Artículo de método

El bioproceso adsorbente mejora el rendimiento de melanina de Pseudomonas stutzeri

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DOI:

10.3791/63339

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12 de enero de 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo sobre bioproceso de adsorción para producir un producto biológico, especialmente un pigmento que inhibe su propia biosíntesis e inhibe el crecimiento del microorganismo que lo produce.

Resumen

Las melaninas son pigmentos naturales, y la presencia de anillo de indol y numerosos grupos funcionales hace que la melanina sea una opción ideal para muchas aplicaciones, como agentes protectores contra los rayos UV, cuidado de la piel, cosméticos, etc. Una Pseudomonas stutzeri marina produce melanina sin la adición de tirosina. La inhibición de la retroalimentación fue observada por la melanina en el cultivo de una bacteria marina productora de melanina, Pseudomonas stutzeri. La melanina también demostró inhibición del crecimiento microbiano. El análisis basado en el modelo de Han-Levenspiel identificó la inhibición de la melanina en el crecimiento celular. La enzima tirosinasa, que produce melanina, fue inhibida por la melanina. El doble gráfico recíproco de la reacción enzimática en presencia de diferentes concentraciones de melanina reveló una inhibición no competitiva del producto. Se desarrolló un bioproceso adsorbente basado en adsorbentes para reducir la inhibición de la retroalimentación por parte de la melanina. Se examinaron diferentes adsorbentes para seleccionar el mejor adsorbente para la adsorción de melanina. La cantidad de dosis y el tiempo se optimizaron para desarrollar el bioproceso de adsorción, que resultó en un aumento de 8,8 veces en la producción de melanina por parte de la bacteria marina Pseudomonas stutzeri (153 mg/L a 1349 mg/L) sin suplementación de tirosina y extracto de levadura.

Introducción

Las melaninas son compuestos polifenólicos cuya unidad monomérica es el anillo de indol. Las melaninas son responsables de la mayoría de las coloraciones negras, marrones y grises de plantas, animales ymicroorganismos. Las melaninas más comunes son las eumelaninas, que son pigmentos de color marrón oscuro o negro ampliamente distribuidos en vertebrados e invertebrados2. Los cefalópodos, las plantas y los microbios son las principales fuentes de melanina3. La melanina obtenida de microorganismos tiene varias ventajas sobre la melanina de cefalópodos y plantas. Son de crecimiento rápido y no causan ningún problema de variaciones estacionales. Además, se modifican de acuerdo con el medio de crecimiento y las condiciones de funcionamiento proporcionadas. Teniendo en cuenta todos estos hechos, las fuentes microbianas son explotadas como una fuente importante de melanina con potenciales aplicaciones comerciales 4,5,6. Guo et al. utilizaron Streptomyces kathirae SC-1 recombinante para producir melanina hasta 28,8 g/L en un medio optimizado7. Lagunas-Muñoz y cols. Obtuvo alrededor de 6 g/L de melanina en E. coli recombinante 8. Wang et al. obtuvieron alrededor de 4,2 g/L de melanina soluble después de la optimización del medio9. Los investigadores también investigaron los cultivos marinos para producir melanina. Kiran et al. produjeron melanina a partir de especies marinas de Pseudomonas 10. Kumar et al. aislaron Pseudomonas stutzeri HMGM-7 de algas marinas, que producían melanina en caldo de nutrientes. Todos los productores de melanina reportados requieren suplementos medios, extracto de levadura y/o peptona para la producción de melanina, lo que puede dificultar la ampliación del bioproceso. Raman et al. investigaron la producción de melanina a partir de Aspergillus fumigatus AFGRD105, que no requirió aditivos costosos11.

Se seleccionó una bacteria marina conocida como Pseudomonas stutzeri, aislada de algas marinas, para la producción de melanina. Este microorganismo no requiere suplementación adicional de tirosina y extracto de levadura para la producción de melanina soluble y crece en medios a base de agua de mar, lo que reduce la huella de agua potable y el costo medio. Thaira et al. informaron de un bioproceso optimizado utilizando harina de pastel de coco para la producción de nanopigmentos de melanina utilizando esta bacteria marina en una publicación anterior12. La melanina producida se utilizó para la eliminación altamente eficiente de metales pesados del agua subterránea sintética. Sin embargo, durante la optimización del medio, se identificó una inhibición plausible de la retroalimentación de la melanina en el crecimiento y la formación del producto. Por lo tanto, en este protocolo, se investiga y cuantifica la inhibición de la retroalimentación de la melanina utilizando el modelo generalizado de Han-Levenspiel. Se desarrolla un protocolo de bioproceso de adsorción simple y efectivo para reducir la inhibición de retroalimentación en la máxima medida.

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Protocolo

1. Crecimiento y mantenimiento del cultivo de Pseudomonas stutzeri .

  1. Obtenga la bacteria Pseudomonas stutzeri de MTCC Chandigarh (suministrada como ampolla liofilizada).
    1. Desinfectar la superficie de la ampolla con alcohol (70%). Marque la ampolla cerca de la mitad del medidor y rompa en el área marcada.
      NOTA: Se debe tener cuidado al abrir la ampolla ya que el contenido está al vacío. Tome precauciones al romper la ampolla, ya que una apertura a presión arrastrará el tapón de algodón hacia un extremo y una apertura apresurada liberará las partículas finas liofilizadas del microbio en el aire.
    2. Retire con cuidado el tapón de algodón con pinzas esterilizadas y agregue 0,3 mL de caldo Luria Bertani (LB) a la ampolla. Déjalo reposar durante 30 min.
    3. Inocular 100 μL de la suspensión a 10 mL de caldo LB (en matraz cónico de 100 mL) y colocarlo en el agitador de la incubadora a 180 rpm mantenido a 37 °C. Transfiera simultáneamente 100 μL de la suspensión al agar LB sólido y extienda para obtener colonias aisladas. Incubar a 37 °C durante toda la noche.
  2. Una vez que el cultivo haya crecido, guárdelos a 4 °C.
  3. Realice el subcultivo después de cada 4 semanas colocando una colonia en una placa de agar LB fresca e incubando la placa a 37 °C durante la noche para que aparezcan las colonias.

2. Estudios de inhibición de la melanina sobre el crecimiento y la actividad enzimática

  1. Preparar el medio de cultivo adicionando 51,4 g/L de glucosa, 49,8 g/L de harina de torta de coco, 0,09 g/L, 0,03 g/L y 0,05 g/L de CuSO4, FeSO4 y MgSO4, respectivamente, en agua de mar artificial (Tabla de Materiales). Realice todos los experimentos en un matraz de agitación de 250 mL con un volumen de llenado de 15 mL a 200 rpm, 37 °C y un pH inicial de 7.
  2. Añadir diferentes concentraciones de melanina (100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L y 1000 mg/L) en cada medio de cultivo al inicio del bioproceso.
  3. Mida la tasa de crecimiento específica, la actividad enzimática de las células y la melanina en diferentes intervalos de tiempo del bioproceso para cada concentración de melanina añadida (sección 3.2).

3. Modelado de la cinética de inhibición de la melanina

  1. Utilice la siguiente ecuación generalizada de Han y Levenspiel13 para modelar la cinética de inhibición de la producción de melanina,
    figure-protocol-1 (1)
    Dónde
    μ = tasa de crecimiento específico aparente (1/h)
    μmáx. = tasa de crecimiento específica máxima (1/h)
    p = concentración del producto (g/L)
    p *= concentración crítica del producto en la que cesa el crecimiento (g/L)
    s = concentración de sustrato (g/L)
    m,n = parámetros
    La ecuación anterior se puede reescribir como
    figure-protocol-2 (2)
    Dónde
    figure-protocol-3 (3)
    y figure-protocol-4 (4)
    La ecuación anterior se puede reorganizar a un gráfico recíproco doble de 1/μ frente a 1/s, como se muestra a continuación
    figure-protocol-5 (5)
  2. Dibuje una línea recta usando los datos de diferentes tasas de crecimiento específicas y concentraciones de sustrato usando la ecuación anterior. La intersección en el eje Y y X, respectivamente, da μmax y Ks, que se pueden sustituir en las ecuaciones 3 y 4 respectivamente para obtener μobs y Kobs.
    La ecuación (3) se puede escribir como
    figure-protocol-6 (6)
  3. Calcule la tasa de crecimiento específica de la cultura cultivada en el paso 2.2 y asígnela comoμ obs.
  4. Utilice el valor de la tasa de crecimiento específica obtenida en el paso 3.3 de la ecuación (6). Ajuste los datos a una ecuación lineal y calcule la pendiente y la intersección.
  5. Utilice la ecuación (3) para calcular la tasa máxima de crecimiento específico en ausencia de melanina.

4. Desarrollo del bioproceso adsorbente

  1. Realice todos los experimentos en un matraz de agitación de 250 mL con un volumen de llenado de 15 mL a 200 rpm, 37 °C y un pH inicial de 7.
  2. Llevar a cabo el bioproceso final optimizado en un biorreactor de tanque agitado de 5 L con un volumen de llenado de 3 L. Mantener el pH del cultivo entre 7-7,5 y el oxígeno disuelto entre el 50%-60% de la saturación en los estudios del biorreactor.

5. Selección del mejor adsorbente de los diferentes adsorbentes disponibles

  1. Agregue diferentes adsorbentes como alúmina, zeolita, celita, tierra de batán y carbón activado en diferentes frascos que contengan el caldo de cultivo.
  2. Añada cada adsorbente por separado a una concentración de 1 g/L al caldo de cultivo y manténgalo en un agitador giratorio a 150 rpm durante 12 rpm.
  3. Separar los adsorbentes por centrifugación a 5000 x g durante 10 min y medir la absorbancia del sobrenadante a 400 nm utilizando un espectrofotómetro.
  4. Seleccione el adsorbente que adsorbe la cantidad máxima de melanina del caldo de cultivo.

6. Efecto del tiempo de dosificación del adsorbente

  1. Iniciar el bioproceso y añadir el adsorbente que produzca la mayor adsorción de melanina del cultivo (seleccionado después de la sección 5). La concentración seleccionada en el paso inicial es de 1 g/L.
  2. Medir la producción máxima de melanina según el protocolo previamente publicado12.
  3. Repita el paso 6.1 añadiendo el adsorbente después de 12 h del inicio del bioproceso y mida la producción de melanina en diferentes momentos del bioproceso.
  4. Repita el paso 6.3 añadiendo el adsorbente después de 24 h, 36 h y 48 h del inicio del bioproceso.
  5. Compare la melanina producida en cada ejecución de bioproceso e identifique el mejor momento de dosificación para la máxima producción y recuperación de melanina.

7. Efecto de la cantidad de dosis de adsorbente

  1. Añadir diferentes concentraciones del mejor adsorbente (0,5, 1, 2, 4, 6, 8 y 10 g/L) a los cultivos en el momento identificado en la sección 6.
  2. Cosechar el bioproceso por centrifugación a 5000 x g durante 10 min.
  3. Recoja el sobrenadante y calcule la cantidad de melanina midiendo la absorbancia a 400 nm.
  4. Lave el pellet que contiene el adsorbente dos veces con agua destilada y etanol para eliminar las células y otros compuestos adheridos al adsorbente. Realizar la etapa de lavado por centrifugación a 5000 x g durante 10 min.
  5. Añadir una solución de NaOH 0,1 M al adsorbente lavado para dessorber la melanina.
  6. Centrifugar la mezcla a 5000 x g durante 10 min y medir la cantidad de melanina en el sobrenadante a 400 nm con un espectrofotómetro.
  7. Repita el proceso de desorción tres veces o hasta que el adsorbente vuelva a su color normal.
  8. Reduzca el pH de esta solución concentrada de melanina desorbida a 3 o menos agregando 1 N HCl usando un agitador con perlas magnéticas para precipitar la melanina. Guarde la solución ácida en el refrigerador durante 1 h para aumentar la precipitación, si es necesario.
  9. Lavar la melanina precipitada así obtenida tres veces con agua destilada por centrifugación a 5000 x g durante 10 min, secar y almacenar a 4 °C.

8. Modelización matemática del bioproceso

  1. Cinética de crecimiento de la biomasa
    1. Cuantificar la tasa de crecimiento de la biomasa utilizando el siguiente modelo modificado de Verhulset desarrollado para la inhibición del producto, como se describe en la ecuación que se da a continuación 14,15,16,17,
      figure-protocol-7 (7)
      Dónde
      x = concentración de biomasa (g/L)
      xm = concentración máxima de biomasa (g/L)
      μobs = tasa de crecimiento específica máxima (1/h) dada por la ecuación (2)
      Vazques et al. (2008) derivaron la siguiente ecuación para la concentración de biomasa a partir de la ecuación (7):
      figure-protocol-8 (8)
      Dónde
      vx = tasa de crecimiento de la biomasa (g/L/h) = μobs·x
      μOBS       = tasa de crecimiento específico observada (1/h)
      τx = tiempo de retardo (h)
      t = tiempo (h)
    2. Utilice la ecuación (8) para calcular la concentración de biomasa en diferentes momentos del bioproceso y simular el perfil de crecimiento de Pseudomonas stutzeri.
  2. Cinética de consumo de sustrato
    NOTA: El sustrato se utiliza para el crecimiento de la biomasa, la formación del producto y el mantenimiento en un bioproceso.
    1. Utilice la siguiente ecuación para equilibrar la utilización del sustrato en el bioproceso,
      figure-protocol-9 (9)
      La mayor parte de la glucosa se utiliza para la generación de biomasa; Por lo tanto, para simplificar, descuidar el consumo de sustrato para la formación del producto reduciría la ecuación (9) a,
      figure-protocol-10 (10)
      Dónde
      S = concentración de sustrato (g/L)
      YP/S = coeficiente de rendimiento del producto, es decir, coeficiente de rendimiento de melanina (g/g)
      P = concentración del producto (g/L), es decir, concentración de melanina (g/L)
      YX/S = coeficiente de rendimiento de biomasa (g/g)
      ms = coeficiente de mantenimiento (g/g/h)
      Integrando la ecuación anterior desde el tiempo t = 0 hasta el tiempo t = t, y sustituyendo el valor de x de la ecuación (8) se obtiene la siguiente ecuación para el perfil de concentración de sustrato17,
      figure-protocol-11 (11)
      Donde, s0 = concentración inicial de sustrato (g/L) y x0 = concentración inicial de biomasa (g/L)
    2. Utilice la ecuación (11) para calcular la concentración de sustrato en diferentes intervalos de tiempo del bioproceso o, si se conoce la concentración de sustrato, utilice la misma ecuación para estimar los parámetros dados en la ecuación.
  3. Cinética de producción de melanina
    1. Utilice la ecuación Ludeking-Pirate para simular la producción de melanina. Sin embargo, la melanina está asociada al crecimiento y, por lo tanto, se descuida el término de formación del producto no asociado al crecimiento, y la ecuación simplificada se puede escribir como,
      figure-protocol-12 (12)
      Dónde
      α = Constante de Ludeking-Pirate ligada a la formación de productos asociada al crecimiento (g/g)
      La integración de la ecuación (12) desde el tiempo t = 0 hasta t = t da como resultado la siguiente ecuación para el perfil de concentración del producto:
      figure-protocol-13 (13)
    2. Utilice la ecuación (13) para calcular α.
  4. Estimación de parámetros cinéticos
    1. Estime todos los parámetros mencionados anteriormente mediante el método de mínimos cuadrados no lineales de estimación de parámetros utilizando cualquier herramienta de software adecuada (por ejemplo, la herramienta de resolución de Microsoft Excel).
    2. Utilice los datos del experimento por lotes para la estimación de parámetros y minimice la suma del error cuadrático (SSE) utilizando la herramienta Solver, como se muestra en la siguiente ecuación,
      Minimizar
      figure-protocol-14 (14)
      Dónde
      xsim = valor simulado y xexp = valor experimental

9. Técnicas analíticas

  1. Extracción de melanina
    1. Centrifugar el cultivo de crecimiento a 5000 x g durante 10 min para eliminar la biomasa.
    2. Agregue un volumen igual de 1 M de NaOH al sobrenadante.
    3. Acidificar el sobrenadante alcalino a pH 2 añadiendo 1 N HCl para precipitar la melanina.
    4. Centrifugar el sobrenadante acidificado a 12000 x g durante 20 min para recoger la melanina.
    5. Lavar la melanina recolectada tres veces con 5 mL de agua destilada, secar durante la noche a temperatura ambiente (RT) y almacenar a 4 °C18.
  2. Cuantificación de melanina
    1. Preparar diferentes concentraciones de soluciones de melanina (0-500 mg/L) disolviendo la cantidad adecuada de melanina en agua de mar artificial (pH 8).
    2. Mida la absorbancia a 400 nm utilizando el espectrofotómetro18.
    3. Prepare la curva de calibración utilizando los datos anteriores.
    4. Centrifugar el cultivo de crecimiento a 5000 x g durante 10 min para eliminar la biomasa y medir la absorbancia del sobrenadante a 400 nm. Calcule la concentración de melanina en el cultivo de crecimiento utilizando la curva de calibración preparada en el paso 9.2.3
  3. Ensayo de tirosinasa
    1. Siga el protocolo que se detalla a continuación para el ensayo de la enzima tirosinasa desarrollado por Ren et al. (2013)19 para determinar la actividad enzimática de la tirosinasa extraída del caldo de cultivo de Pseudomonas stutzeri .
    2. Centrifugar el cultivo bacteriano a 5.000 x g para recoger las células.
    3. Sonicar las células en tampón de fosfato frío de 100 mM de pH 6,5 y centrifugar el homogeneizado a 9000 x g durante 15 min y recoger el sobrenadante, una fuente de la enzima tirosinasa.
    4. Añadir 0,2 mL de la solución enzimática obtenida en el paso anterior a 2,8 mL de tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH 6,5) que contenga 1 mM de L-tirosina (sustrato).
    5. Observe la formación de dopacromo midiendo la absorbancia a 475 nm.
    6. Calcule la actividad de la tirosinasa de la siguiente manera. Una unidad internacional (UI) de actividad de tirosinasa se define como la cantidad de enzima necesaria para oxidar 1 μmol de L-tirosina a dopacromo por minuto. Calcule esto usando el coeficiente de extinción molar del dopacromo (3600 L·M-1·cm-1) mediante la siguiente ecuación,
      figure-protocol-15 (15)
  4. Estimación de la biomasa
    1. Recolectar 5 mL de las muestras a un intervalo de 4 h en la cabina de Bioseguridad, manteniendo la esterilidad. Flamee el tapón de algodón del matraz antes y después de tomar las muestras para reducir las posibilidades de contaminación. Mida la densidad óptica (OD) de las muestras a 660 nm para todas estas muestras.
      NOTA: El medio no inoculado sirve como espacio en blanco. Estas lecturas se utilizarán para estudiar el crecimiento de los microorganismos.
    2. Centrifugar el caldo de cultivo a 5000 x g durante 10 min y 4 °C, recoger el pellet de celda y secar el pellet durante 8 h a 60 °C en un horno de aire caliente para obtener la masa de celda seca.
    3. Prepare la curva de calibración utilizando el DO medido en el paso 9.4.1 y la biomasa correspondiente obtenida en el paso 9.4.2
    4. Utilice la curva de calibración (OD = 0,82٠Biomasa (g/L)) para medir la cantidad desconocida de biomasa midiendo la densidad óptica del caldo de cultivo en un momento dado.
  5. Estimación del ADN
    1. Estime la cantidad de ADN en la muestra midiendo la densidad óptica a 260 nm.
    2. Calcule el ADN usando la siguiente fórmula,
      figure-protocol-16 (16)
      Dónde
      A260= Absorbancia a 260 nm
      0,1 = Volumen de la muestra
      1 = Absorbancia de la solución patrón de ADN de concentración 50 μg/mL, a 260 nm
  6. Estimación de proteínas
    1. Estime la cantidad de proteína en las muestras utilizando un kit de estimación de proteínas de Bradford (Tabla de materiales).
    2. Añadir 5 mL del reactivo Bradford a 0,1 mL del sobrenadante y conservar durante 5 min. Las proteínas presentes en el sobrenadante reaccionan con el reactivo de Bradford para formar un complejo coloreado.
    3. Mida la absorbancia a 595 nm20 utilizando el espectrofotómetro.
  7. Estimación del azúcar reductor total (TRS)
    1. Mida el TRS por el método dinitrosalicílico (DNS)21.
    2. Prepare la solución de DNS disolviendo 1 g de DNS en 50 ml de agua destilada. Agregue 30 g de tartarato de sodio y potasio a esta solución en pequeñas cantidades hasta que el color de la solución se vuelva amarillo lechoso, seguido de amarillo anaranjado transparente con la adición de 20 mL de NaOH 2 N. Aumente el volumen a 100 ml con agua destilada y guárdelo en la oscuridad.
    3. Preparar la solución de trabajo de glucosa (0,01 M) disolviendo 180 mg de glucosa en 100 ml de agua destilada en un matraz estándar.
    4. Pipetear la solución de glucosa estándar (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1 mL) en 5 tubos de ensayo separados. Use un tubo de ensayo que contenga agua destilada (1 ml) como solución en blanco.
    5. Aumente el volumen hasta 2 ml en cada tubo de ensayo utilizando agua destilada.
    6. Agregue 1 ml de reactivo DNS a cada tubo de ensayo y cúbralo con papel de aluminio.
    7. Caliente los tubos de ensayo en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y enfríe hasta RT.
    8. Agregue 9 ml de agua destilada a cada tubo de ensayo y mezcle bien. Mida el diámetro exterior del contenido a 575 nm utilizando un espectrofotómetro.
    9. Mida la concentración utilizando una tabla de calibración preparada con la cantidad de glucosa en el eje X frente a la absorbancia a 575 nm (A575) en el eje Y.
  8. Análisis del tamaño de partícula
    1. Dispersar la melanina biosintetizada en agua destilada (1 mL) utilizando un sonicador.
    2. Agregue la solución de muestra dispersa (1 mL) en el analizador de nanopartículas y mida el tamaño de partícula según el protocolo del fabricante.
  9. Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM)
    1. Secar el polvo de melanina obtenido tras la extracción manteniéndolo a 60 °C durante 8 h.
    2. Cargue el polvo de melanina en la matriz de muestra TEM y mida el tamaño con el microscopio electrónico de transmisión siguiendo el protocolo del operador.

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Resultados

La figura 1A, B muestra el crecimiento y la producción de melanina bajo la influencia de diferentes concentraciones iniciales de melanina. El crecimiento celular y la producción de melanina disminuyeron sustancialmente con el aumento de la concentración inicial de melanina. A una concentración inicial de melanina de 500 mg/L en el medio, la biomasa y la melanina se redujeron a casi el 50% del valor máximo obtenido en el control. A 1000 mg/L de concentración inicial de melani...

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Discusión

La inhibición del producto es un cuello de botella importante en el bioprocesamiento que conduce a una reducción de la productividad. Existen varios métodos para reducir la inhibición del producto, como el bioproceso continuo y las técnicas de eliminación de producto in situ. Sin embargo, estas opciones requieren una revisión completa de la instalación de bioprocesamiento existente 23,24,25,26,27,28.

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses

Agradecimientos

Agradecemos al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST/TSG/WP/2014/58) de la India y al Instituto Nacional de Tecnología de Karnataka por proporcionar fondos para el desarrollo del protocolo mencionado.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  Alúmina+A15A26A3:A13A3:A16A3:A17HiMediaGRM1909
Carbón activadoHiMediaPCT1001
Medio de agua de mar artificialHiMediaM1942
reactivosHiMediaML106
CeliteHiMediaGRM226
CentrífugaREMICM-8
Tubos de centrífugaHiMediaPW1207
Ácido dinitrosalicílicoMatraz HiMediaGRM1582
ErlenmeyerBorosil 4980021
tierra de batánHiMediaGRM232
GlucosaHiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-tirosinaHiMediaRM069
Microsoft ExcelAnalizador
HORIBA ScientificNanopartica SZ-100
Medio de agar nutrienteHiMediaM001
Placa de PetriHiMediaPW054
Tampón de fosfatoHiMediaM1452
Hidróxido de sodioHiMediaMB095
EspectrofotómetroThermofisherGenesys 10
Biorreactor de tanque agitadoScigenicsBioferm LS
TE BufferHiMediaML060
Microscopio electrónico de transmisiónJEOLJEM-2100
ZeolitaHiMediaGRM3834
Bradford kit de de nanopartículas de Microsoft

Referencias

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