Un nuevo método de prueba optocinética para medir la visión de las ratas

Resumen

El método de prueba de comportamiento del nistagmo optocinético (OKN) se utiliza para la evaluación de la agudeza visual en roedores. Aquí se demuestra un método simple que se puede configurar fácilmente en laboratorios de investigación para una evaluación confiable de la función visual tanto en ratas normales como experimentales.

Resumen

El nistagmo optocinético (OKN) es un movimiento ocular reflexivo iniciado por el movimiento de estímulos visuales en el campo de visión. El movimiento de seguimiento de la cabeza asociado con OKN se usa comúnmente como una medida de la función visual en roedores. Para registrar las respuestas de OKN en ratas normales y experimentales, se ha desarrollado un aparato sencillo y económico. Esta configuración utiliza dos pantallas de tableta para mostrar el estímulo visual de OKN que consiste en rayas blancas y negras de alto contraste generadas mediante la aplicación web de visualización de rayas OKN, un software disponible gratuitamente. La rata se coloca dentro de un soporte de plexiglás transparente que limita el movimiento para que la cabeza de la rata mire continuamente hacia la pantalla OKN. La posición del soporte para ratas se puede cambiar para ajustar la distancia entre la rata y la pantalla. Se utiliza una microcámara colocada sobre el soporte para ratas para registrar las actividades visuales de la rata. Estas grabaciones se pueden utilizar para evaluaciones cuantitativas. Sobre la base de la presencia o ausencia de un seguimiento claro de la cabeza, se pueden determinar las respuestas OKN a diferentes frecuencias espaciales. Los datos recopilados demuestran una técnica novedosa para la medición fiable de la agudeza visual en ratas normales y degeneradas de la retina.

Introducción

Cuando el ojo se expone a un movimiento visual sostenido de campo completo, surge un patrón distintivo de movimientos oculares de seguimiento rápidos y suaves y movimientos de la cabeza de baja aceleración en la dirección del movimiento visual, llamado nistagmo optocinético (OKN)^1,2. La vía neurológica de la OKN pasa de la retina al cuerpo geniculado lateral, al lóbulo occipital y al flóculo cerebeloso y se conecta con las neuronas motoras oculares³. El daño neuronal en cualquier lugar a lo largo de estas vías neuronales puede provocar cambios en las respuestas de OKN. La respuesta OKN se utiliza como herramienta para evaluar la simetría cerebral, la ceguera psicógena y la agudeza visual en pacientes humanos ^4,5. La agudeza visual se evalúa mediante la cuantificación de las respuestas funcionales, que pueden ser fundamentales para determinar el éxito de los tratamientos y experimentos centrados en la recuperación de la visión perdida por enfermedades neurodegenerativas ^3,6,7. En los animales, las respuestas OKN se pueden utilizar para evaluar con precisión la agudeza visual, lo que proporciona a los investigadores la capacidad de recopilar datos cuantitativos y cualitativos sobre la función visual. En los roedores, es posible medir la agudeza visual de los ojos izquierdo y derecho de forma independiente en función del sentido de rotación de las rayas tanto en el sentido de las agujas del reloj como en el sentido contrario a las agujas del reloj⁸. Este movimiento en sentido contrario a las agujas del reloj y en el sentido de las agujas del reloj expone a cada ojo a un movimiento naso-temporal (N-T) o tempo-nasal (T-N)⁹, respectivamente. El estímulo T-N da como resultado una respuesta significativamente mayor en comparación con el estímulo N-T, ya que los roedores son más sensibles a los peligros que vienen de atrás o de lado.

Anteriormente, la función visual en ratas normales de laboratorio y ratas degeneradas con retina se evaluó utilizando diferentes métodos de prueba OKN 6,10,11,12,13. Sin embargo, se observan ciertas variabilidades en las puntuaciones de agudeza visual entre los diferentes estudios, incluyendo los datos que se muestran en la presente investigación. Esta variabilidad se puede atribuir principalmente a las diferencias en la configuración de prueba utilizada. Las diferencias en el tamaño del campo de prueba y el tipo de estímulos visuales OKN utilizados ^6,10 pueden ser los factores principales. Los estímulos utilizados en estos experimentos incluyen rejillas de onda sinusoidal para la apariencia de un cilindro virtual¹⁴, cilindros giratorios intercambiables¹⁵ y franjas de alto contraste (blanco y negro) mostradas en cuatro monitores de computadora¹⁰. Las principales limitaciones asociadas con estos aparatos y métodos de prueba OKN incluyen el gran tamaño del equipo, el movimiento de los animales en la arena de prueba y la incidencia frecuente de que el animal caiga de la plataforma de prueba ^7,11,12.

Para minimizar las limitaciones anteriores, se ha desarrollado un nuevo aparato para la prueba de OKN en ratas. Este aparato es comparativamente barato, ha demostrado ser eficiente, fácil de operar y permite la evaluación de la función visual (Figura 1). El aparato utiliza dos pantallas de tableta para mostrar los estímulos visuales OKN (software de visualización) a diferentes frecuencias espaciales. Se utiliza una microcámara para registrar las actividades del animal durante las pruebas para su posterior análisis de los datos. Con el objetivo de hacer un aparato OKN fácil de configurar en los laboratorios de investigación, esta nueva configuración describe modificaciones críticas al aparato de prueba OKN existente. Los estímulos OKN utilizados aquí consisten en rayas blancas y negras a diferentes frecuencias espaciales y diferentes direcciones de rotación (de izquierda a derecha o de derecha a izquierda). El componente principal del aparato de prueba OKN incluye dos tabletas táctiles (7,9 pulgadas) utilizadas para mostrar los estímulos OKN (Figura 2). Se utilizan dos soportes ajustables para mantener las pantallas de la tableta en la posición deseada. Los soportes están fijados de forma segura al borde de una mesa de procedimiento que permite el ajuste de su altura y ángulo. Las ratas se colocan en un soporte para ratas que mira hacia las pantallas de visualización. Los portaratas están hechos de tubo de plástico transparente (polimetacrilato de metilo). El soporte está unido a un pedestal y a un soporte metálico para garantizar una colocación estable en la mesa de procedimientos. El tamaño de los tubos de retención varía de 4 a 6 pulgadas de largo y de 2.5 a 3 pulgadas de diámetro, dependiendo del tamaño de las ratas utilizadas. La distancia entre la rata y la pantalla de visualización se ajusta cambiando la posición del soporte para ratas. El soporte para ratas ayuda a mantener la exposición continua de la cabeza de la rata hacia las pantallas de visualización y reduce sus movimientos durante las pruebas. Se utiliza una microcámara para registrar las respuestas de seguimiento de la cabeza. Las deficiencias de esta nueva configuración incluyen diferentes frecuencias de actualización para la pantalla y la posibilidad de ilusiones ópticas cuando se usan rayas estrechas. Sin embargo, estos pueden considerarse como problemas comunes asociados con una configuración de OKN basada en computadora. Además de los problemas anteriores, en la configuración actual, las ratas no se prueban utilizando un cilindro virtual¹⁴ que influye en la respuesta óptima de OKN. La novedad de este método radica en la técnica y el aparato en el que se emplea el método. Esta técnica se puede configurar fácilmente en laboratorios de investigación para una medición fiable de la agudeza visual en roedores.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices experimentales aprobadas por las autoridades regionales y aceptadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad del Sur de California (USC), y se ajustaron a la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y visual y la directiva europea 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos.

NOTA: Las ratas utilizadas en este estudio son ratas degeneradas de retina pigmentada del Royal College of Surgeons (RCS) y ratas Long Evans (LE). La Figura 3 muestra una ilustración esquemática que muestra las diferentes etapas de las pruebas y análisis de OKN.

1. Procedimientos

1. Preparación de la configuración
   1. Mantenga a la rata en la jaula y durante 30 minutos dentro de la sala de pruebas con las luces de la habitación apagadas.
      NOTA: Esto ayuda a minimizar el estrés que se produce durante el transporte y proporciona una condición de iluminación uniforme para todos los experimentos.
   2. Establezca la posición de las pantallas de la tableta frente entre sí a 155° para mostrar la aplicación web de visualización de franjas OKN.
   3. Coloque el soporte para ratas en el centro de dos pantallas de tableta a 4.5 pulgadas del centro.
      NOTA: En esta posición, la cabeza de la rata estará a unas 3.5 pulgadas de distancia de la pantalla.
   4. Haga clic en la aplicación web de visualización de rayas OKN desde el escritorio de la tableta para mostrar estímulos visuales (rayas blancas y negras) comenzando con la frecuencia espacial más baja.
      NOTA: Se utilizan frecuencias espaciales de 0,08, 0,15, 0,2, 0,24, 0,28, 0,33, 0,38 ciclos por grados (c/d), comenzando en la frecuencia espacial más baja (0,08c/d) y cambiando a frecuencias espaciales más altas (hasta 0,38 c/d). En cada frecuencia espacial, las ratas se prueban en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj en rotación de rayas (1 minuto cada una).
2. Procedimiento de prueba OKN
   1. Seleccione un soporte para ratas de un tamaño adecuado.
   2. Lleve la rata hacia la abertura del soporte para ratas y guíela con cuidado hacia el interior.
   3. Deje que la rata se asiente dentro del soporte (1-2 minutos) antes de la prueba.
      NOTA: Mediante un manejo adecuado, es posible mantener la rata dentro del soporte en la mayoría de los casos; Cuando sea necesario, el soporte para ratas se mantiene alto (hasta 2 pies por encima de la mesa) durante unos segundos hasta que la rata se calme. Se ha descubierto que el miedo a la altura reduce la tendencia de la rata a bajar del soporte para ratas. Se da tiempo adicional (1-2 min) para que la rata se calme, si es necesario.
   4. Inserte el pedestal del soporte para ratas en el soporte de metal para su colocación estable.
      NOTA: Esta configuración permite cambiar la distancia de visualización de la rata desde la pantalla de la tableta.
   5. Encienda la cámara para iniciar la grabación de video.
   6. Haga clic en la aplicación web de visualización de rayas OKN desde el escritorio de la pantalla de la tableta y comience a ejecutar el programa.
   7. Ejecute los estímulos OKN en la dirección de izquierda a derecha o de derecha a izquierda.
      NOTA: La rotación de las rayas en el sentido de las agujas del reloj activa el ojo izquierdo, mientras que la rotación en el sentido contrario a las agujas del reloj activa el ojo derecho. La dirección inicial de rotación se eligió al azar para evitar una posible habituación.
   8. Observa el comportamiento de seguimiento de la cabeza de la rata.
   9. Comience a realizar la prueba utilizando la frecuencia espacial más baja (0,08 c/d) y, a continuación, aumente la frecuencia espacial paso a paso (en orden ascendente).
   10. Observe la presencia o ausencia de respuestas OKN.
   11. Continúe con las pruebas, no se da un período de descanso entre diferentes frecuencias espaciales.
   12. Detenga la grabación de video después de completar todas las frecuencias espaciales y guarde los datos usando el número de identificación de la rata.
   13. Saque la rata del soporte y colóquela en la jaula durante un período de descanso de aproximadamente 30 minutos entre pruebas consecutivas.
   14. Repita las pruebas tres veces por rata.

2. Análisis de datos

1. Revise el video grabado y determine la agudeza visual de cada rata encontrando las frecuencias espaciales a las que respondió la rata.
2. Registre todas las respuestas (presencia o ausencia de un seguimiento claro de la cabeza) en una hoja de cálculo.
3. Encuentre la frecuencia espacial más alta a la que respondió una rata de las tres pruebas. Se considera la agudeza visual final.
   NOTA: Dado que la medición de la agudeza visual es subjetiva, los datos serán evaluados por dos miembros independientes del personal del estudio para confirmar la puntuación de agudeza visual para cada rata¹². Los resultados se cotejan hasta llegar a un acuerdo sobre la puntuación final. Una respuesta OKN positiva se define como la presencia de una actividad clara y sostenida de seguimiento de la cabeza. El seguimiento aleatorio de la cabeza (no relacionado con los estímulos visuales de OKN) o la ausencia de cualquier movimiento de la cabeza se considera una respuesta negativa de OKN.
4. Realizar análisis estadísticos para comparar grupos o entre los dos ojos (ojo izquierdo vs ojo derecho).
   NOTA: Revise las grabaciones de video para aclarar que las respuestas positivas o negativas se realizan según sea necesario.

Resultados

La prueba OKN se realizó utilizando ratas degeneradas de retina (RD) del Royal College of Surgeons (RCS) y ratas Long Evans (LE) normales de la misma edad. Las ratas LE (n = 4) se utilizaron para establecer los datos de referencia para determinar las puntuaciones de agudeza visual en ratas normales utilizando la nueva configuración. El análisis estadístico se realizó con el programa Microsoft Excel (media ± desviación estándar). Las ratas LE exhibieron un seguimiento robusto de la cabeza a frecuencias espaciales de 0,15 ...

Discusión

La OKN es un movimiento reflejo de los dientes de sierra de los ojos en respuesta a un estímulo a la deriva, que se utiliza como herramienta para evaluar la agudeza visual en sujetos humanos³. En animales, incluidos primates y roedores, la prueba OKN se utiliza como una medición cuantitativa de la función visual. El presente estudio describe un novedoso y económico aparato de OKN que se puede instalar fácilmente en laboratorios de investigación para pruebas de com...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
iPad Mini	Apple	A1489	utilizan dos iPad Minis para mostrar el software de visualización OKN Stripes.
Micro-cámara/Micro-cámara Accesorio	Lanon B097H6WWDS		La micro-cámara se utiliza para grabar el experimento. El accesorio de microcámara se conecta al escritorio y sostiene la cámara mirando hacia la rata. Las respuestas de seguimiento de la cabeza se registran y evalúan a diferentes distancias, frecuencias espaciales y direcciones.
Tubo de plexiglás/soporte para ratas	Los mejores acrílicos	B07KMF31MC	El tubo de plexiglás se utiliza para sujetar a la rata, con la cabeza expuesta, durante la duración del experimento. El tubo se conecta a otro accesorio de tubo de plexiglás vertical para estabilizar el soporte de ratas durante el experimento. Todo el aparato fue diseñado y construido en el laboratorio.
Accesorio de tubo de plexiglás	Los mejores acrílicos	B07KMF31MC	Este accesorio sostiene el soporte para ratas frente a las pantallas del iPad y permite manipular la distancia entre la rata y los iPads.
Soportes de pantalla	Kabcon B08JLRPKQ1		utilizan dos soportes de pantalla para sostener los iPads con el fin de mostrar el software de visualización de rayas OKN a la rata.
OKN Stripes Visualization Web Application	The MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushin	https://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/	Esta aplicación es un software disponible gratuitamente para mostrar estímulos visuales (rayas blancas y negras) en diferentes frecuencias