Research Article
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El presente protocolo describe el desarrollo de una caja de herramientas de tiempo de reacción en serie de 5 opciones de código abierto para modelos animales de roedores, utilizando Arduino y hardware relacionado y una caja de herramientas versátil de Matlab, que incluye un script opcional para el entrenamiento conductual automatizado. Los scripts son personalizables y facilitan la implementación de diferentes diseños de prueba y prueba.
La tarea de tiempo de reacción en serie de 5 opciones (5-CSRTT) es una prueba de comportamiento que se utiliza a menudo para estudiar la atención visoespacial y la impulsividad en roedores. La tarea requiere que los animales asignen atención a una matriz horizontal de cinco pequeñas aberturas equipadas con fuentes de luz y, dentro de una ventana de tiempo limitado, golpeen la nariz con una abertura de objetivo iluminada para obtener una recompensa de alimentos en la revista de alimentos ubicada en la pared opuesta de la cámara. La tarea considera medidas de control conductual como la precisión de la respuesta y los tiempos de reacción y permite inferir la atención selectiva y la impulsividad. La dificultad de la tarea se puede controlar modificando la duración del estímulo y el diseño de la tarea en general. Los aparatos disponibles comercialmente generalmente consisten en una cámara experimental y un software particular para especificar los parámetros de la tarea, pero debido al hardware y el software fijos, plantean muchas limitaciones en los cambios en el diseño experimental general y los requisitos específicos de la tarea y la salida de datos relacionada. Este artículo explica una alternativa totalmente personalizable basada en un microcontrolador de placa única fácil de usar y componentes electrotécnicos estándar, un script Arduino de acceso abierto y una caja de herramientas matlab para el control de hardware y las especificaciones de tareas de comportamiento, respectivamente. La caja de herramientas incluye un procedimiento de escalera opcional, lo que permite el entrenamiento conductual automatizado. La configuración completa del hardware, que se puede instalar en cámaras personalizadas, y el software de libre adaptación fomentan el diseño no estandarizado de tareas y cámaras. Se describe el diseño del sistema y el código de código abierto para el control de hardware y la configuración experimental.
El 5-CSRTT es una prueba de comportamiento, a menudo utilizada en roedores para estudiar los procesos atencionales visuales y la impulsividad 1,2,3,4,5,6, como determinar el papel del sistema colinérgico en la atención y la influencia de los inhibidores de la recaptación de norepinefrina en los comportamientos impulsivos 7 . El aparato estándar permite observar diversas medidas de control como la precisión de la respuesta, los tiempos de reacción, el comportamiento impulsivo y compulsivo, la capacidad motora y la motivación 1,2,3,4,5. Consiste en una matriz horizontal de cinco aberturas equipadas con LED, un cargador de alimentos en las paredes de la cámara que se oponen a las aberturas y luces de la casa 2,5. En una tarea típica, la luz de la casa se ilumina, y el comienzo de una sesión está marcado por la iluminación de la revista de alimentos, donde se entrega un pellet gratis. El curso de prueba se inicia cuando el animal asoma la nariz del cargador para recuperar el pellet1. Después de eso, la luz del cargador de alimentos se apaga y comienza el intervalo entre pruebas (ITI), durante el cual se supone que el animal debe dirigir su atención hacia las aberturas. Una vez transcurrido el ITI, se presenta una iluminación de estímulo en una de las aberturas 1,2,5. El estímulo se da para una longitud específica conocida como la duración del estímulo (StD). El animal puede responder al estímulo mientras se presenta o durante una ventana de tiempo limitada después de que termine la ETS, conocida como retención limitada (LH). Para responder, el animal tiene que perforar la apertura del objetivo y, si se hace correctamente, se libera una recompensa en la revista de alimentos 1,2,5. De lo contrario, cualquier respuesta incorrecta, así como cualquier respuesta antes de la presentación del estímulo (anticipatoria o prematura) o cualquier falta de respuesta (omisión) da como resultado un tiempo de espera (TO), durante el cual la luz de la casa se apaga durante un cierto período 1,2,5 (Figura 1). En general, la precisión del estímulo discriminativo mide el funcionamiento atencional, mientras que las respuestas prematuras y perseverantes (respuestas repetidas en las aberturas después de la presentación del estímulo) se consideran medidas de comportamiento impulsivo y compulsividad, respectivamente 1,4,5,6.
Figura 1: Posibles secuencias de ensayo de un 5-CSRTT típico. Después del intervalo intertrial, la luz de estímulo se enciende durante un período específico y, a continuación, se apaga durante el intervalo de retención limitada. La rata puede responder correctamente y recibir una recompensa o responder incorrectamente y obtener un tiempo de espera durante este tiempo. Si la rata no responde a tiempo, su omisión resulta en un tiempo de espera. Del mismo modo, si responde antes de la presentación del estímulo de luz, su respuesta prematura resulta en un tiempo de espera. Otra prueba comienza después de la recolección de la recompensa o el final del período de tiempo de espera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El 5-CSRTT es ampliamente utilizado debido a su flexibilidad: al cambiar los parámetros del diseño del ensayo, se pueden investigar diferentes subcategorías de atención. Por ejemplo, mientras que se supone que el animal divide su atención a través de las cinco aberturas diferentes (atención visuoespacial), el uso de estímulos irrelevantes (por ejemplo, estímulos auditivos) permite probar la atención selectiva o sostenida 1,2,5,6. Para ello, la configuración experimental se puede ampliar incluyendo altavoces, que pueden utilizarse como estímulos distractores o incluso de refuerzo 1,2,5,6. Además, la carga atencional se puede modular directamente alterando la presentación del estímulo o aleatorizando la duración itI10. El 5-CSRTT no solo se utiliza en roedores 3,7, sino que recientemente se ha adaptado para probar primates no humanos 1,7,8 y peces 7,9, mostrando aún más su viabilidad. Una caja de herramientas 5-CSRTT totalmente personalizable permite una fácil adaptación del paradigma estándar de roedores a otros modelos animales. Además, la flexibilidad de personalización de la caja de herramientas 5-CSRTT también fomenta la investigación utilizando diseños de tareas no estándar.
La caja de herramientas 5-CSRTT totalmente personalizable que se presenta aquí contiene un script Arduino para el control de hardware, programado en un entorno de desarrollo integrado. También consta de una caja de herramientas de Matlab (versión R2019b o inferior) para el control de experimentos. El siguiente protocolo explica cómo configurar la caja de herramientas 5-CSRTT con el paradigma estándar ampliamente utilizado y muestra configuraciones opcionales para paradigmas no estándar.
El procedimiento experimental en este protocolo se realizó siguiendo las recomendaciones de la directiva de la UE 2010/63 para el Bienestar de los Animales de Experimentación y de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal emitida por el Gobierno Federal de Alemania y fue aprobada por las autoridades locales. Dado que la investigación solo requirió entrenamiento conductual, no se sacrificó a ningún animal y todos se mantuvieron en la cría después de que se realizó la investigación. La investigación se realizó utilizando diez ratas encapuchadas Lister macho (4 meses de edad al comienzo del entrenamiento conductual).
1. Alojamiento, cría y manipulación de animales
2. Preparación del hardware y software de control
3. Preparación del software de control de experimentos
4. Configuración de los parámetros utilizados en la caja de herramientas 5-CSRTT
5. Experimento conductual
Figura 2: El aparato 5-CSRTT utilizado para el presente estudio. El aparato se ejecuta en una computadora portátil equipada con la caja de herramientas 5-CSRTT, que proporciona un script para controlar el microcontrolador y todos los equipos relacionados y múltiples scripts para controlar el experimento 5-CSRTT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La caja de herramientas totalmente personalizable es fácil de usar y se basa en un microcontrolador de placa única y componentes electrotécnicos estándar. La Figura 3 muestra un diagrama simplificado de circuito y cableado. Toda la apertura consta de 5 LEDs como estímulos de luz y cinco sensores infrarrojos para detectar pinchazos en la nariz. La luz de la casa consiste en una tira con ocho LED, y el cargador de alimentos está hecho de una abertura con una puerta de solapa con un micro interruptor, un dispensador de pellets accionado por motor y una tira con ocho LED para la iluminación. El circuito también ejemplifica las conexiones para componentes opcionales, como el altavoz de timbre pasivo para la retroalimentación auditiva y un potenciómetro digital para el ajuste de volumen. Para obtener una lista de los equipos utilizados en el desarrollo de esta caja de herramientas, consulte la Tabla de materiales.
Figura 3: Circuito simplificado del hardware del microcontrolador. Para ser fácil y rápidamente personalizable, el equipo del microcontrolador se conecta a través de una placa de pruebas. De arriba a la izquierda a abajo a la izquierda, en el sentido de las agujas del reloj: una placa de microcontrolador está conectada a un escudo del motor y un motor de CC (que representa el motor del dispensador de pellets). A la derecha están las tiras de LED para las luces de la casa y del cargador de alimentos, y en el medio están los cinco LED blancos para la luz de estímulo y los cinco pares de sensores infrarrojos utilizados en las aberturas. Debajo de la placa del microcontrolador hay un microinterruptor simple (que representa el interruptor utilizado en la puerta de la solapa del cargador de alimentos). Finalmente, un altavoz de timbre pasivo y un potenciómetro digital se representan en el medio. Esta imagen fue realizada utilizando el software de código abierto Fritzing. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Vinculación y funciones de todos los componentes de los scripts de control del experimento y diagrama simplificado de la función "Código". (A) El script "Usuario" envía sus parámetros a la función "Código", que a su vez se vincula directamente a la función "Escalera", lo que le permite actualizar cualquier parámetro utilizado en la función "Código" mientras el experimento está en curso. La función "Código" envía sus resultados a la función "DataProc" al final de la sesión. (B) Antes de iniciar una sesión de experimento, la función "Código" primero verifica si se supone que debe iniciar el protocolo de habituación. De lo contrario, configura los parámetros en función de las definiciones elegidas en el script "Usuario". Antes de que comience cada prueba, la función comprueba si se ha pulsado la tecla ESC del teclado. Si no, continúa con un nuevo juicio. De lo contrario, detiene la sesión del experimento y pasa los datos recopilados a la función DataProc. Esta comprobación crítica antes de que comience cada prueba permite que el programa se detenga antes de que se alcance el límite de tiempo elegido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las interacciones entre los diferentes scripts de control de experimentos se pueden ver en la Figura 4A. El script "Usuario" incluye todos los parámetros que definen el experimento. Allí, las variables que determinan el tiempo del experimento, el número y el brillo de los estímulos iluminados, la duración de ITI y similares se pueden elegir libremente. La función Código (Archivo Suplementario 5) incluye una descripción detallada de un solo ensayo y todos los resultados posibles, que se reitera a lo largo del experimento, como se muestra en la Figura 4B. Además, consiste en un protocolo para la habituación del animal al aparato. La función Código también verifica regularmente el rendimiento del animal. Además, la función Escalera es opcional. El rendimiento del sujeto se compara con los criterios establecidos anteriormente, y los parámetros deseados se actualizan automáticamente si el rendimiento del animal cumple con estos criterios. La función Escalera también puede considerar los resultados adquiridos de la sesión del día anterior. Mientras se ejecuta el experimento, una comprobación del rendimiento al final de un ensayo calculará la precisión, las omisiones y el número total de respuestas correctas de los ensayos completados y comparará el resultado con los criterios deseados para una actualización de nivel, como se especifica en la función Escalera. Finalmente, la función DataProc procesa todos los datos recopilados y genera gráficos simples para un análisis rápido. Al final de una sesión, la caja de herramientas guarda automáticamente todos los datos en un archivo *.mat y genera un archivo *.xlsx adicional con la información esencial del experimento.
Figura 5: Ejemplo de diferentes configuraciones de estímulo de la caja de herramientas 5-CSRTT. El diagrama ejemplifica posibles combinaciones de estímulos objetivo en función de la configuración elegida. Tanto las configuraciones "todas" como "únicas" se utilizan en el paradigma estándar (para el experimento de habituación y comportamiento). Las configuraciones "vecinas" y "desplazadas" muestran configuraciones de estímulo no estándar, lo que permite el uso de otros números de estímulos iluminados, que también pueden tener un contraste diferente al estímulo objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El paso de protocolo 4.2.7.7 menciona una característica opcional: cambiar la agrupación de las aperturas objetivo. El paradigma estándar 5-CSRTT hace uso de un solo estímulo objetivo. Aquí, ejemplificamos cómo la caja de herramientas presentada permite modificaciones del paradigma estándar. La Figura 5 muestra algunas posibles combinaciones de grupos de un total de cinco aperturas relacionadas con la configuración elegida. La configuración "todos" ilumina todas las aperturas disponibles para que cada apertura sea ahora una apertura objetivo, lo que puede ser útil en las etapas iniciales de entrenamiento. La configuración de vecino se asegura de que el número (libremente elegido) de aperturas objetivo sea vecino entre sí. Los ajustes se pueden especificar de tal manera que los vecinos no sean idénticos a la apertura objetivo, sino que se iluminen con un contraste más bajo (o incluso más alto). El uso de aperturas con diferentes contrastes de iluminación permite probar nuevos paradigmas, como el uso de recompensas de diferentes grados para los golpes de nariz en las aperturas de alto o bajo contraste. La Figura 5 muestra un ejemplo con tres aperturas objetivo con iluminación idéntica. La configuración única se utiliza normalmente en el estándar 5-CSRTT, donde solo se ilumina un único objetivo. Finalmente, la configuración desplazada extiende la configuración vecina. Desplaza el estímulo vecino hacia la última o primera apertura en caso de que la apertura objetivo esté en la primera o última posición, respectivamente. Al igual que en la configuración del vecino, la fuerza de iluminación de los vecinos se puede elegir libremente, siendo la misma o diferente de la apertura objetivo. Además, el número de estímulos iluminados generales se puede elegir libremente. A continuación, la caja de herramientas calcula todos los estímulos posibles automáticamente. Sin embargo, el parámetro "Config.LED.NumHighLED" debe establecerse en "1" para esta configuración.
Siguiendo el protocolo, el entrenamiento de ratas (N = 10) para el 5-CSRTT se realizó de acuerdo con las etapas de entrenamiento presentadas en la Tabla 1.
Tabla 1: 5-CsrTT programa de capacitación y criterios para pasar al siguiente nivel. (A) El intervalo entre ensayos se mantuvo constante a 5 s en cada nivel de entrenamiento. (B) Duración del estímulo para cada nivel de entrenamiento. (C) Ventana de tiempo de retención limitada (LH), el tiempo máximo tolerado entre el estímulo apagado y cualquier respuesta de golpe en la nariz. D) El número total de respuestas correctas necesarias para superar el nivel de capacitación respectivo. (E) El porcentaje de precisión se calcula como 
. (F) El porcentaje de errores de omisión se define como 
. Este criterio no incluye las respuestas prematuras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
El rendimiento de las ratas se comparó con el número de días de entrenamiento (sesiones) necesarios para completar cada nivel de entrenamiento dado en la Tabla 1. Todos los animales comenzaron en el nivel de entrenamiento 1 con una StD y LH de 60 s cada uno. Sin embargo, algunas ratas (N = 5) recibieron un entrenamiento de habituación mejorado para probar algunas de las opciones de estímulo adicionales informadas anteriormente, lo que explica la diferencia en el número de sesiones que los animales individuales permanecieron en el nivel de entrenamiento 1. La finalización del nivel se caracterizó por alcanzar un total de 30 o más respuestas correctas. StD y LH disminuyeron durante los siguientes niveles, mientras que los criterios para avanzar al siguiente nivel de entrenamiento se hicieron más difíciles, aumentando la demanda atencional de la tarea 1,6.
La Tabla 2 muestra la hoja de cálculo *.xlsx generada automáticamente de una rata de ejemplo durante una sesión. La rata comenzó con la configuración especificada en el nivel de entrenamiento 5. Después de cuatro ensayos, la rata avanzó al nivel 6, considerando los ensayos realizados en la sesión actual más la precisión lograda en la sesión anterior. La cantidad de ensayos que deben realizarse como mínimo en la sesión actual para avanzar al siguiente nivel de entrenamiento se especifica en la variable "Config.Experiment.MinNumTrials". En la misma sesión, la rata avanzó al nivel de entrenamiento 7 después de completar 66 ensayos en el nivel 6 y lograr el requisito de > 80% de precisión y < 20% de omisión. En total, las ratas fueron entrenadas durante 26 días utilizando la configuración de los niveles de entrenamiento como se proporciona en la Tabla 1. El número de sesiones dedicadas por nivel de capacitación se proporciona en la Figura 6A. La línea negra muestra el promedio en todos los sujetos, y cada línea de color muestra los datos de una rata. Todas las ratas alcanzaron el octavo nivel en 14-22 sesiones (Figura 6B). La Figura 6C muestra el rendimiento medio de los sujetos por nivel de entrenamiento y en todos los días de entrenamiento en el aparato 5-CSRTT. La línea negra discontinua representa el porcentaje de precisión y la línea negra recta representa el porcentaje de omisión. La precisión se calculó como la relación entre el número de respuestas correctas y el número total de respuestas. Las omisiones se calcularon como la relación entre el número de omisiones y el número total de ensayos (es decir, la suma de respuestas correctas, respuestas incorrectas y omisiones). La línea gris indica el número total promedio de respuestas correctas en todos los ensayos de cada nivel. La Figura 6D muestra la precisión final alcanzada por cada sujeto en el octavo y último nivel de entrenamiento.
En promedio, las ratas pasaron 5.9 (±1.03 SESIONES SEM) para completar el nivel 1, entre 1.5 (±0.17) y 3.5 (±0.5) sesiones para completar el nivel 2 a 6, y 1.7 (±0.16) sesiones para completar el nivel 7 antes de alcanzar el nivel final 8. Como se desprende de la Figura 6A, la varianza entre sujetos fue más significativa en los niveles iniciales (DE = 3,25 en el nivel 1, 1,58 en el nivel 2) y disminuyó en los niveles posteriores (0,47 y 0,48 en los niveles 6 y 7, respectivamente). En el nivel 4, cuando la duración del estímulo se redujo aún más, el número promedio de sesiones dedicadas (2,6 ± 0,52) y la varianza entre ratas (1,64) aumentaron, con dos ratas que tardaron 5 y 6 días en concluir el nivel.
Figura 6: Resultados del experimento conductual con la caja de herramientas 5-CSRTT. (A) El número de sesiones realizadas en cada nivel de entrenamiento. La línea negra representa el número promedio de sesiones de todas las asignaturas para cada nivel (media ± SEM), y las líneas de color representan los datos de los sujetos individuales. B) El número absoluto de sesiones necesarias para alcanzar el nivel final, por asignatura. (C) Mediciones de desempeño promediadas a lo largo de la capacitación (media ± SEM). La línea negra punteada representa la precisión de todos los sujetos en todas las respuestas dadas en todas las sesiones por nivel de entrenamiento, y la línea negra muestra el porcentaje de omisión correspondiente. La línea gris representa el número absoluto promedio de respuestas correctas de todos los sujetos en cada nivel de entrenamiento. (D) Precisión por asignatura durante el octavo y último nivel de entrenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 2: Datos recopilados de una rata de ejemplo durante una sesión de entrenamiento. La columna A muestra el recuento de pruebas durante la sesión con respecto al nivel de entrenamiento actual, como se muestra en la columna B. La columna C muestra la duración de ITI y la columna D muestra la hora de inicio de la prueba. Las columnas E a I muestran el nivel de brillo para el estímulo LED en aperturas 1 a 5, respectivamente. Un nivel de brillo de 0 significa que el estímulo estaba desactivado, y un nivel de brillo de 0.2 significa que el estímulo se encendió con el 20% de su intensidad máxima. Las columnas J y K muestran la hora exacta en que se encendió y apagó el estímulo, respectivamente. La columna L muestra el resultado del ensayo: 0 significa "omisión", 1 significa "respuesta correcta", 3 significa "respuesta incorrecta" (nariz clavada en la abertura no objetivo) y 4 significa "prematuro". La columna M muestra qué apertura se pinchó en la nariz durante el ensayo, mientras que la columna N representa el momento exacto del golpe en la nariz. Las columnas O, P y Q muestran el momento en que se encendió el motor dispensador de pellets, el número de motor correspondiente y el momento en que la rata abrió el dispensador de pellets para obtener su recompensa, respectivamente. La columna R muestra la hora de finalización de la prueba. Las columnas S, T, U, V y W muestran el número total de respuestas prematuras, los tiempos de espera, las pulsaciones de panel durante una ITI, el número total de respuestas perseverantes y el tiempo de ejecución total de la sesión en minutos, respectivamente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Archivo complementario 1: Script para el control de hardware del software IDE (código Arduino). Esto incluye todos los comandos para controlar el hardware y los componentes electrotécnicos de la caja de herramientas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: Script para la función "Usuario" en el software de control de experimentos. Esto incluye todos los parámetros que definen el experimento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 3: Script para la función "Escalera" en el software de control de experimentos. Esto monitorea el desempeño del sujeto y lo compara con los criterios establecidos anteriormente. Los parámetros deseados se actualizan automáticamente si el rendimiento del animal cumple con estos criterios. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 4: Script para la función "DataProc" en el software de control de experimentos. Esto procesa todos los datos recopilados y genera gráficos simples para un análisis rápido. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 5: Script para la función "Código". Esto incluye una descripción detallada de un solo ensayo y todos los resultados posibles, que se reitera a lo largo del experimento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
El presente protocolo describe el desarrollo de una caja de herramientas de tiempo de reacción en serie de 5 opciones de código abierto para modelos animales de roedores, utilizando Arduino y hardware relacionado y una caja de herramientas versátil de Matlab, que incluye un script opcional para el entrenamiento conductual automatizado. Los scripts son personalizables y facilitan la implementación de diferentes diseños de prueba y prueba.
Este trabajo está respaldado por DFG WE 5469/3-1.
| de | 1200 ohmios | Ya disponible en el laboratorio | |
| Potenciómetro digital de 8 bits 10 kΩ | Microchip | MCP42010-I/P | A partir de Conrad.de: 1083205 |
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| CABEZAL APILABLE ARDUINO | PARA MOTOR SHD - R3Sparkfun Electronics | PRT-11417 | De Antratek.de: PRT-11417 |
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| Euro-Gehä utilizar | Hammond Electronics | 1591EBK | De Conrad.de: 520691 |
| Pellets de comida | Bio-Serv | F0021 | De Bio-serv.com: Pellets de precisión sin polvo Laboratorio de diseño de |
| de roedores Fritzing | Potsdam | Fritzing Descarga de software | |
| Entorno de desarrollo integrado | Arduino | Descarga de Arduino IDE (Disponible gratuitamente)Sensor de | |
| haz de rotura IR - LEDs de 3mm | Adafruit | 2167 | De Mouser.de: 485-2167 |
| LED | |||
| blanco blanco redondo 5mm 2000mcd 20mA | TruComponents | 1573731 | De Conrad.de: Microinterruptor |
| 1573731 Hartmann | MBB1 01 A 01 C 09 A | Desde Conrad.com: 707243 | |
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