Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para expresar las proteínas de unión de brecha en ovocitos de Xenopus y registrar la corriente de unión entre dos ovocitos appuestos utilizando un amplificador comercial diseñado para grabaciones de abrazadera de voltaje de ovocitos duales en un modo de medición de corriente lateral alta.

Resumen

La expresión heteróloga de conexinas e inexinas en ovocitos de Xenopus es un enfoque poderoso para estudiar las propiedades biofísicas de las uniones de brecha (GJ). Sin embargo, este enfoque es técnicamente desafiante porque requiere una pinza de voltaje diferencial de dos ovocitos opuestos que comparten un terreno común. Aunque un pequeño número de laboratorios han logrado realizar esta técnica, esencialmente todos ellos han utilizado amplificadores caseros o amplificadores comerciales que fueron diseñados para grabaciones de un solo ovocito. A menudo es un desafío para otros laboratorios implementar esta técnica. Aunque se ha incorporado un modo de medición de alta corriente lateral en un amplificador comercial para grabaciones de abrazadera de voltaje de oocitos duales, no había habido ningún informe para su aplicación hasta nuestro estudio reciente. Hemos hecho que el enfoque de medición de alta corriente lateral sea más práctico y conveniente mediante la introducción de varias modificaciones técnicas, incluida la construcción de una plataforma de grabación basada magnéticamente que permite la colocación precisa de ovocitos y varios electrodos, el uso de la solución de baño como conductor en electrodos diferenciales de voltaje, la adopción de un electrodo KCl comercial de baja fuga como electrodo de referencia, fabricación de electrodos de corriente y voltaje a partir de capilares de vidrio de pared delgada, y posicionamiento de todos los electrodos utilizando dispositivos basados magnéticamente. El método descrito aquí permite registros convenientes y robustos de la corriente de unión (I_j) entre dos ovocitos xenopus opuestos .

Introducción

Los CG son canales intercelulares que pueden permitir el flujo de corriente y el intercambio de pequeñas moléculas citosólicas entre las células vecinas. Existen en muchos tipos de células y realizan diversas funciones fisiológicas. Los GJ en vertebrados están formados por conexinas, mientras que los de invertebrados por inexinas. Cada GJ consta de dos hemicanales yuxtapuestos con 6 u 8 subunidades por hemical, dependiendo de si son conexinas o inexinas ^1,2,3. Los seres humanos tienen 21 genes^de conexina 4, mientras que los modelos de invertebrados comúnmente utilizados C. elegans y Drosophila melanogaster tienen 25 y 8 genes de inexina, respectivamente ^5,6. El empalme alternativo de las transcripciones de genes puede aumentar aún más la diversidad de las proteínas GJ, al menos para las inexinas ^7,8.

Los CG se pueden dividir en tres categorías basadas en composiciones moleculares: homotípicas, heterotípicas y heteroméricas. Un GJ homotípico tiene todas sus subunidades siendo idénticas. Un GJ heterotípico tiene dos hemicales homoméricos, pero los dos hemicanales están formados por dos proteínas GJ diferentes. Un GJ heteromérico contiene al menos un hemicanal heteromérico. Las diversidades moleculares de los GJ pueden conferir distintas propiedades biofísicas que son importantes para sus funciones fisiológicas. Las propiedades biofísicas de GJ también son moduladas por proteínas reguladoras⁹. Para comprender cómo los GJ realizan sus funciones fisiológicas, es importante conocer sus composiciones moleculares, propiedades biofísicas y el papel de las proteínas reguladoras en sus funciones.

Los sistemas de expresión heterólogos se utilizan a menudo para estudiar las propiedades biofísicas de los canales iónicos, incluidos los CG, y los efectos de las proteínas reguladoras en ellos. Debido a que los sistemas de expresión heteróloga permiten la expresión de proteínas específicas, generalmente son más susceptibles de diseccionar funciones de proteínas que los tejidos nativos donde las proteínas con funciones redundantes pueden complicar el análisis, y el registro de I_j puede ser inalcanzable. Desafortunadamente, las líneas celulares más comúnmente utilizadas, excepto la célula Neuro-2A, son inapropiadas para estudiar las propiedades biofísicas de GJ debido a complicaciones por las conexinas endógenas. Incluso las células Neuro-2A no siempre son apropiadas para este tipo de análisis. Por ejemplo, no pudimos detectar ningún I_j en células Neuro-2A transfectadas con las inexinas UNC-7 y UNC-9 ni en ausencia ni en presencia de UNC-1 (no publicado), lo que es necesario para la función de unC-9 GJs en C. elegans ^9,10. Por otro lado, los ovocitos Xenopus son un sistema alternativo útil para los análisis electrofisiológicos de GJs. Aunque expresan una proteína GJ endógena, la conexina 38 (Cx38)¹¹, las posibles complicaciones se pueden evitar fácilmente inyectando un oligonucleótido antisentido^{específico 12}. Sin embargo, los análisis de GJ con ovocitos xenopus requieren una pinza de voltaje diferencial de dos células yuxtapuestas, lo cual es técnicamente un desafío. Los primeros éxitos de la abrazadera de doble voltaje de los blastómeros de rana se informaron hace unos 40 años^13,14. Desde entonces, muchos estudios han utilizado esta técnica para registrar I_j en ovocitos de Xenopus pareados. Sin embargo, esencialmente todos los estudios previos se han realizado con amplificadores caseros ^12,15,16 o amplificadores comerciales diseñados para grabaciones en ovocitos individuales (GeneClamp 500, AxoClamp 2A o AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)^{8,17,18,19,20} . Debido a que incluso los amplificadores comerciales no proporcionan instrucciones para la abrazadera de voltaje de doble ovocito, a menudo es un desafío para los laboratorios electrofisiológicos nuevos o menos sofisticados implementar esta técnica.

Solo se ha desarrollado un amplificador comercial para abrazadera de voltaje de doble ovocito, el OC-725C de Warner Instruments (Tabla de Materiales, Figura 1A). Este amplificador se puede utilizar en un modo estándar (para ovocitos individuales) o en un modo de medición de alta corriente lateral (para ovocitos simples o dobles) dependiendo de si dos tomas en su sonda de voltaje están conectadas (Figura 1B, C). Sin embargo, hasta nuestro reciente estudio⁷, no había habido una sola publicación que describiera el uso de este amplificador en su modo de medición de alta corriente lateral. Aunque el amplificador ha sido utilizado por otro laboratorio para grabaciones de ovocitos duales, se utilizó en el modo estándar en lugar del modo de lado alto^21,22. Esta falta de informes sobre el uso del amplificador en su modo de medición de alta corriente lateral podría deberse a dificultades técnicas. No fue posible obtener grabaciones de ovocitos duales estables utilizando el modo de lado alto siguiendo las instrucciones del fabricante. A lo largo de los años, hemos probado tres enfoques diferentes para grabaciones de ovocitos duales, incluido el uso de dos amplificadores OC-725C en el modo de medición de alta corriente lateral, dos amplificadores OC-725C en el modo estándar y dos amplificadores de otro fabricante. Finalmente logramos obtener grabaciones estables solo con el primer enfoque después de un extenso ensayo y error. Esta publicación describe y demuestra los procedimientos que utilizamos para expresar las proteínas GJ en los ovocitos xenopus, registrar I_j utilizando el modo de medición de alta corriente lateral y analizar los datos electrofisiológicos utilizando un software comercial popular. Puede encontrarse información adicional sobre la técnica de doble pinza de voltaje en otras publicaciones^19,23.

Protocolo

Las cirugías se realizan siguiendo un protocolo aprobado por el comité institucional de cuidado de animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Connecticut.

1. Cirugía de rana y preparación de ovocitos desfolicados

1. Anestesiar una rana africana adulta con garras (Xenopus laevis) (Tabla de Materiales) sumergiéndola en una solución de tricaína fría (con hielo) (~ 300 mg / L).
2. Espere (~ 15 minutos) hasta que la rana muestre poca o ninguna respuesta al apretar sus patas palmeadas. Coloque la rana en una mesa de operaciones con el vientre hacia arriba.
3. Después de una incisión longitudinal (8-10 mm de largo) en la región abdominal inferior izquierda o derecha, extraiga suavemente un pequeño trozo de tejido ovárico con un par de fórceps y corte el tejido ovárico con un par de tijeras pequeñas.
4. Sumergir inmediatamente el tejido ovárico libre en una solución ND96 libre de Ca²⁺ (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) dentro de una placa de Petri de 60 mm.
5. Después de cerrar la incisión con suturas simples interrumpidas con una sutura de seda 5-0 (Tabla de materiales), vuelva a colocar la rana en un tanque de agua poco profundo para su recuperación.
   NOTA: La incisión se cierra en dos pasos: primero las capas peritoneal y muscular, y luego la capa de la piel. Cada rana se somete a 5 cirugías con al menos un intervalo de 4 semanas entre dos cirugías consecutivas.
6. Transfiera el tejido ovárico aislado a un tubo centrífugo de 50 ml que contenga 10 ml de solución ND96 libre de Ca²⁺ con 20 mg de colagenasa (Tabla de Materiales) y 20 mg de hialuronidasa (Tabla de Materiales).
7. Agite el tubo en un agitador orbitario a temperatura ambiente (RT) hasta que todos los ovocitos se hayan aislado (solitario).
8. A partir de entonces, transfiera 30-50 ovocitos a una placa de Petri utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y examine los ovocitos con frecuencia bajo un estereomicroscopio (≥ poder de aumento más alto 25x) para determinar si están defolculados.
   NOTA: La pipeta Pasteur debe ser "cortada" a una abertura de punta más ancha usando un escribano de diamante (Tabla de Materiales) y flameada para alisar el borde de corte.
9. Tan pronto como el 70% -80% de los ovocitos se dedfolulen, decante la solución enzimática inclinando suavemente el tubo. Lave los ovocitos 5 veces llenando el tubo con solución ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl₂ 1.8 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) y decantando la solución.
10. Después del lavado final, transfiera los ovocitos a una placa de Petri de 60 mm que contenga solución ND96. Recoger y transferir ovocitos grandes y de aspecto saludable a una placa de Petri de 60 mm que contiene solución de ND96 suplementada con piruvato de sodio (2 mM) y penicilina-estreptomicina (100 U/mL) utilizando una pipeta Pasteur de vidrio limpio.
    NOTA: Los "ovocitos grandes y de aspecto saludable" son aquellos de las etapas V y VI que no muestran signos de sobredigestión por parte de las enzimas.
11. Coloque la placa de Petri que contiene los ovocitos recogidos dentro de una cámara ambiental (15-18 °C).

2. Expresión de la proteína GJ

1. Sintetizar ARN complementario (ARNc) de una conexina o inexina específica in vitro utilizando un kit de transcripción de ARN (Tabla de Materiales) siguiendo el protocolo del fabricante.
2. Precipitar el ARNc utilizando un método de cloruro de litio descrito en el manual de usuario del kit de transcripción de ARN.
3. Lave el pellet con etanol al 70%, disuelva en 20 μL de H₂O libre de nucleasa y agregue 1 μL de inhibidor de la ribonucleasa (40 U, Tabla de materiales).
4. Medir la concentración del ARNc utilizando un espectrofotómetro (Tabla de Materiales).
5. Mezclar el ARNc con un oligo sinsentido Cx38 para que las concentraciones finales sean de 200-1.000 ng/μL de cRNA y 100 ng/μL oligo.
   NOTA: La secuencia oligo es 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, que corresponde a los nucleótidos de -5 a +25 en Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI Adhesión: NM_001088018)¹¹. El oligo se mantiene como una solución madre (2,0 mg/ml) antes de ser mezclado con el ARNc.
6. Elimine las partículas en el ARNc girando en una microcentrífuga (~ 16,000 x g) durante 2 minutos, y transfiera rápidamente todo el sobrenadante a un nuevo tubo mediante pipeteo (evite perturbar el fondo del tubo de la microcentrífuga).
7. Divida el ARNc en alícuotas (2,5 μL/vial) y guarde las alícuotas en un congelador de -80 °C.
8. Prepare una placa de inyección de ovocitos pegando una pequeña pieza (~ 1 cm x 1 cm) de malla de nylon (Tabla de materiales) en la parte inferior de una placa de Petri de 35 mm con un adhesivo epoxi de curado rápido.
   NOTA: La placa de inyección de ovocitos es reutilizable. Lávelo con etanol al 70% después de cada uso.
9. Llene la placa de inyección de ovocitos aproximadamente hasta la mitad con la solución de ND96 (suplementada con piruvato y penicilina-estreptomicina).
10. Coloque 25-30 ovocitos en filas dentro de la placa de Petri.
11. Prepare micropipetas de vidrio para inyecciones de ovocitos siguiendo las instrucciones del manual de usuario del inyector de nanolitros automatizado (Tabla de materiales).
    NOTA: El uso de un biselador de microelectrodos (Tabla de materiales) puede ayudar a producir micropipetas de inyección afiladas que causan un daño mínimo a los ovocitos.
12. Rellene una micropipeta de inyección con aceite mineral ligero e insértela en el soporte de micropipeta del inyector.
13. Transfiera el ARNc de una de las alícuotas almacenadas a la superficie interior de una cubierta o fondo de placa de Petri mediante pipeteo.
14. Aspire la gota de ARNc en la punta de la micropipeta presionando el botón FILL en el controlador del inyector.
15. Inyecte el ARNc (~50 nL/ovocito) pulsando el botón INYECTAR .
    NOTA: El volumen de inyección puede ser ajustado por los interruptores dip en el controlador del inyector.
16. Transfiera los ovocitos inyectados a una nueva placa de Petri que contenga solución de ND96 (suplementada con piruvato y penicilina-estreptomicina), y manténgalos dentro de la cámara ambiental (15-18 ° C) durante 1-3 días (dependiendo de la velocidad y el nivel de expresión de la proteína GJ). Reemplace la solución diariamente transfiriendo los ovocitos a una nueva placa de Petri.

3. Emparejamiento de ovocitos

1. Transfiera algunos de los ovocitos inyectados a una placa de Petri de 35 mm que contenga solución ND96.
2. Use dos pinzas finas (Tabla de Materiales) para despegar suavemente la membrana vitelina transparente que envuelve el ovocito.
   NOTA: Puede ser necesario afilar las puntas de las pinzas antes del primer uso y, de vez en cuando, utilizando un trozo de papel de lija fino (600 Grit).
3. Coloque 2 ovocitos por pocillo en una cámara de emparejamiento de ovocitos (Figura 1D) que contenga solución ND96 (suplementada con piruvato y penicilina-estreptomicina).
   NOTA: La cámara de emparejamiento de ovocitos se construye pegando una pequeña pieza de una Minitray Microwell (Tabla de Materiales) en la parte inferior de una placa de Petri de 35 mm (Tabla de Materiales) utilizando un adhesivo epoxi de curado rápido. La Minitray se corta en trozos pequeños utilizando un cortador de alambre caliente (Tabla de Materiales). El uso de la Minitray para el emparejamiento de ovocitos fue descrito originalmente por otros²⁴. Aunque una proteína GJ podría distribuirse de manera no uniforme en la membrana celular de los ovocitos dependiendo de las propiedades de carga de los residuos de aminoácidos en sus dominios citosólicos²⁵, el emparejamiento aleatorio (sin discriminar entre los polos animal y vegetal del ovocito) parece ser suficiente en general.
4. Mantenga la placa de Petri que contiene ovocitos pareados en RT en la mesa de aislamiento para ser utilizada para registros electrofisiológicos.
   NOTA: La duración del emparejamiento puede variar de unas pocas horas a un día. Una práctica conveniente es emparejar ovocitos al final de la tarde y registrarlos al día siguiente.

4. Preparación del sistema de adquisición

1. Configure dos amplificadores de abrazadera de ovocitos OC-725C (Tabla de materiales) en el modo de medición de corriente lateral alta ajustando un interruptor de inmersión interno (Figura 1B).
2. Conecte a tierra los amplificadores interconectando primero las tomas de circuito de tierra en los paneles traseros y luego conectándose a la jaula de Faraday y la luz de fibra utilizada para iluminar la cámara de grabación.
3. Conecte los amplificadores a un convertidor de señal analógico a digital (Tabla de materiales) y configúrelos en el módulo Clampex del software pClamp (Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante del amplificador.
4. Pruebe el sistema de adquisición con la celda modelo suministrada con el amplificador.
   1. Conecte la sonda V_DIFF y los cables de corriente (I) a la celda modelo, conecte los zócalos rojo y negro de la sonda V_DIFF con el puente incluido, conecte cualquiera de las patas del puente a cualquiera de los pines de la celda modelo y conecte el cable de tierra de la celda modelo al cable desde la toma GROUNDS CIRCUIT del amplificador (Figura 1E).
   2. Ponga a cero los medidores de electrodo de voltaje (Vm) y electrodo de baño (Im) del amplificador girando las perillas Vm OFFSET y Ve OFFSET , respectivamente, cambie la abrazadera de OFF a Fast o SLOW y gire el dial GAIN en el sentido de las agujas del reloj a un nivel que permita una abrazadera de voltaje adecuada (Figura 1A). El interruptor D.C. GAIN puede estar en la posición OUT o IN .
   3. Ejecute un protocolo de adquisición simple que contenga algunos pasos de voltaje para confirmar que el voltaje que se muestra en el medidor de Vm cambia de acuerdo con el protocolo de adquisición y que los rastros de voltaje y corriente se muestran correctamente en Clampex.
      NOTA: Solo se puede probar un amplificador cada vez que se utiliza este enfoque.

5. Registro I_j entre ovocitos pareados

1. Crear protocolos de adquisición para la grabación I_j en el software pClamp.
   NOTA: Cree dos protocolos de adquisición. En uno de ellos, el amplificador # 1 se utiliza para producir una serie de pasos de voltaje de membrana (V_m) (por ejemplo, -150 a +90 mV a intervalos de 10 mV), mientras que el amplificador # 2 se utiliza para mantener un V_m constante (por ejemplo, -30 mV). En el otro protocolo, el amplificador # 2 se usa para producir los pasos V_m , mientras que el amplificador # 1 se usa para mantener la constante V_m. Los pasos V_m positivos y negativos deben aplicarse alternativamente (por ejemplo, -150, +90, -140, +80 ......), que se pueden programar en Clampex utilizando la función Lista de usuarios en el protocolo de adquisición.
2. Configurar la etapa de grabación
   1. Deje caer una placa de Petri que contenga ovocitos emparejados en el receptáculo de la placa de Petri en la plataforma de grabación (Figura 2A)
   2. Seleccione un par de ovocitos y gire la placa de Petri si es necesario para que los dos ovocitos estén en la dirección izquierda y derecha, y bloquee la etapa en posición por su base magnética.
   3. Fije los soportes magnéticos que sostienen las sondas de corriente y voltaje en lugares apropiados en la mesa de aislamiento.
      NOTA: Asegúrese de que las sondas de corriente y voltaje de un amplificador estén ubicadas en el lado izquierdo, mientras que las del otro amplificador estén en el lado derecho, y que la sonda de voltaje esté frente a la sonda de corriente en cada lado (Figura 2B, C).
3. Configurar el electrodo de referencia
   1. Coloque un electrodo de referencia (Tabla de Materiales) cerca del borde de la placa de Petri hacia el lado del usuario (Figura 2B, C).
   2. Conecte el electrodo de referencia a la toma negra (Circuit Ground) en solo una de las dos sondas V_DIFF .
4. Configurar los electrodos V_DIFF
   1. Tire de un par de micropipetas de vidrio, rompa un poco de la punta con el escribano de diamante (Tabla de materiales) y alise el borde de la punta puliendo al fuego.
      NOTA: La resistencia de la punta debe ser inferior a 150 kΩ (medida con ND96 en la pipeta). Por lo general, se utilizan micropipetas con una resistencia de punta de 20-150 kΩ.
   2. Sostenga la micropipeta sobre la llama de un quemador de alcohol para doblarla a un ángulo suave (~ 130 °) en una posición de ~ 1 cm de distancia de la punta.
      NOTA: Las micropipetas fabricadas son reutilizables. Enjuáguelos con agua después de cada uso.
   3. Rellene la pipeta de vidrio completamente con una solución ND96, insértela en un soporte de microelectrodo precargado (con ND96) (Tabla de materiales, Figura 2D) y asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes en el sistema.
   4. Inserte el pin de 2 mm del soporte de microelectrodo en el zócalo de 2 mm de un cable de conexión de electrodo V_DIFF (Figura 2D).
   5. Sujete el zócalo de 2 mm en una pinza de base magnética (Figura 2D) y apunte la punta del electrodo V_DIFF hacia uno de los dos ovocitos (Figura 2E).
      NOTA: Ajuste la posición y el ángulo de la pinza para que la punta del electrodo esté muy cerca del ovocito
   6. Inserte el pin de 1 mm del cable de conexión del electrodo V_DIFF en el zócalo rojo (entrada V_DIFF ) en la sonda V_DIFF del mismo lado.
   7. Prepare y conecte un electrodo V_DIFF para el otro ovocito y amplificador siguiendo procedimientos similares.
      NOTA: Una vista en primer plano de un par de ovocitos y todos los electrodos se muestran en la Figura 2E.
5. Configurar los electrodos de corriente y voltaje
   1. Prepare los electrodos de voltaje y corriente de los capilares de vidrio, rellene (aproximadamente a mitad de camino) con una solución KCl (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 con KOH) e insértelos en los soportes de electrodos provistos con los amplificadores.
      NOTA: Los electrodos deben tener una resistencia de ~1 MΩ. Se pueden obtener electrodos adecuados a partir de un tipo de capilares de vidrio de pared delgada (Tabla de Materiales) utilizando un conjunto específico de parámetros de tracción (Tabla 1). Tales puntas pueden penetrar fácilmente en la membrana celular de los ovocitos sin la necesidad de presionar el botón Vm o Ve BUZZ en el amplificador.
   2. Baje los electrodos en la solución de baño, ponga a cero los medidores Vm e Im girando los diales Vm OFFSET y Ve OFFSET y verifique la resistencia del electrodo presionando Vm Electrode Test y Ve Electrode Test.
   3. Inserte los electrodos de corriente y voltaje en los ovocitos y observe potenciales de membrana negativos (típicamente -20 a -50 mV).
      NOTA: Los medidores Vm e Im del mismo amplificador deben mostrar dos valores idénticos o muy similares.
6. Adquisición de datos
   1. En la sección Abrazadera del amplificador, confirme que D.C. GAIN está en la posición IN, gire la perilla GAIN en el sentido de las agujas del reloj a un nivel que permita la abrazadera de voltaje adecuada (generalmente de un tercio a la mitad del rango completo) y gire el interruptor de la abrazadera de OFF a FAST.
      NOTA: Al encender la abrazadera, los medidores Vm e Im mostrarán el voltaje de retención y la corriente de retención, respectivamente. Aunque la corriente de retención puede variar un poco dependiendo de las condiciones de los ovocitos, generalmente es pequeña y estable en la explotación V_m (por ejemplo, -30 mV).
   2. Ejecute un protocolo de adquisición.
      NOTA: Se mostrarán cuatro rastros en la pantalla. Las trazas de voltaje y corriente de un amplificador indican los pasos de Vm aplicados al ovocito #1 y la corriente necesaria para producir los pasos de Vm , mientras que los del otro amplificador indican la constante Vm (-30 mV) del ovocito #2, y la corriente inyectada para mantener esta constante Vm. La corriente inyectada en el ovocito #2 representa la I_j.

6. Análisis de datos

1. Análisis con Clampfit.
   1. Abra un archivo abf grabado en el módulo Clampfit de pClamp.
   2. Utilice los cursores 1 y 2 para encerrar un segmento de la línea de base antes de que las trazas I_j .
   3. Haga clic en el icono Ajustar línea base para abrir una ventana línea base. Seleccione Restar media de cursores 1..2 para Método y confirme que Todas las señales visibles y Todas las trazas visibles están seleccionadas para Selección de trazas.
   4. Al hacer clic en Aceptar, la ventana Línea base se cierra, las líneas base de todas las trazas de corriente y voltaje convergen en el nivel cero. Tenga en cuenta que los pasos de voltaje cambian a nuevos niveles que son iguales al voltaje original menos el voltaje de retención (por ejemplo, -30 mV).
   5. Para trazar la relación I_j y V_j usando el estado estacionario I_j, encierre un segmento deseado de las trazas I_j que representan el estado estacionario I_j con los cursores 1 y 2, coloque el cursor 3 en cualquier lugar dentro de la ventana de tiempo de los pasos de voltaje.
   6. Vaya a Analizar / Gráfico rápido / I-V para abrir una ventana I-V .
   7. En Eje X (Voltaje), seleccione Cursor 3 en Señal, especifique la señal de paso de voltaje (por ejemplo, Voltaje 1) en el menú desplegable y marque la casilla Invertir.
      NOTA: La casilla Invertir está marcada para convertir la V_m a valores equivalentes a V_j, que se define como V_m del ovocito #2-V _m del ovocito #1.
   8. En Eje Y (Actual), seleccione la fuente de la señal I_j (por ejemplo, Actual 0) en el menú desplegable junto a Señal, defina Región como Cursores 1..2 en el menú desplegable y seleccione Media.
      NOTA: Para trazar las relaciones pico I_j y V_j , los cursores 1 y 2 deben incluir el segmento de las trazas I_j que contienen el pico I_j en el paso 6.1.5 y seleccionar Pico (en lugar de Media) en el paso 6.1.8.
   9. En la opción Destino , seleccione Reemplazar o Anexar.
   10. Al hacer clic en Aceptar en la ventana I-V , se muestra una relación I_j - V_j en la pantalla, y se pueden encontrar los valores I_j y V_j correspondientes haciendo clic en Ventana/Resultado.
2. Trazar y ajustar la relación G_{j-V j} en OriginPro (Tabla de Materiales)
   1. Copie las dos columnas que contienen los valores V_j e I_j de la ventana Resultados de Clampfit (paso 6.1.10) en un nuevo libro en Origin. Asegúrese de que los valores V_j e I_j estén bajo las columnas X e Y, respectivamente.
   2. Agregue cuatro columnas nuevas en el libro haciendo clic en Columna/ Agregar nuevas columnas.
   3. Asigne a la primera columna nueva el nombre G_j, llénela introduciendo la ecuación "columna I_j/columna V_j * 1.000" en la ventana Establecer valores de columna y cree un gráfico de dispersión de la relación G_{j-V j}.
      NOTA: La multiplicación por 1.000 (opcional) es para evitar el inconveniente de tratar con números muy pequeños en pasos posteriores.
   4. Ajuste los puntos de datos G_j sobre los rangos V_j negativo y positivo de forma independiente a la función de Boltzmann. Calcule G_j en V_j = 0 mV ingresando los valores G_jmax, G_jmin, A y V₀ a partir del ajuste en la ecuación de Boltzmann, lo que se puede hacer en una hoja de cálculo. El G_j así obtenido se utilizará como G_jmax en el siguiente paso.
      NOTA: La ecuación para ajustarse a la función de Boltzmann es: G j = (G_{jmax-G jmin})/{1 + exp[A(V_{j-V 0})]} + G_jmin, en la que V₀ es la V_j en la que la conductancia es medio máxima, G_jmax es la conductancia máxima, G_jmin es la V_j-insensible conductancia residual²³. Para realizar la conexión, primero agregue la ecuación de Boltzmann como una nueva función de conexión en OriginPro y, a continuación, seleccione esta función para la conexión. Introduzca los valores aproximados de semilla para G_jmax, G_jmin, V₀ y A antes de ejecutar la función de ajuste. Asegúrese de que el parámetro G_jmax no esté fijo para esta conexión.
   5. Nombra la segunda y tercera columnas nuevas como nGj-L y nGj-R ("n" para "normalizado"), y llénalas dividiendo la columna G_j por los valores G_jmax derivados de las curvas izquierda y derecha G_j - V_j , respectivamente (paso 6.2.4).
   6. Asigne a la cuarta columna nueva el nombre nGj-LR y llénela copiando los valores de los rangos V_j negativo y positivo de las columnas nGj-L y nGj-R, respectivamente.
   7. Cree un diagrama de dispersión para nGj-LR sobre V_j y ajuste los puntos de datos sobre los rangos V_j negativo y positivo a la función de Boltzmann de forma independiente. Asegúrese de que el parámetro G_jmax esté fijado en 1.0 para la conexión.
   8. Mantenga registros de los resultados de ajuste (por ejemplo, el gráfico ajustado y los valores G_jmin, V₀ y A ).

Resultados

UNC-7 y UNC-9 son inexinas de C. elegans. Mientras que UNC-9 tiene una sola isoforma, UNC-7 tiene múltiples isoformas que difieren principalmente en la longitud y secuencia de aminoácidos de sus amino terminales ^7,8. Estas inexinas pueden formar GJ homotípicas y heterotípicas (de UNC-7 y UNC-9) cuando se expresan en ovocitos xenopus ^7,8. Las trazas representativas I_j ...

Discusión

La optimización del sistema parece ser necesaria para los experimentos de pinza de voltaje de ovocitos duales. Sin él, las grabaciones pueden ser altamente inestables, y los amplificadores pueden tener que inyectar una cantidad excesiva de corriente para llegar al Vm objetivo, lo que resulta en daños en los ovocitos y fallas de grabación. Varios factores son críticos para obtener registros de ovocitos duales estables con el método de medición de corriente lateral alta. Primero, los electrodos de corriente y volt...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soporte magnético de puente de agar	ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	Más estable que la abrazadera de tubo Narishige debido a su base magnética más grande, pero requiere modificación para acomodar un casquillo hembra de 2 mm.
Inyector automático de nanolitros	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, EE. UU.	Nanoject II	Inyector automatizado de nanolitros
Colgenasa, Tipo II	Gibco-USA, Langley, OK, USA	17101-015
Diamond Scriber	Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU	62108-ST
Sonda de voltaje diferencial	Warner Instruments, Hamden, CT, EE. UU.	7255DI
Convertidor de señal analógica a digital	Molecular Devices, San José, CA, EE. UU.	Digidata 1440A
Pinzas Dumont #5	World Precision Instruments, Sarasota, FL, EE. UU.	500341
Capilares de vidrio	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, EE. UU.	3-000-203-G / X
Cortador de alambre caliente	Amazon.com	Proxxon 37080	Una alternativa es Hercules 8500 DHWT, que tiene un pedal de control.
Hialuronidasa, Tipo I-S	MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU	H3506
	Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, EE. UU.	MB-L-45
Instrumento Sutter, Novato, CA, EE. UU		BV-10
	World Precision Instruments, , Sarasota, FL, EE. UU	Extractor
	Instrumento Sutter, , Novato, CA, EE. UU	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, EE. UU	. 438733	Microwell Minitray
malla de nailon	, Sparta, TN, EE. UU	U-CMN-1000
Amplificador de abrazadera de ovocitos	Warner Instrumentos, , Hamden, CT, EE. UU.	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.	2020b
pClamp	Molecular Devices, , San José, CA, EE. UU	Versión 10
Electrodo de referencia	World Precision Instruments, Sarasota, FL, EE. UU	DRIREF-2SH	Especificaciones: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (inhibidor de la ribonucleasa)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
Sutura de seda 5-0	Covidien, North Haven, CT, EE. UU.	VS890
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
Cápsulas de vidrio de pared delgada	World Precision Instruments,Sarasota, FL, EE. UU
	Narishige International USA, Amityville, NY, EE.UU	CAT-1	Listo para usar, pero su posición es propensa a cambiar debido a la pequeña base magnética.
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, FL, EE. UU.	IMP-XL-FM