutrir a la descendencia. A lo largo de la vida, la glándula mamaria experimenta múltiples rondas de desarrollo y crecimiento, que se acompañan de cambios estructurales y funcionales del tejido¹. Dependiendo de la etapa de desarrollo, los tipos de células que contribuyen a la remodelación del tejido son diferentes, así como la ubicación dentro del árbol ductal.

La microscopía intravital multifotónica (MIV) permite el estudio de la dinámica de las células mamarias in vivo en el entorno nativo y mínimamente perturbado ^2,3,4. Para obtener acceso visual a la glándula mamaria, se han publicado varias técnicas temporales de imagen de colgajo ex vivo o de colgajo cutáneo durante diferentes etapas del desarrollo de la glándula mamaria, incluyendo la pubertad 4,5,6,7, la edad adulta ^2,8, la lactancia ^9,10,11,12 y la dinámica tumoral ^{13,14 ,15}. Aunque estas técnicas dan como resultado imágenes de alta resolución espacial y temporal de la dinámica de las células mamarias, el marco de tiempo se limita a horas, mientras que la mayoría de los procesos de remodelación de la glándula mamaria toman días o semanas. Por lo tanto, se requieren métodos que permitan el acceso óptico al tejido de interés durante períodos de tiempo prolongados. A lo largo de los años, se han desarrollado varias ventanas de imágenes permanentes para imágenes de tumores mamarios ^15,16,17,18, incluida una ventana de imágenes mamarias de titanio (MIW)^2,3,19. Aunque es muy útil para estudiar el crecimiento del tumor mamario, la visualización de la estructura sana de la glándula mamaria se mantuvo limitada a unos pocos días. Recientemente, se desarrolló una ventana de imágenes de silicio flexible, que permite la visualización de la glándula mamaria puberal durante varias semanas²⁰. Sin embargo, la glándula mamaria está incrustada en una almohadilla de grasa rica en adipocitos, lo que conduce a una extensa dispersión de la luz y, como resultado, una visibilidad limitada de las estructuras ductales mamarias. Por lo tanto, se requieren condiciones de imagen superiores en todo momento para visualizar la dinámica del tejido durante períodos prolongados de tiempo en la glándula mamaria. Ni el MIW clásico ni la ventana de silicio flexible permiten la manipulación del tejido o la optimización de la ubicación física del tejido antes de la obtención de imágenes, ya que la ventana forma un sistema cerrado después de la cirugía y la implantación. Como resultado, es probable que el acceso óptico óptimo al tejido mamario subyacente se vea impedido durante períodos de tiempo más largos. Por el contrario, la técnica del colgajo cutáneo permite la optimización y el reposicionamiento del tejido durante la sesión de imágenes y un colgajo cutáneo se puede repetir varias veces². Sin embargo, las sesiones repetidas de imágenes a través de un colgajo de piel solo son posibles cuando se asigna suficiente tiempo (al menos 7 días) entre cirugías para permitir la recuperación de la piel y, por lo tanto, es principalmente adecuado para estudiar procesos en escalas de tiempo más largas. Además, es aconsejable no realizar este procedimiento muchas veces debido a su naturaleza invasiva y gran riesgo de infecciones y cicatrices al cierre de la herida.

Para superar estas limitaciones, es decir, para garantizar condiciones óptimas de imagen durante un período prolongado de tiempo a una alta frecuencia y al mismo tiempo permitir la manipulación de tejidos, se diseñó una versión mejorada de titanio del MIW con una tapa reemplazable (R.MIW) para visualizar la glándula mamaria sana y enferma durante varios días a semanas² (Figura 1A, B). El R.MIW fue diseñado a medida para proporcionar un acceso óptimo al tejido, lo que permite la manipulación directa del tejido durante toda la duración del experimento IVM y, por lo tanto, permite la visualización de la glándula mamaria en el momento y lugar adecuados durante períodos prolongados de tiempo. Cuando está cerrado, el R.MIW forma un sistema hermético comparable al MIW clásico (Figura 1C). Cuando se abre en condiciones asépticas, el R.MIW permite la manipulación local de tejidos para mejorar el acceso óptico y también permite la administración local de sustancias, como inhibidores de la vía o agonistas, la inyección de diferentes tipos de células de interés, como células cancerosas o poblaciones de células inmunes, o la adición de colorantes de marcado de tejidos. La tapa se puede abrir en cualquier momento entre las sesiones de imágenes sin causar daño al tejido subyacente.

Figura 1: Diseño de la ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable. (A) Vista superior y vista lateral de la tapa reemplazable de la ventana de imágenes mamarias con una cubierta de vidrio de 10 mm pegada al anillo. (B) Vista superior y vista lateral de la ventana de imágenes mamarias, que consiste en un anillo exterior y un anillo interior con una ranura en el medio para asegurar la ventana dentro de la piel del ratón utilizando una sutura de cuerda de bolso. El anillo exterior tiene una pequeña ranura que se ajusta a las cuatro proyecciones (brazos) de la tapa. (C) Dibujos animados e imágenes que demuestren los mecanismos de apertura y cierre de la tapa. Las proyecciones inclinadas aseguran que la tapa esté fija dentro del marco de la ventana. Esta figura ha sido modificada de Messal et al. ². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo describe el procedimiento de diseño e implantación del R.MIW, así como una estrategia longitudinal de IVM para revisitar los mismos conductos mamarios y su visualización a resolución celular. El R.MIW permite seguir las divisiones celulares y los cambios morfológicos durante diferentes fases de desarrollo de la glándula mamaria en diversos modelos de ratón reportero fluorescente. En conjunto, el R.MIW facilita la caracterización de alta resolución de la dinámica celular durante el desarrollo de la glándula mamaria, la homeostasis y la enfermedad.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este documento se realizaron de acuerdo con las directrices de la IACUC y KU Leuven y se llevaron a cabo en el contexto de la solicitud de proyecto aprobada P160/2020. Antes de ejecutar este protocolo, revise la estrategia de analgesia con el veterinario institucional y administre analgesia pre y postoperatoria según las pautas institucionales.

1. Preparación del R.MIW (tiempo estimado: 2 h)

NOTA: Para la construcción del R.MIW, es recomendable encontrar un fabricante local que se especialice en trabajar con materiales duros como el titanio, ya que esto requiere herramientas y experiencia especiales. Los talleres especializados en el diseño y fabricación de prótesis de titanio suelen tener la maquinaria y la experiencia para producir las piezas R.MIW.

1. Coloque la tapa del R.MIW sobre una superficie estéril con el exterior de la tapa hacia arriba (y los brazos de la tapa inclinados hacia abajo; Figura 1A).
2. Aplique pegamento adhesivo de cianoacrilato alrededor de todo el borde de la tapa y coloque cuidadosamente una cubierta de vidrio redonda de 10 mm en la parte superior de la tapa.
   NOTA: Siempre prepare una tapa de repuesto con una cubierta de vidrio como respaldo durante el procedimiento quirúrgico.
3. Use un palo de madera estéril para colocar la cubierta de vidrio y aplique algo de fuerza para empujarla hacia abajo para garantizar un sello hermético entre la cubierta de vidrio y el marco de la tapa. Asegúrese de que los orificios en los brazos de la tapa no estén cubiertos por el vidrio.
4. Desinfecte las tapas y el R.MIW sumergiéndolo en etanol al 80% durante al menos 30 min en una placa de Petri cerrada.
   NOTA: No deje las tapas por más de 1 h en etanol al 80% para evitar la disolución del pegamento adhesivo de cianoacrilato.
5. Retire el exceso de pegamento adhesivo de cianoacrilato de la cubierta de vidrio usando una punta de algodón empapada en acetona.
6. Guarde las tapas y el R.MIW en un ambiente estéril hasta su uso posterior.
   NOTA: El marco y las tapas R.MIW se pueden mantener en un tubo o bolsa estéril durante un máximo de 1 semana. Al reanudar el experimento, siempre examine si la cubierta de vidrio todavía está correctamente unida a la tapa antes de continuar con el protocolo.

2. Preparación para la cirugía (tiempo estimado: 15 min)

NOTA: Para el procedimiento de implantación de R.MIW, se pueden utilizar ratones hembra (>3,5 semanas de edad) de cualquier cepa.

1. Mantenga la esterilidad mediante el uso de guantes estériles y esterilice todos los artículos que entren en contacto con el ratón. Lave las herramientas quirúrgicas con agua y jabón suave, seque al aire, envuelva en papel de aluminio sin esquinas ni bordes expuestos y esterilice con un autoclave durante un ciclo de 20 minutos a 120 ° C antes de la cirugía.
2. Preparar una plataforma quirúrgica estéril y esterilizar las superficies con etanol al 80%.
   NOTA: Para garantizar la esterilidad, la cirugía se puede realizar en un gabinete de flujo.
3. Encienda la almohadilla térmica y cubra la alfombra con una cortina estéril. Coloque los instrumentos estériles en la cortina estéril y coloque el R.MIW y un mínimo de dos tapas cubiertas de vidrio en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri (cierre la tapa para evitar la contaminación externa).
4. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando una mezcla de isoflurano/O_{2 al} 3%. Asegúrese de que el animal esté lo suficientemente relajado como para ser fácilmente manipulado y transferido a la máscara nasal sin ninguna lucha.
5. Transfiera el ratón de la cámara de inducción a una máscara nasal de anestesia y reduzca el nivel de isoflurano a 1.5% - 2% de mezcla de isoflurano / O₂ . Verifique la anestesia completa realizando una prueba de extracción de la pata.
6. Para realizar la prueba de extracción de la pata, pellizque firmemente la pata del animal con uñas o pinzas finales romas. En ausencia de cualquier reflejo muscular, considere al animal como inconsciente y proceda a la preparación quirúrgica. Realice esta prueba antes de la manipulación en animales y repita regularmente durante los procedimientos anestésicos y quirúrgicos para confirmar la anestesia.
7. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la deshidratación corneal.
8. Afeitar el área alrededor de la^4ª glándula mamaria con una cuchilla de afeitar (Figura 2A). Usa el^4º pezón como punto de referencia. Retire los pelos sueltos con cinta adhesiva.
   NOTA: Alternativamente, se puede usar crema depilatoria para eliminar los pelos.
9. Desinfecte la piel expuesta con etanol al 80% o povidona yodada y coloque al ratón en el área quirúrgica estéril sobre su espalda con el hocico en una máscara nasal de anestesia utilizando una mezcla de isoflurano / O_{2 al} 1,5%.
10. Asegure las extremidades delanteras y traseras del ratón con cinta de papel.
    NOTA: Deje el ratón anestesiado y en recuperación en la almohadilla térmica tanto como sea posible, durante y después de la cirugía.
11. Use una cortina o gasa quirúrgica estéril precortada para cubrir al ratón mientras deja el área quirúrgica expuesta.

3. Implantación de R.MIW (tiempo estimado: 30 min)

1. Verifique si el animal está adecuadamente anestesiado mediante la realización de una prueba de extracción de la pata. Levante suavemente la piel con un fórceps Graefe fino y haga una incisión diagonal de 10-15 mm usando pequeñas tijeras de resorte en la piel en la parte superior de la^4ª almohadilla de grasa mamaria utilizando el^4º pezón como punto de orientación (Figura 2A). Asegúrese de no cortar o dañar el peritoneo o la glándula mamaria.
2. Defina la región de interés (ROI) en función de las características macroscópicas del tejido mamario, incluida la ubicación del ganglio linfático o una lesión tumoral, y trate de mantener el ROI central con respecto a la incisión.
3. Separe la piel de la almohadilla de grasa mamaria y las capas de tejido subyacentes mediante una disección roma de hasta 5-8 mm alrededor de la línea de incisión para crear un bolsillo que se ajuste al marco R.MIW (Figura 2BI).
4. Recoja el R.MIW con fórceps estériles y pruebe si la incisión es lo suficientemente grande como para insertar la ventana. Si es necesario, agrande ligeramente la incisión hasta que el R.MIW encaje.
5. Retire el R.MIW y coloque una sutura de cuerda de bolso alrededor de la incisión con una sutura de seda 5-0 (trenzada, no reabsorbible). Coloque la sutura 1-2 mm desde el borde de la incisión desde el exterior hasta el interior de la piel, comenzando desde el extremo caudal de la incisión.
6. Mueva aproximadamente 5 mm hacia arriba a lo largo de la incisión y pase el hilo de sutura a través de la piel de adentro hacia afuera. Repita este procedimiento a lo largo del borde de la incisión, creando así una sutura circular que consta de 5-6 bucles (Figura 2BII). La salida final de la rosca de sutura debe ubicarse aproximadamente a 2-5 mm de distancia de la primera entrada.
   NOTA: Tenga cuidado de no colocar la sutura demasiado cerca del borde de la incisión, ya que esto aumenta el riesgo de desgarro de la piel. Colocar la sutura demasiado lejos del borde de la incisión aumenta el riesgo de infección entre el exceso de piel y el surco del R.MIW.
7. Coloque el R.MIW dentro de la incisión y use las pinzas Graefe para colocar cuidadosamente la piel en el surco del R.MIW. Asegúrese de dejar los bucles de la sutura afuera.
8. Tire de los bucles de la sutura de la cuerda de la bolsa y apriete la sutura en la ranura del R.MIW tirando suavemente de ambos extremos de la sutura (Figura 2BIII). Ata con nudos quirúrgicos y corta el exceso de hilo.
9. Aplique vaselina en el borde interno del R.MIW con un palillo de dientes, mientras se asegura de evitar el tejido subyacente. Empuje suavemente el marco de la ventana hacia abajo con pinzas estériles o dos dedos, y coloque la tapa en el marco R.MIW (Figura 1B). Esto evitará un volumen de aire entre el tejido de la glándula mamaria y la tapa R.MIW.
10. Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y apriete la tapa girando la tapa en el sentido de las agujas del reloj (aproximadamente 5 °) (Figura 1C y Figura 2BIV).
11. Si queda algo de aire después de apretar la tapa R.MIW, use una aguja de insulina estéril para eliminar el exceso de aire. Introduzca la aguja a través de la piel en la cavidad entre el tejido mamario y el párpado y saque lentamente el émbolo, creando así un vacío entre el tejido de la glándula mamaria y el párpado R.MIW.
12. Administrar, después de la cirugía, analgesia como buprenorfina (0,1 mg/kg diluido en NaCl estéril al 0,9%) mediante inyección subcutánea. Repetir la inyección subcutánea con buprenorfina a las 8 h y 16 h después de la cirugía.
13. Vuelva a colocar el ratón en la jaula para recuperarse y monitorear de cerca hasta que esté completamente despierto, o continúe con el paso 4 para obtener imágenes inmediatas.
14. En esta etapa postquirúrgica, monitoree de cerca a los ratones para detectar signos de incomodidad o complicaciones en función de parámetros vitales, como la respiración, la reactividad, el comportamiento, la postura y el peso corporal. Controle cuidadosamente la piel que rodea la ventana para detectar signos de inflamación y necrosis. Si no se producen complicaciones, el R.MIW permitirá sesiones repetidas de IVM durante varias semanas después de la implantación.

Figura 2: Descripción general del procedimiento quirúrgico y la implantación de ventanas. (A) Se realiza una incisión diagonal cerca del^4º pezón de un ratón hembra y la piel y el tejido subyacente se desconectan mediante disección roma. (B) El ganglio linfático inguinal y la forma de la almohadilla de grasa se pueden usar para la orientación correcta del tejido (I). Se coloca una sutura de cuerda de bolso en la piel alrededor de la incisión (II), y después de encajar en el marco de la ventana, la sutura se aprieta en la ranura para asegurar el marco de la ventana y se asegura mediante nudos quirúrgicos (III). El último paso es la inserción y el bloqueo de la tapa en el marco de la ventana (IV). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Microscopía intravital repetida a través del R.MIW

NOTA: La estrategia de IVM repetida descrita aquí se optimizó para un sistema confocal multifotón invertido equipado con una etapa motorizada y una cámara de clima oscuro a 35.8 ° C.

1. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando una mezcla de isoflurano/O_{2 al} 3%. Verifique la pérdida de conciencia realizando una prueba de extracción de la pata (descrita en el paso 2.6). Aplique ungüento para los ojos para prevenir la deshidratación corneal durante la sesión de imágenes.
2. Inspeccione el estado del marco y la tapa R.MIW, incluida la estabilidad de las suturas o cualquier daño potencial a la tapa. En caso de daño a la tapa, la tapa se puede reemplazar como se describe en el paso 5.
3. Transfiera el ratón a una caja de imágenes precalentada (37 °C) hecha a medida (Figura 3A) y coloque el ratón con la cabeza en el cono de la nariz. La caja de imágenes consiste en un marco que encaja dentro de la etapa automatizada del microscopio. El marco está diseñado para sostener una incrustación hecha a medida con un orificio del diámetro del R.MIW (Figura 3A).
4. Una entrada con un cono de nariz se conecta a la parte frontal de la caja y se conecta a una estación de vaporizador de isoflurano utilizando una mezcla de isoflurano / O_{2 al 2% al 2}%. Una toma de corriente está conectada a una unidad de eliminación anestésica para garantizar la circulación y evitar la acumulación de isoflurano en la caja. La caja de imágenes se puede cerrar con una tapa transparente.
5. Coloque el ratón sobre la incrustación de tal manera que el R.MIW caiga en el orificio de la incrustación de la caja de imágenes (Figura 3A). Aplique parafilm y cinta de papel sobre la parte posterior del ratón para estabilizar el ratón y reducir el movimiento del tejido debido a la respiración.
6. Cierre la caja de imágenes con la tapa e inserte la caja de imágenes en la etapa del microscopio.
7. Reduzca la dosis de isoflurano gradualmente en el transcurso de la sesión de imágenes para mantener una anestesia estable pero superficial (típicamente entre 1.5% -0.8% de mezcla de isoflurano / O₂ ).
8. Proporcione una nutrición adecuada durante las imágenes como se describe a continuación.
   1. Para sesiones de imagen <3 h, inyecte al ratón por vía subcutánea 200-300 μL de PBS estéril para la hidratación.
   2. Para sesiones de imágenes >3 h, siga los pasos que se detallan a continuación.
      1. Para obtener imágenes a largo plazo, infunda nutrientes al ratón. Para esto, use una mezcla de infusión estéril disponible comercialmente que contenga aminoácidos y glucosa. Coloque una aguja flexible por vía subcutánea en el cuello del ratón y asegúrela con cinta de papel.
      2. Conecte una jeringa de 10 ml con la mezcla de nutrientes preparada a un tubo de silicio flexible y empuje la mezcla de nutrientes hasta que haya llegado al final del tubo.
      3. Conecte el tubo de silicona a la aguja flexible. Tome el extremo del tubo y colóquelo a través de uno de los orificios de la caja de imágenes (de adentro hacia afuera, dejando el lado del accesorio de la aguja en la caja).
      4. Inyecte 50 μL de solución de infusión cada 30 min.
9. Asegure la caja de imágenes en la etapa del microscopio y defina el área de interés utilizando el modo de epifluorescencia del microscopio.
10. Aplique la configuración deseada del microscopio según el modelo de ratón (Figura 3B). Las estructuras de los vasos, los patrones de colágeno (visualizados por la segunda generación armónica) y otras estructuras anatómicas estables, incluido el ganglio linfático inguinal, se pueden usar como puntos de referencia. Adquiera imágenes utilizando un microscopio confocal multifotón invertido a una profundidad de 12 bits y un objetivo de agua 25x utilizando un tamaño de paso Z que varía de 1.0 a 4.0 μm (pila z total que varía de 150 a 800 μm). Aplique la siguiente configuración estándar: formato de 1024 x 1024, velocidad de escaneo de 600 Hz, modo bidireccional.
11. Visualice las fibras de colágeno I realizando una segunda generación armónica utilizando una longitud de onda de excitación de 860 nm y detección a 425-435 nm. Las longitudes de onda de excitación y detección para los diferentes fluoróforos se indican en la Tabla 1.

Tabla 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

12. Utilice la función Espiral en el modo de navegador de software de imágenes para generar una gran visión general de tilescan para crear un mapa de referencia del tejido (Figura 3B). Defina los ROI dentro de la visión general en espiral, defina los planos Z superior e inferior para determinar la pila Z. Pulse Inicio para obtener pilas Z tridimensionales (xyz) o cuatridimensionales detalladas (xyzt) del tejido.
    NOTA: Durante todo el experimento de imagen, el ratón debe ser monitoreado de cerca. Para sesiones de imágenes largas, se recomienda un oxímetro de pulso y una sonda de temperatura. La respiración del ratón debe ser regular y al mismo ritmo. Si el ratón comienza a mostrar signos de jadeo, se debe reducir la cantidad de isoflurano.
13. Al final de cada sesión de imágenes, mantenga el ratón en una almohadilla térmica hasta que esté completamente despierto. Si el ratón muestra signos de incomodidad o movilidad reducida, mantenga la jaula durante más tiempo en la almohadilla térmica y proporcione geles nutritivos en lugar del chow regular.
    NOTA: Entre las sesiones de imágenes, el ratón debe ser monitoreado de cerca para detectar signos de incomodidad, como disminución del consumo de alimentos y agua, respiración rápida, disminución del movimiento, temblor, postura corporal anormal o pelaje descuidado. En caso de signos claros de incomodidad, siga las pautas institucionales con respecto al bienestar animal y finalice el experimento cuando se alcance el punto final humanitario.
14. Repita los pasos 4.1 a 4.12 para cada sesión de imagen repetida y utilice el mosaico de información general para volver sobre las mismas posiciones en varios puntos de tiempo (Figura 3B). La frecuencia de las imágenes dependerá de la pregunta de investigación y el momento del proceso estudiado, y generalmente varía de sesiones de imágenes dos veces al día a una vez por semana.
15. Al final del período experimental deseado, sacrificar a los animales con un R.MIW implantado utilizando anestesia profunda con isoflurano seguido de dislocación cervical. Si lo desea, diseccione los órganos de interés para realizar más análisis ex vivo .
16. Alternativamente, mantenga al animal vivo para futuros análisis in vivo . En ese caso, retire la sutura de la bolsa que sujeta el R.MIW cortándola con tijeras de resorte y separe cuidadosamente el anillo de la ventana de la piel del ratón con pinzas romas. Limpie los bordes de la piel que anteriormente sostenían la ventana y proceda con una sutura continua simple (material absorbible, como el ácido poliglicólico).
17. Una vez cerrada la piel, ata los hilos de sutura inicial y final con dos nudos cuadrados (4 lanzamientos). Para minimizar la isquemia tisular, los nudos deben estar lo suficientemente sueltos como para permitir el flujo sanguíneo en el borde de la piel. Desinfecte la herida con povidona yodada para prevenir la inflamación y promover la curación de la piel.

Figura 3: Flujo de trabajo de IVM longitudinal. (A) Representación esquemática de un experimento típico de IVM de varios días. (B) Imágenes de una región tumorígena dentro de la glándula mamaria adulta. Antes de cada sesión de imágenes, un mosaico de visión general de baja resolución (panel superior) puede facilitar la identificación de la(s) región(es) de interés en los días de imagen posteriores. El patrón de colágeno I (segunda generación armónica, magenta), la estructura del tejido y los patrones de células marcadas diferencialmente con proteínas fluorescentes (representadas en verde, amarillo y rojo) se pueden usar para volver sobre la misma área de tejido. Las barras de escala representan 1 mm (vista general tilescan) y 100 μm (paneles inferiores). (C) Representación esquemática del constructo reportero R26-Confetti . Tras la recombinación de Cre inducida por tamoxifeno, el constructo de Confetti se recombina estocásticamente, lo que resulta en la expresión de uno de los cuatro fluoróforos (nGFP, YFP, RFP o mCFP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Abrir y cerrar la tapa del R.MIW entre sesiones de imagen

1. Mantenga la esterilidad mediante el uso de guantes estériles y esterilice todos los artículos que entren en contacto con el ratón. Herramientas quirúrgicas de autoclave antes de la cirugía (consulte el paso 2 para obtener más detalles).
2. Encienda la almohadilla térmica y cubra la alfombra con una cortina estéril y anestesia el ratón en una cámara de inducción utilizando una mezcla de isoflurano/O_{2 al} 3%. Verifique la anestesia adecuada realizando una prueba de reflejo de extracción de la pata.
3. Transfiera el ratón de la cámara de inducción a una máscara nasal de anestesia y reduzca el nivel de isoflurano a 1.5% -2% de mezcla de isoflurano / O₂ .
4. Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y afloje la tapa girando la tapa en sentido contrario a las agujas del reloj. Si es necesario, aplique un poco de PBS estéril precalentado (37 °C) en la ventana para facilitar el aflojamiento de la tapa.
5. Coloque la tapa del R.MIW en un plato estéril con PBS estéril hasta su uso posterior. Limpie el vidrio de la tapa con demi-agua y posteriormente etanol al 80%. Mantenga la tapa en PBS estéril hasta su uso posterior.
6. Evite que el tejido expuesto se seque agregando algunas gotas de PBS estéril a la superficie del tejido.
7. Aplicar o inyectar cualquier sustancia o células de interés sobre el tejido expuesto, se puede utilizar un volumen máximo de 50 μL. Espere unos minutos hasta que el líquido sea absorbido por el tejido. Alternativamente, el tejido se puede manipular o reposicionar utilizando fórceps estériles y contundentes para optimizar las condiciones de imagen para ROI específicos.
8. Aplique vaselina en el borde interno del R.MIW, asegurándose de evitar el tejido subyacente. Coloque la tapa en el marco R.MIW como se describe en el paso 3.9, coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y apriete la tapa girando la tapa en el sentido de las agujas del reloj (aproximadamente 5 °).

Resultados

Para estudiar la dinámica proliferativa de las células epiteliales mamarias durante las diferentes etapas de desarrollo de la glándula mamaria se realizó el protocolo descrito. El diseño del R.MIW se representa en la Figura 1, y el procedimiento para implantar un R.MIW se resume en la Figura 2. El R.MIW se implanta quirúrgicamente entre la glándula mamaria y la piel. Se utiliza una sutura para sostener dentro del anillo de la ventana y evitar que los ratones tiren de las suturas (Figura 2). Las suturas que sujetan el R.MIW están hechas de seda no absorbible, que tiene propiedades hipoalergénicas, una textura suave y es fácil de manejar. El anillo R.MIW está hecho de titanio, uno de los materiales más biocompatibles que no promueven la inflamación o necrosis después de la implantación²¹. Si se siguen las condiciones asépticas y las suturas están bien ejecutadas, la implantación de la glándula mamaria R.MIW presenta un bajo riesgo de complicaciones postoperatorias. Además, a diferencia de la implantación de ventana de imagen abdominal²², la implantación de R.MIW no es un factor limitante para la supervivencia del ratón porque la glándula mamaria no es un órgano vital y permite la obtención de imágenes diarias hasta el límite especificado en el protocolo ético. El único factor que limita la duración de la implantación de la ventana es la renovación homeostática de la piel, lo que eventualmente conducirá a que las suturas se caigan después de 4 a 6 semanas. Por lo tanto, es importante inspeccionar regularmente la estabilidad de las suturas. Si se desea, las suturas se pueden quitar y reemplazar por una nueva sutura de cuerda de bolso en condiciones asépticas (como se describe en los pasos 3.5 a 3.8) para garantizar la estabilidad de la ventana.

Un desafío importante cuando se utiliza el enfoque de imágenes de varios días es volver sobre un ROI en días consecutivos. Con este fin, se puede incluir un análisis general rápido antes de seleccionar el ROI (s) (Figura 3B). Se pueden usar múltiples puntos de referencia tisulares para volver sobre la misma región del tejido, incluida la señal de la red de colágeno (visualizada por la segunda generación armónica), la estructura del tejido, así como los patrones locales de células marcadas de manera diferencial o estocástica con colorantes o proteínas fluorescentes (Figura 3B). En este ejemplo representativo, se implantó un R.MIW en la 4ª glándula mamaria de un MMTV-PyMT; R26-CreERT2^het; R26-Confetti^het ratón hembra al inicio de la formación palpable del tumor. Posteriormente, la recombinación estocástica fue inducida por inyección de 1,5 mg de tamoxifeno, lo que resultó en la recombinación de la construcción de confeti en algunas células (Figura 3C). Las células tumorales recombinadas fueron seguidas durante un período de 20 días (Figura 3B,C). Si se impide la obtención de imágenes de la misma región de la glándula mamaria durante días consecutivos, la ventana se puede abrir en un entorno aséptico (como se describe en el paso 5.1) para aclarar aún más y reposicionar el tejido para mejorar la visibilidad y la adquisición de imágenes (Figura 3A).

Usando este método, la glándula mamaria en desarrollo durante la pubertad fue seguida a nivel de una sola célula. Se realizó IVM repetido a través de un R.MIW utilizando R26-CreERT2^het; R26-mTmG^het ratones hembra entre 4-6 semanas de edad, en los que todas las células están marcadas con tdTomato de membrana (Figura 4A)²³. A los ratones se les inyectó una dosis baja de tamoxifeno (0,2 mg / 25 g de peso corporal), lo que resultó en una recombinación esporádica de la construcción mTmG, causando un cambio de rojo a verde en algunas células de todos los tejidos, incluida la glándula mamaria (Figura 4B). Los mismos ROI se revisaron durante varios días para visualizar los cambios morfológicos dentro de la glándula mamaria, incluida la elongación ductal y la ramificación ductal (Figura 4C) a una resolución celular. Es importante destacar que esta combinación de marcado de células estocásticas y IVM de varios días también permite visualizar los cambios dinámicos del entorno ductal, como la dinámica de células individuales en el estroma que rodea los conductos alargadores y ramificados (Figura 4D), así como la dinámica celular dentro del ganglio linfático inguinal (Figura 4E).

Figura 4: IVM multidía de morfogénesis ramificada puberal. (A) Pubertal R26-CreERT2; A los ratones R26-mTmG de edad entre 4 y 6 semanas se les inyectó una dosis baja de tamoxifeno que condujo a la recombinación mediada por Cre del alelo R26-mTmG y se les tomó una imagen en los días 1, 3 y 5 para seguir los cambios dinámicos en el desarrollo de la glándula mamaria. (B) Representación esquemática del constructo de ratón R26-mTmG , que en condiciones no recombinadas da como resultado la expresión ubicua de tdTomato (mT) de membrana. Tras la recombinación mediada por Cre, mT se cambia para la expresión de eGFP (mG) de membrana. (C) Representación 3D de un conducto mamario alargado y ramificado durante varios días fotografiado a través de un R.MIW en un R26-CreERT2; Ratón hembra R26-mTmG a las 6 semanas de edad. (D) Imágenes de plano Z único de la punta ramificada (paneles superiores) y la rama alargada (paneles inferiores). mT se representa en rojo, y mG en cian, las barras de escala representan 100 μm (A y B). Las células individuales en el estroma están resaltadas por asteriscos blancos. Tenga en cuenta que la intensidad de la señal se incrementó manualmente para resaltar las células individuales en el estroma, lo que lleva a una apariencia ligeramente sobreexpuesta de las células epiteliales mamarias. (E) Imágenes representativas del ganglio linfático inguinal de un R26-CreERT2; Ratón hembra R26-mTmG fotografiado a través de un R.MIW, mostrando un escaneo de mosaico general (panel izquierdo), imágenes de zoom (paneles derechos) de un solo plano Z (arriba) y una representación 3D (abajo). La segunda generación armónica (colágeno I) se muestra en verde, mT en rojo y mG en cian. Las barras de escala representan 500 μm (visión general tilescan) y 100 μm (imágenes de zoom). Los paneles de figuras C y D se modifican a partir de Messal et al. ². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Del mismo modo, en la glándula mamaria adulta, el enfoque R.MIW propuesto permite la visualización de las mismas estructuras ductales durante varios días con una visibilidad sin compromisos. Incluso el uso de modelos de reportero fluorescente menos brillante²⁴, como el modelo de ratón Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), permite la visualización de la estabilidad ductal y los cambios morfológicos sutiles a una resolución celular (Figura 5). Tenga en cuenta que la visibilidad entre el día 3 y el día 5 mejoró significativamente después del reposicionamiento del tejido (Figura 5).

Figura 5: Imágenes de varios días de la glándula mamaria adulta. 3D representó imágenes de una estructura ductal mamaria de un ratón hembra adulta Cdh1-mCFP (cian, que marca la expresión de células luminales positivas para ecadherina) durante varios días consecutivos. El patrón de colágeno I (segunda generación armónica, magenta) se utilizó para volver sobre el mismo ROI, y la señal Cdh1-mCFP se utilizó para marcar las células ductales (luminales). Tenga en cuenta que la visibilidad después del día 3 mejoró mediante la apertura de la tapa R.MIW y el reposicionamiento del tejido. Las barras de escala representan 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para evaluar la heterogeneidad proliferativa de las células epiteliales mamarias durante el ciclo hormonal a nivel unicelular, se utilizó el modelo^25,26 de ratón reportero Kikume Verde-Rojo (KikGR) foto-convertible, que tiene expresión ubicua de la proteína KikGR. KikGR es un fluoróforo brillante que sufre una conversión de verde a rojo tras la exposición a la luz violeta y la relación rojo/verde se puede utilizar como un proxy para la actividad proliferativa de una célula² (Figura 6A, B). Utilizando el enfoque R.MIW, seguimos las mismas células dentro del árbol ductal de la glándula mamaria adulta durante varios días y encontramos heterogeneidad proliferativa previamente imprevista en todo el árbol ductal (Figura 6C). Las células proliferativas altas y bajas se distribuyeron equitativamente en las diferentes áreas convertidas (Figura 6C, D). Sorprendentemente, a nivel local, las células vecinas mostraron grandes diferencias en su relación rojo/verde (Figura 6C, D). La cuantificación de la relación rojo/verde de diferentes células (como proxy de su actividad proliferativa) 10 días después de la fotoconversión, reveló tasas de dilución altamente variables de algunas células dentro del mismo microambiente ductal (Figura 6E). Juntos, estos datos revelan una notable heterogeneidad proliferativa local dentro de la glándula mamaria adulta y, al mismo tiempo, una tasa de rotación uniforme global.

Figura 6: IVM longitudinal de heterogeneidad proliferativa en la glándula mamaria adulta utilizando el modelo de ratón KikGR. (A) Los ratones KikGR fueron fotografiados en el día 0 antes y después de la exposición a la luz violeta. Las sesiones de imágenes se repitieron en los días 2, 6 y 10 después de la conversión. (B) Representación esquemática de los resultados hipotéticos tras la fotoconversión de células epiteliales mamarias KikGR después de la proliferación (panel izquierdo) y sin proliferación (panel derecho) en función del tiempo. (C) La misma área de la glándula mamaria fue fotografiada a través de un R.MIW durante un período de 10 días. Las regiones más pequeñas se fotoconvirtieron en el día 0 y muestran una tasa de dilución similar de la señal roja de Kikume a lo largo del tiempo, lo que indica una tasa de rotación igual en todo el epitelio. (D) Las imágenes de zoom (planos Z individuales) de las regiones indicadas en el panel C muestran heterogeneidad proliferativa a nivel celular 6 y 10 días después de la fotoconversión. Las barras de escala representan 100 μm (panel C) y 10 μm (panel D). (E) Cuantificación de la relación rojo/verde de células seleccionadas aleatoriamente (n = 48 celdas) en tres áreas fotoconvertidas. Una alta relación rojo/verde es indicativa de una baja tasa de dilución y baja actividad proliferativa, mientras que una baja relación rojo/verde es indicativa de una alta tasa de dilución y proliferación. Los paneles de figura C-E han sido modificados de Messal et al. ². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El R.MIW permite la obtención de imágenes longitudinales de la glándula mamaria sana y enferma en su entorno nativo y mínimamente interrumpido y permite la visualización repetida de la glándula mamaria en diversas etapas de desarrollo. El diseño R.MIW permite que la ventana se abra en cualquier momento durante el experimento. El acceso visual a largo plazo al tejido de interés puede verse obstaculizado, por ejemplo, por la acumulación de restos celulares en la cubierta. En tales casos, el R.MIW se puede abrir antes o inmediatamente después de una sesión de imágenes para permitir la limpieza de toda el área de tejido visible y la tapa. La tapa extraíble también permite manipulaciones del tejido, así como la aplicación local de sustancias, como inhibidores y terapias específicas, colorantes de etiquetado o tipos celulares específicos de interés.

Este método supera la limitación de los procedimientos de flap cutáneo mamario descritos anteriormente 4,7,8,13, que se limitan a una sesión de imágenes, y pueden visualizar procesos como la morfogénesis ramificada (Figura 5), el recambio de tejido homeostático (Figura 6) o el crecimiento tumoral a nivel celular (Figura 3B ). Sin embargo, al mismo tiempo, el R.MIW permite la manipulación local del tejido entre sesiones de imágenes, lo que constituye un gran activo del R.MIW en comparación con el MIW ^3,18 publicado anteriormente y todas las demás ventanas^{de imágenes 20,22}. Al abrir el R.MIW, es importante mantener las condiciones asépticas en todo momento para prevenir cualquier fuente de infección. La capacidad de abrir el R.MIW en un entorno aséptico permite optimizar las condiciones de imagen antes de cada sesión de imagen, lo que mejora en gran medida el acceso visual a largo plazo al tejido de interés. Específicamente, en la glándula mamaria, que está incrustada en un estroma rico en adipocitos, esto es de gran valor. Además, la tapa reemplazable podría permitir de manera única la administración local de terapias, diferentes tipos de células, colorantes de etiquetado, microdisección guiada por imágenes o cualquier otra manipulación local del tejido sin la necesidad de terminar el experimento de IVM. Por ejemplo, para estudiar la iniciación del tumor, se podrían inyectar poblaciones específicas de células cancerosas directamente en el árbol ductal o el estroma en un punto de tiempo IVM determinado y una ubicación precisa de la glándula mamaria, siempre que este ROI sea accesible a través del anillo R.MIW. Para estudiar la progresión tumoral, poblaciones específicas de células cancerosas (en un lugar específico, en un microambiente específico o con un comportamiento específico) podrían ser fotomarcadas durante la sesión de IVM y posteriormente microdiseccionadas utilizando un microscopio de disección fluorescente después de la apertura del R.MIW. Las células aisladas podrían procesarse aún más para análisis posteriores, como la secuenciación del ARNm (de una sola célula). Mediante el uso de este enfoque, se podría acoplar el comportamiento celular in vivo a los perfiles de expresión molecular. La ventaja de la administración local de medicamentos habilitada por el R.MIW permite que el tejido sea fotografiado antes y directamente después del tratamiento. El intervalo necesario para sacar al ratón de la caja de imágenes y posteriormente realizar la administración local del fármaco después de abrir la tapa R.MIW se puede realizar en minutos, lo que permite la captura de fase inmediata de fármacos de acción rápida.

Demostramos que la IVM de la glándula mamaria a través del R.MIW es compatible con muchos modelos diferentes de ratones reporteros fluorescentes. El entorno rico en adiposos es difícil de visualizar y, por lo tanto, se recomienda el uso de fluoróforos brillantes. Sin embargo, como se muestra aquí, incluso los fluoróforos menos brillantes, como mCFP, se pueden visualizar a través del R.MIW en condiciones óptimas de imagen. Inevitablemente, la almohadilla de grasa impedirá la obtención de imágenes de las estructuras ductales más profundas y limitará la imagen a los conductos más superficiales. Una imagen general de baja resolución al comienzo de cada experimento de IVM ayudará a identificar las estructuras ductales de interés que son lo suficientemente superficiales para las imágenes de alta resolución. La manipulación local del tejido, la extracción del tejido conectivo o el reposicionamiento del tejido adiposo después de abrir el R.MIW pueden optimizar la IVM para ROI específicos que están superpuestos por el tejido adiposo. Esta es una ventaja importante sobre todos los diseños de ventanas anteriores, que no permiten realizar estas manipulaciones y requerirían la eliminación completa de la ventana en sí. Específicamente, para la visualización del ganglio linfático inguinal, se recomienda eliminar suavemente el tejido graso suprayacente, lo que reduce la dispersión de la luz y permite imágenes de alta resolución. Al manipular el tejido, mantenga siempre condiciones asépticas y evite el sangrado o el daño grave al tejido, ya que pueden afectar los procesos que se están estudiando durante el experimento de IVM.

El R.MIW está hecho de titanio, un material que se usa comúnmente en la práctica clínica para reemplazar tejidos duros como articulaciones o placas óseas. El titanio tiene varias ventajas sobre las ventanas de acero, incluyendo su carácter ligero e^{inerte 21}. Recientemente, se utilizaron varios otros materiales para generar nuevos tipos de ventanas de imágenes, incluida la ventana de silicio flexible²⁰. A diferencia del R.MIW, la ventana flexible no requiere suturas para la implantación y es adecuada para casi cualquier posición anatómica, específicamente en el caso de tejidos blandos y frágiles. Las ventanas de silicio tienen un impacto mínimo en la motilidad animal debido a su naturaleza ligera y deformable y tal vez más adecuadas en experimentos que estudian la rápida expansión y crecimiento de tejidos²⁰. Otra ventaja sobre la versión de titanio es que las ventanas de silicio son compatibles con otras modalidades de imagen, incluida la resonancia magnética^20,27. Sin embargo, será importante tener en cuenta que los objetivos están optimizados para cubiertas de vidrio de 0,17 mm. Además, el tejido mamario es susceptible a los movimientos respiratorios, que son difíciles de restringir usando la ventana flexible, especialmente cuando se usa un microscopio invertido. Los artefactos respiratorios se minimizan mediante el diseño R.MIW y la fijación del R.MIW en la incrustación de la caja de imágenes. Como resultado, las imágenes adquiridas utilizando la configuración R.MIW propuesta no se distorsionan debido a los artefactos respiratorios. Sin embargo, pueden ocurrir derivas menores en la localización del tejido, que generalmente son graduales y pueden corregirse mediante el uso de un software de corrección de movimiento posterior a la adquisición²⁸. Con la creciente caja de herramientas de las tecnologías IVM ^2,20, los requisitos específicos para cada experimento eventualmente determinarán la mejor manera de visualización in vivo del tejido de interés. Los diferentes diseños de ventanas tienen diferentes ventajas y desventajas y, dependiendo de la pregunta de investigación, la configuración de microscopía disponible, la resolución espacial y temporal requerida y el lapso de tiempo total del proceso estudiado, se debe determinar el enfoque óptimo.

En resumen, el R.MIW facilita la caracterización de alta resolución de la dinámica celular durante el desarrollo de la glándula mamaria, la homeostasis y la enfermedad durante varios días o semanas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.9% NaCl	BD 306573		Otras marcas disponibles
Cubreobjetos redondos de 10 mm	Fisher scientific	10696365	Otras marcas disponibles
5-0 suturas de seda trenzada	Ethicon	W580
80% Etanol	casero	NA
Caja de inducción de anestesia	Kentscientific	VetFlo-MSEKIT
Buprenorfina (Vetergesic®)	Ecuphar	NA
Puntas de algodón (estériles)	Fisher scientific	13113743	Otras marcas disponibles
Adhesivo de cianoacrilato	Loctite	NA	Otras marcas disponibles
Pomada para los ojos	Duratears	NA
Aguja de mariposa flexible	Greiner Bio-One	450120	Otras marcas disponibles
Pinzas Graefe (romas)	Fine Science Tools	11051-10
Almohadilla térmica	Kentscientific	RightTemp Jr.	Otras marcas disponibles
Caja de imagen	Hecho a medida	NA
Mezcla de nutrientes Fusion	Braun	Nutriflex especial 70/240
Jeringas de insulina	BD	324911	Otras marcas disponibles
Microscopio multifotónico invertido con platina automatizada	Leica Microsystems	NA
Vaporizador de isoflurano	Kentscientific	VetFlo-1231K
Portaagujas	Fine Science Tools	12510-14
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	semitransparente
Cinta de papel tesa	Tesa	NA
Vaselina Vaselina	NA
Hojas de afeitar	Fisher scientific	11904325	Otras marcas disponibles
Soluciones de tubos de silicona	Elastómeros	NA	Cualquier menaje para el hogar
Tijeras de resorte (pequeñas)	Fine Science Tools	15018-10
Estéril PBS	10010023		ThermoFisher Scientific
(10 ml)	BD	305482	Otras marcas disponibles
Pinzas finas	Fine Science Tools	11413-11
Tapa de titanio para ventana	de imagen mamariaVentana
hecha	a medida NA
Palos de madera palillos de dientes	Fisher scientific	NC1678836	Otras marcas disponibles