El presente protocolo describe las pautas paso a paso para las técnicas de operación de ARNi en P. americana.
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Artículo de método
Aplicaciones de la interferencia de ARN en cucarachas americanas
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Resumen
Resumen
Las cucarachas, una plaga sanitaria, son especies esenciales en el desarrollo de insectos y estudios metamórficos debido a su fácil alimentación y características hemimetábolas. Junto con secuencias genómicas bien anotadas, estas ventajas han hecho de la cucaracha americana, Periplaneta americana, un importante modelo de insecto hemimetábolo. Limitado por la escasez de estrategia de knockout, el knockdown de genes efectivo basado en la interferencia de ARN (RNAi) se convierte en una técnica indispensable en la investigación de genes funcionales de P. americana. El presente protocolo describe las técnicas de operación de ARNi en P. americana. El protocolo incluye (1) la selección de la P. americana en las etapas de desarrollo adecuadas, (2) la preparación para el ajuste de la inyección, (3) la inyección de dsRNA y (4) la detección de la eficiencia de derribo de genes. El ARNi es una poderosa herramienta genética inversa en P. americana. La mayoría de los tejidos de P. americana son sensibles al dsRNA extracelular. Su simplicidad permite a los investigadores obtener rápidamente fenotipos disfuncionales bajo una o múltiples inyecciones de dsRNA dirigidas, lo que permite a los investigadores utilizar mejor la P. americana para estudios de desarrollo y metamórficos.
Introducción
La interferencia de ARN (RNAi), un mecanismo conservado evolutivamente, se convierte gradualmente en una herramienta genética inversa esencial para inhibir la expresión génica en muchos organismos1, ya que Andrew Fire y Craig Mello2 desarrollaron la estrategia de silencio genético mediado por ARN de doble cadena (dsRNA). El dsRNA se escinde en fragmentos de 21-23 nucleótidos, pequeños ARN interferentes (siRNAs), por la enzima Dicer en las células para activar la vía del ARNi. Luego, los siRNAs se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que se acopla al ARNm objetivo, causa la escisión del ARNm y finalmente resulta en la pérdida de la funcióndel gen 3,4,5. Entre las especies de insectos, hasta ahora se han reportado muchos experimentos sistémicos de ARNi en muchos órdenes de insectos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera y Blattodea 5,6,7,8.
Las cucarachas (Blattaria) son una familia de insectos esenciales en estudios de desarrollo y metamórficos con sus ciclos de crecimiento rápido, fuerte adaptabilidad al medio ambiente y alta plasticidad de desarrollo9. Antes de descubrir que el ARNi era compatible con las cucarachas, las investigaciones anteriores solo se centraron en la prevención y el control de las cucarachas debido a la escasez de técnicas de manipulación genética en las cucarachas. La estructura única de la cucaracha ootheca hizo que fuera un desafío realizar la eliminación de genes basada en inyección de embriones con el sistema CRISPR-Cas9. Además, la mayoría de los tejidos de las cucarachas (como P. americana) muestran una respuesta arNi sistémica robusta, lo que permite la rápida generación de fenotipos disfuncionales mediante la inyección de uno o más dsRNAsdirigidos 9,10,11. Estas características hicieron del ARNi una técnica indispensable en la investigación funcional génica en P. americana.
A pesar de que se ha informado del uso de ARNi en la investigación de genes funcionales en P. americana , no se disponía de una descripción detallada o paso a paso. Este informe proporciona una guía operativa paso a paso para el ARNi en P. americana, útil para el estudio de la función génica en otras cucarachas. Además, esta guía no se limita a Blattodea y se puede aplicar a muchos otros insectos con modificaciones menores.
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Protocolo
La línea de P. americana fue proporcionada inicialmente por el Dr. Huiling Hao. Esta especie se ha mantenido con endogamia durante 30 años9.
1. Eclosión y alimentación de P. americana
- Recolecte ootecas frescas (inmediatamente después de la puesta de huevos) de P. americana e incube en la incubadora oscura a 25 ° C y 60% de humedad durante ~ 25 días. Luego aumente la temperatura y la humedad a 30 ° C y 75% 3 días antes de la eclosión.
- Use un tamiz con una apertura de 4 mm para separar las ninfas eclosionadas de las ootecas.
- Mantenga las ninfas en recipientes cilíndricos (12 cm de diámetro y 10 cm de altura) en la oscuridad a 28 ° C, 70% de humedad. Cepille el borde interior de los recipientes con vaselina para evitar que las cucarachas se escapen. Proporcione comida para ratas, agua y refugio (bandejas de huevos). Preste atención a la actividad de las ninfas y limpie regularmente las heces y los escombros.
2. Selección de las ninfas en el instar adecuado
- Use un tubo de vidrio para elegir la P. americana recién muda (color blanco en el cuerpo). Manténgalos en recipientes nuevos y espere la etapa correcta para el tratamiento.
NOTA: Después de ~ 19 días bajo las condiciones de alimentación anteriores, las ninfas en el3er instars estarán disponibles para inyección. El color de las cucarachas recién mudadas es blanco, y las estrellas se aclaran mediante tiempos de muda.
3. Preparación del fragmento objetivo con los promotores T7
- Utilizando el ADNc de P. americana como plantilla, diseñó cebadores pareados para realizar PCR para obtener un fragmento de ADN de 300-800 pb del gen diana9. A continuación, clone el fragmento de PCR en un vector pTOPO (ver Tabla de Materiales) para su secuenciación.
- Utilizando el fragmento diana de ADN como plantilla, sintetizar un nuevo par de cebadores con secuencia promotora T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') en los terminales 5' y realizar otra ronda de PCR para obtener el fragmento diana con promotores T7 en cada lado9.
4. Transcripción y síntesis de dsRNA in vitro
- Añadir 10 μL de T7 2X Buffer, 2 μL de Enzyme Mix, T7 Express (ver Tabla de Materiales) y 2 μg de producto de PCR (obtenido en el paso 3.2) en el sistema de reacción y sumar el volumen total a 20 μL con ddH2O. Mezclar suavemente boca abajo manualmente e incubar a 37 °C durante 30 min y 70 °C durante 10 min, y luego enfriar lentamente a temperatura ambiente.
- Solución diluida de RNasa A (4 μg/μL) con ddH2O en una proporción de 1:200. A continuación, agregue 1 μL de DNasa libre de RQ1 RNasa (1 U/μL) y 1 μL de solución diluida de RNasa A al sistema (consulte la Tabla de Materiales).
NOTA: Ahora, el volumen de un solo sistema es de 22 μL. - Incubar a 37 °C durante 30 min. Luego agregue el 10% del volumen total (al realizar reacciones N simultáneamente, el volumen total es N x 22 μL) de acetato de sodio y tres volúmenes del volumen total de isopropanol.
- Mezclar suavemente boca abajo manualmente, colocar sobre hielo durante 5 min y centrifugar a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante con una pipeta, lave el residuo con etanol al 75% (con agua tratada con 25% de pirocarbonato dietílico (DEPC)) y luego centrífique a 13.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante de nuevo. Seque el pellet al aire durante 15 minutos a temperatura ambiente. Use ~ 100 μL de agua DEPC para disolver dsRNA, luego diluya el dsRNA a los 2 μg / μL finales.
NOTA: El dsRNA podría almacenarse a -80 °C durante 6 meses.
5. Carga de la solución de dsRNA en la jeringa
- Configure el programa en la bomba de microinyección (consulte la Tabla de materiales) con anticipación para garantizar que el volumen de cada inyección sea consistente. Antes de usar la jeringa, limpie la jeringa llenándola con agua DEPC 8-10 veces.
- Instale la jeringa de 10 μL en la bomba de microinyección, encienda la bomba y llene la jeringa con 10 μL de solución de dsRNA (preparada en el paso 4.6). Inyecte 1 μL del dsRNA en una3ª ninfa instar (consulte el paso 2) y asegúrese de que no se filtre al cuerpo.
6. Inyección de dsRNA a P. americana
- Anestesiar las cucarachas con una mayor concentración de CO2 en un recipiente hasta que las cucarachas ya no se muevan, y luego proceder inmediatamente con la inyección.
- Levante suavemente la cucaracha con pinzas y entregue la cucaracha hacia la aguja con la mano. A continuación, inserte la aguja a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis. Acerca de la profundidad de inserción, cuanto menos profundo, mejor.
- Luego, inyecte la solución de dsRNA en la cucaracha. Finalmente, saque la punta de la aguja. Asegúrese de que la punta de la aguja esté lo más cerca posible de la epidermis para evitar dañar los órganos internos.
NOTA: La inyección debe hacerse bajo un microscopio de disección. - Coloque las cucarachas inyectadas en recipientes limpios de bioensayo. Espere unos 10-20 minutos para que se recuperen de los efectos del CO2 . Etiquete los envases con la fecha de inyección, el tipo y la dosis de dsRNA, y la edad de la P. americana.
- Coloque las cucarachas inyectadas en un ambiente oscuro a 28 ° C, 70% de humedad, proporcione agua, alimento y refugio, y observe posibles cambios en el fenotipo de las cucarachas regularmente.
7. Confirmación de derribo y análisis fenotípico
- Evalúe la eficiencia del ARNi utilizando cualquier técnica de biología molecular disponible, como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y western blotting. Para conocer los procedimientos detallados de qRT-PCR y Western blotting, consulte las Referencias 1,12.
- Para observar y analizar fenotipos relacionados con el ARNi, utilice el microscopio adecuado para animales vivos.
NOTA: El ARNi puede afectar la morfología, el comportamiento, la muda, la regeneración de las extremidades y otras actividades fisiológicas de las cucarachas. La frecuencia específica del fenotipo se calcula de acuerdo con condiciones específicas.
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Resultados
La Figura 1 muestra una inyección exitosa. La jeringa de microinyección con una aguja de micro diámetro debe colocarse horizontalmente en el amplificador (Figura 1A). La aguja se inserta a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis (Figura 1B). Asegúrese de que el líquido entre en el abdomen de P. americana . El ángulo demasiado pronunciado de la aguja dañará los órganos in...
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Discusión
Este informe describió una estrategia metodológica de ARNi paso a paso en P. americana; Cabe destacar que también se puede aplicar a otras cucarachas (Blattella germanica, por ejemplo) y muchos otros insectos con cambios menores. Sin embargo, la eficiencia de silenciamiento génico del ARNi no siempre es lo suficientemente alta, con una desventaja obvia en comparación con la estrategia de eliminaciónde genes 13. El siguiente efecto residual a nivel de gen puede interferir con los ...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 y 31572325 a C.R., Sh.L.), por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 y 2020A1515011267 a C.R.), por el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 y 2019A0102006), por el Departamento de Ciencia y Tecnología en Guangzhou (Grant No. 202102020110), por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (Subvención No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 y micro; L Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Incubadora de inyección |
| Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | Para la incubación y alimentación de cucarachas | |
| Bomba de microinyección | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit Aidlab | Biotechnology | CV16 | para la clonación |
| de genes Sistemas de PCR cuantitativos en tiempo real | Bio-Rad | CFX Connect | Para el análisis qRT-PCR |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | Para la síntesis de dsRNA, que contiene una solución de rnasa A (4 μ g/μ L), acetato de sodio, 3,0 m (pH 5,2), mezcla de enzimas, T7 Express, agua sin nucleasas, tampón Express T7 2x, RQ1 Termocicladores térmicos de DNasa sin ARNasa |
| Bio-Rad | S1000 | para la amplificación de ADN |
Referencias
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163(2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778(2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
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