Method Article

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Abstract

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Los microtúbulos son polímeros de heterodímeros de αβ-tubulina que se organizan en estructuras distintas en las células. Las arquitecturas y redes basadas en microtúbulos a menudo contienen subconjuntos de matrices de microtúbulos que difieren en sus propiedades dinámicas. Por ejemplo, en las células en división, los haces estables de microtúbulos reticulados coexisten muy cerca de los microtúbulos dinámicos no reticulados. Los estudios de reconstitución in vitro basados en microscopía TIRF permiten la visualización simultánea de la dinámica de estas diferentes matrices de microtúbulos. En este ensayo, se ensambla una cámara de imágenes con microtúbulos inmovilizados en la superficie, que están presentes como filamentos individuales u organizados en haces reticulados. La introducción de tubulina, nucleótidos y reguladores de proteínas permite la visualización directa de proteínas asociadas y de las propiedades dinámicas de microtúbulos simples y reticulados. Además, los cambios que ocurren a medida que los microtúbulos individuales dinámicos se organizan en haces se pueden monitorear en tiempo real. El método descrito aquí permite una evaluación sistemática de la actividad y localización de proteínas individuales, así como los efectos sinérgicos de los reguladores de proteínas en dos subconjuntos de microtúbulos diferentes en condiciones experimentales idénticas, proporcionando así información mecanicista que es inaccesible por otros métodos.

Introduction

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Los microtúbulos son biopolímeros que forman andamios estructurales esenciales para múltiples procesos celulares, que van desde el transporte intracelular y el posicionamiento de orgánulos hasta la división celular y el alargamiento. Para ejecutar estas diversas funciones, los microtúbulos individuales se organizan en matrices del tamaño de micras, como husos mitóticos, axonemas ciliares, haces neuronales, matrices interfase y matrices corticales de plantas. Un motivo arquitectónico omnipresente que se encuentra en estas estructuras es un haz de microtúbulos reticulados a lo largo de sus longitudes1. Una característica intrigante de varias estr....

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Protocol

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1. Preparar reactivos

  1. Prepare tampones y reactivos como se describe en la Tabla 1 y la Tabla 2. Durante el experimento, mantenga todas las soluciones en hielo, a menos que se indique lo contrario.
SoluciónComponentesDuración de almacenamiento recomendadaNotas
5X BRB80400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH....

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Results

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El experimento descrito anteriormente se realizó utilizando microtúbulos biotinilados marcados con fluoróforos de 647 nm, microtúbulos no biotinilados marcados con fluoróforos de 560 nm y mezcla de tubulina soluble marcada con fluoróforos de 560 nm. Los microtúbulos fueron reticulados por la proteína reticulante PRC1 (marcada con GFP). Después de generar haces inmovilizados en la superficie y microtúbulos individuales (paso 5.11), la cámara de imágenes se montó en un objetivo de aceite TIRF 100X 1.49 NA y se vio en los c.......

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Discussion

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El experimento descrito aquí amplía significativamente el alcance y la complejidad de los ensayos convencionales de reconstitución de microtúbulos, que tradicionalmente se realizan en microtúbulos individuales o en un tipo de matriz. El ensayo actual proporciona un método para cuantificar y comparar simultáneamente la actividad reguladora de MAP en dos poblaciones, a saber, microtúbulos individuales y haces reticulados. Además, este ensayo permite el examen de dos tipos de haces: los que están preformados a partir de sem.......

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Disclosures

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Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH (no. 1DP2GM126894-01), y por fondos de Pew Charitable Trusts y Smith Family Foundation a R.S. Los autores agradecen al Dr. Shuo Jiang por su contribución al desarrollo y optimización de los protocolos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox)Sigma Aldrich238813
ácido 1,4-piperazinadietanosulfónico (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 cubreobjetos Ciencias de la Microscopía Electrónica63787
2-Mercaptoetanol (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1.5 cubreobjetosCiencias de la Microscopía Electrónica63793
405/488/560/647 nm Láser de cuatro bandas CromaTRF89901-NK
AcetonaSigma Aldrich320110
Adenosina 5'-trifosfato hidrato de sal disódica (ATP)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Proteína de unión a biotina (sondas moleculares)Thermo Fischer ScientificA2666
Sonicador de baño: Limpiador Branson 2800 Branson CPX2800H
Beckman Coulter Tubos de pared gruesa de policarbonato, 11 x 34 mmBeckman-Coulter 
Tubos de pared gruesa de policarbonato Beckman Coulter, 8 x 34 mmBeckman-Coulter 
Biotina-PEG-SVA, MW 5.000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma Aldrich2905
CatalaseSigma AldrichC40
Corning LSE Mini Microcentrífuga, AC100-240VCorning6670
Toallitas para tareas delicadasKimtech34120
Ditiothreitol (DTT)GoldBioDTT10
Filtro de emisiónChromaET610/75m
Etanol (200 grados)Decon Labs2705
Ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA)Sigma Aldrich3777
Glucosa oxidasaSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Guanosina 5'-trifosfato hidrato de sal sódica (GTP)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III detergente Sigma AldrichZ805939
Aceite de inmersión, tipo AFisher Scientific77010
Kappa-caseínaSigma AldrichC0406
LanolinaFisher ScientificS25376
Pañuelo de limpieza de lentesThorLabsMC-5
Cloruro de magnesio (MgCl2)Sigma AldrichM9272
MetilcelulosaSigma AldrichM0512
Microfuge 16 Centrífuga de sobremesaBeckman-Coulter A46474
Portaobjetos de Microscopio, Cristal Blanco Diamante, 25 x 75mm, 90° Bordes de tierra, BLANCO Esmerilado GlobeScientific1380-50W
mPEG-Succinimidyl Valerato, MW 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Ultracentrífuga de sobremesa Max-XPBeckman-Coulter 
ParafinaFisher ScientificP31-500
PELCO Reverso (cierre automático), Pinzas finasTed Pella5377-NM
Vaselina, WhiteFisher Scientific18-605-050
Limpiador de plasma, 115VHarrick PlasmaPDC-001
Hidróxido de potasio (KOH)Sigma Aldrich221473
Bicarbonato de sodioSigma AldrichS6014
SacarosaSigma AldrichS7903
Thermal-Lok Baño de calor seco de 1 posiciónUSA Scientific2510-1101
Bloque Thermal-Lok para tubos de 1,5 y 2,0 mLUSA Scientific2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce&comercio; Rompebonos y comercio; Solución TCEP, pH neutro; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Objetivo de aceiteNikonCFI Apochromat TIRF 100XC Microscopio de aceite
TIRFNikonEclipse Ti
TLA 120.1 rotorBeckman-Coulter 
Rotor TLA 120.2Beckman-Coulter 
Proteína tubulina (>99% pura): cerebro porcinoCitoesqueletoT240
Proteína de tubulina (biotina): cerebro porcinoCitoesqueletoT333P
de tubulina (fluorescente HiLyte 647): cerebro porcinoCitoesqueletoTL670M Proteína
tubulina (X-rodamina): cerebro bovinoCitoesqueletoTL620M
VECTABOND® reactivo, sección de tejido vector de adhesiónBiolabsSP-1800-7
VWR® Incubadora personal, 120 V, 50/60 Hz, 0,6 AVWR97025-630
343778343776393315362224357656 Proteína de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

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TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

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