Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus

Yuan Shui; Zhao-Wen Wang

doi:10.3791/63361

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Artículo de método

Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus

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DOI:

10.3791/63361

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21 de enero de 2022

Yuan Shui¹ , Zhao-Wen Wang¹

¹Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para expresar las proteínas de unión de brecha en ovocitos de Xenopus y registrar la corriente de unión entre dos ovocitos appuestos utilizando un amplificador comercial diseñado para grabaciones de abrazadera de voltaje de ovocitos duales en un modo de medición de corriente lateral alta.

Resumen

La expresión heteróloga de conexinas e inexinas en ovocitos de Xenopus es un enfoque poderoso para estudiar las propiedades biofísicas de las uniones de brecha (GJ). Sin embargo, este enfoque es técnicamente desafiante porque requiere una pinza de voltaje diferencial de dos ovocitos opuestos que comparten un terreno común. Aunque un pequeño número de laboratorios han logrado realizar esta técnica, esencialmente todos ellos han utilizado amplificadores caseros o amplificadores comerciales que fueron diseñados para grabaciones de un solo ovocito. A menudo es un desafío para otros laboratorios implementar esta técnica. Aunque se ha incorporado un modo de medición de alta corriente lateral en un amplificador comercial para grabaciones de abrazadera de voltaje de oocitos duales, no había habido ningún informe para su aplicación hasta nuestro estudio reciente. Hemos hecho que el enfoque de medición de alta corriente lateral sea más práctico y conveniente mediante la introducción de varias modificaciones técnicas, incluida la construcción de una plataforma de grabación basada magnéticamente que permite la colocación precisa de ovocitos y varios electrodos, el uso de la solución de baño como conductor en electrodos diferenciales de voltaje, la adopción de un electrodo KCl comercial de baja fuga como electrodo de referencia, fabricación de electrodos de corriente y voltaje a partir de capilares de vidrio de pared delgada, y posicionamiento de todos los electrodos utilizando dispositivos basados magnéticamente. El método descrito aquí permite registros convenientes y robustos de la corriente de unión (I_j) entre dos ovocitos xenopus opuestos .

Introducción

Los CG son canales intercelulares que pueden permitir el flujo de corriente y el intercambio de pequeñas moléculas citosólicas entre las células vecinas. Existen en muchos tipos de células y realizan diversas funciones fisiológicas. Los GJ en vertebrados están formados por conexinas, mientras que los de invertebrados por inexinas. Cada GJ consta de dos hemicanales yuxtapuestos con 6 u 8 subunidades por hemical, dependiendo de si son conexinas o inexinas ^1,2,3. Los seres humanos tienen 21 genes^de conexina 4, mientras que los modelos de invertebrados com....