Method Article

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

DOI:

10.3791/63387

⸱

January 31st, 2022

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento crio-EM, es decir, cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3, para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos de una sola partícula para la determinación de estructuras de alta resolución.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los avances recientes tanto en instrumentación como en software de procesamiento de imágenes han hecho que la microscopía crioelectrónica de una sola partícula (cryo-EM) sea el método preferido por los biólogos estructurales para determinar estructuras de alta resolución de una amplia variedad de macromoléculas. Múltiples suites de software están disponibles para usuarios nuevos y expertos para el procesamiento de imágenes y el cálculo de estructuras, que agilizan el mismo flujo de trabajo básico: las películas adquiridas por los detectores de microscopio se someten a corrección para la estimación de la función de transferencia de contraste y movimiento inducida por haz (CTF). A continuación, las imágenes de partículas se seleccionan y extraen de fotogramas de película promediados para la clasificación iterativa 2D y 3D, seguida de la reconstrucción, el refinamiento y la validación en 3D. Debido a que varios paquetes de software emplean diferentes algoritmos y requieren diferentes niveles de experiencia para operar, los mapas 3D que generan a menudo difieren en calidad y resolución. Por lo tanto, los usuarios transfieren datos regularmente entre una variedad de programas para obtener resultados óptimos. Este documento proporciona una guía para que los usuarios naveguen por un flujo de trabajo a través de los paquetes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3 para obtener una estructura de resolución casi atómica del virus adenoasociado (AAV). Primero detallamos una canalización de procesamiento de imágenes con cryoSPARC v3, ya que sus algoritmos eficientes y su GUI fácil de usar permiten a los usuarios llegar rápidamente a un mapa 3D. En el siguiente paso, utilizamos PyEM y scripts internos para convertir y transferir coordenadas de partículas de la reconstrucción 3D de mejor calidad obtenida en cryoSPARC v3 a RELION-3 y Scipion 3 y recalcular mapas 3D. Finalmente, describimos los pasos para un mayor refinamiento y validación de las estructuras resultantes mediante la integración de algoritmos de RELION-3 y Scipion 3. En este artículo, describimos cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos para la determinación de estructuras de alta resolución.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) y el análisis de partículas individuales (SPA) permiten la determinación de la estructura de una amplia variedad de conjuntos biomoleculares en su estado hidratado, ayudando a iluminar el papel de estas macromoléculas en detalle atómico. Las mejoras en la óptica del microscopio, el hardware informático y el software de procesamiento de imágenes han permitido determinar estructuras de biomoléculas a una resolución que supera los 2 Å1,2,3. Más de 2.300 estructuras crio-EM se depositaron en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) en 2020, en comparación con 192 estructuras en 20144, lo que indica que la crio-EM se ha convertido en el método de elección para muchos biólogos estructurales. Aquí, describimos un flujo de trabajo que combina tres programas SPA diferentes para la determinación de estructuras de alta resolución (Figura 1).

El objetivo de SPA es reconstruir volúmenes 3D de un espécimen objetivo a partir de imágenes 2D ruidosas grabadas por un detector de microscopio. Los detectores recopilan imágenes como películas con fotogramas individuales del mismo campo de visión. Para preservar la muestra, los fotogramas se recogen con una dosis baja de electrones y, por lo tanto, tienen una mala relación señal-ruido (SNR). Además, la exposición a electrones puede inducir movimiento dentro de las rejillas crio-EM vitrificadas, lo que resulta en el desenfoque de la imagen. Para superar estos problemas, los fotogramas se alinean para corregir el movimiento inducido por el haz y se promedian para producir una micrografía con un SNR aumentado. Estas micrografías luego se someten a una estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) para tener en cuenta los efectos del desenfoque y las aberraciones impuestas por el microscopio. A partir de las micrografías corregidas por CTF, las partículas individuales se seleccionan, extraen y clasifican en promedios de clase 2D que representan diferentes orientaciones adoptadas por la muestra en hielo vítreo. El conjunto homogéneo resultante de partículas se utiliza como entrada para la reconstrucción 3D ab initio para generar un modelo o modelos gruesos, que luego se refinan iterativamente para producir una o más estructuras de alta resolución. Después de la reconstrucción, se realizan refinamientos estructurales para mejorar aún más la calidad y la resolución del mapa crio-EM. Finalmente, un modelo atómico se deriva directamente del mapa, o el mapa está equipado con coordenadas atómicas obtenidas en otro lugar.

Hay diferentes paquetes de software disponibles para realizar las tareas descritas anteriormente, incluidos Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 y otros. Si bien estos programas siguen pasos de procesamiento similares, emplean diferentes algoritmos, por ejemplo, para recoger partículas, generar modelos iniciales y refinar reconstrucciones. Además, estos programas requieren un nivel variable de conocimiento e intervención del usuario para operar, ya que algunos dependen del ajuste fino de los parámetros que pueden actuar como un obstáculo para los nuevos usuarios. Estas discrepancias a menudo resultan en mapas con calidad y resolución inconsistentes en todas las plataformas14, lo que lleva a muchos investigadores a usar múltiples paquetes de software para refinar y validar los resultados. En este artículo destacamos el uso de cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3 para obtener una reconstrucción 3D de alta resolución de AAV, un vector ampliamente utilizado para la terapia génica15. Los paquetes de software antes mencionados son gratuitos para los usuarios académicos; cryoSPARC v3 y Scipion 3 requieren licencias.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Creación de un nuevo proyecto cryoSPARC v3 e importación de datos

NOTA: Los datos se adquirieron en la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón (OHSU) en Portland utilizando un microscopio electrónico Titan Krios de 300 kV equipado con un detector de electrones directo Falcon 3. Las imágenes se recogieron en un modo de conteo con una dosis total de 28,38 e−/Å2 fraccionadas en 129 fotogramas, y un rango de desenfoque de -0,5 μm a -2,5 μm, a un tamaño de píxel de 1,045 Å utilizando EPU. La muestra de AAV-DJ fue proporcionada por el personal de OHSU.

  1. Abra cryoSPARC v3 en un navegador web y haga clic en el encabezado Proyectos . Seleccione + Agregar para crear un nuevo proyecto. Titule el proyecto en consecuencia y proporcione una ruta a un directorio existente donde se guardarán los trabajos y los datos.
  2. Cree un espacio de trabajo para el proyecto abriéndolo, haciendo clic en + Agregar y seleccionando Nuevo espacio de trabajo. Titule el espacio de trabajo y haga clic en Crear.
  3. Desplácese hasta el nuevo espacio de trabajo y abra job builder en el panel derecho. Esta pestaña muestra todas las funciones disponibles en cryoSPARC v3. Haga clic en Importar películas y proporcione la ruta de las películas, obtenga la ruta del archivo de referencia y establezca los parámetros de adquisición de la siguiente manera: Tamaño de píxel raw 1.045 Å, Voltaje de aceleración 300 kV, Aberración esférica 2.7 mm, Dosis de exposición total 28.38 e-/Å^2.
  4. Haga clic en Cola, seleccione un carril para ejecutar el trabajo y un espacio de trabajo, y haga clic en Crear.
    NOTA: Los parámetros de adquisición dependen de la muestra y del microscopio.

2. CryoSPARC v3 - alineación de películas y estimación de CTF

  1. Abra la corrección de movimiento del parche (Multi). Este trabajo requiere las películas importadas en el paso 1.3 como entrada. Abra la tarjeta de trabajo de importación de películas en el espacio de trabajo y arrastre la salida Imported_movies al marcador de posición de películas en el nuevo trabajo. Ponga en cola el trabajo.
    Nota : para obtener más información acerca de los métodos cryoSPARC descritos en este artículo, consulte el tutorial cryoSPARC16.
  2. Para realizar la estimación de CTF, abra Patch CTF Estimation (Multi). Introduzca las micrografías generadas en el paso 2.1 y ponga en cola el trabajo.
  3. Para inspeccionar las micrografías promediadas y corregidas por CTF y seleccionar un subconjunto para su posterior procesamiento, abra Curate Exposures e ingrese las exposiciones obtenidas en el paso 2.2. Ponga en cola el trabajo.
  4. Después de que el trabajo entre en modo de espera , haga clic en la pestaña Interacción en la tarjeta de trabajo, ajuste los umbrales de parámetros y acepte o rechace micrografías individuales para su posterior procesamiento. Acepte micrografías con CTF estimados y experimentales bien emparejados (Figura 2) y descarte aquellas con alto astigmatismo, mal ajuste de CTF y hielo grueso.
  5. Mientras procesa los datos actuales, establezca el umbral superior de astigmatismo en 400 Å, la resolución de ajuste CTF en 5 Å y el espesor relativo del hielo en 2. Haga clic en Listo para seleccionar las micrografías para el procesamiento posterior.

3. CryoSPARC v3 - selección de partículas manual y basada en plantillas

  1. Abra el Selector manual, introduzca las exposiciones aceptadas de los pasos 2.4-2.5 y ponga en cola el trabajo. Haga clic en la pestaña Interactivo , establezca el tamaño de la caja (px) en 300 y haga clic en unos pocos cientos de partículas en múltiples micrografías y evite seleccionar partículas superpuestas. Aquí, se seleccionaron 340 partículas en 29 micrografías. Cuando haya terminado, haga clic en Done Picking! Extraer partículas.
    NOTA: Este protocolo utiliza la selección manual de partículas para generar plantillas para la selección automática. Sin embargo, también están disponibles otros métodos17.
  2. Para generar plantillas para la selección automatizada de partículas, haga clic en Clasificación 2D e introduzca las selecciones de partículas generadas en el paso 3.1. Cambie el número de clases 2D a 10 y ponga en cola el trabajo.
  3. Abra Seleccionar clases 2D. Introduzca las partículas y los promedios de clase obtenidos en el paso 3.2 y haga clic en la pestaña Interactivo . Seleccione clases 2D representativas con un buen SNR y haga clic en Listo.
    NOTA: Los promedios de clase reflejan diferentes vistas de partículas. Seleccione promedios de clase que reflejen cada vista. El objetivo es producir plantillas bien definidas que representen diferentes vistas del espécimen para la recolección automatizada.
  4. Abra el Selector de plantillas e introduzca las clases 2D seleccionadas en el paso 3.3 y las micrografías de los pasos 2.4-2.5. Establezca el diámetro de partícula (Å) en 220 Å y ponga en cola el trabajo.
  5. Para inspeccionar las selecciones automatizadas, abra Seleccionar selecciones de partículas, introduzca las partículas y micrografías generadas en el paso 3.4 y ponga en cola el trabajo.
  6. En la tarjeta de trabajo Seleccionar selecciones de partículas, haga clic en la pestaña Interactivo y establezca el tamaño de la caja (px) en 300. Haga clic en una micrografía individual, ajuste el filtro de paso bajo hasta que las partículas sean claramente visibles y establezca el umbral de correlación cruzada normalizada (NCC) en 0,41 y el umbral de potencia entre 54000 y 227300.
  7. Inspeccione varias micrografías y, si es necesario, ajuste los umbrales de tal manera que la mayoría de las partículas se seleccionen sin incluir falsos positivos. Cuando haya terminado, haga clic en ¡Listo de picking! Extraer partículas.
    NOTA: Las partículas verdaderas suelen tener un ncc y una puntuación de potencia altos, lo que indica que son similares a la plantilla y tienen un SNR alto, respectivamente.
  8. Abra Extraer de micrografías e introduzca las micrografías y partículas del paso 3.7. Establezca el tamaño de la caja extraída (px) en 300 y ponga en cola el trabajo.

4. CryoSPARC v3 - Clasificación 2D

  1. Haga clic en Clasificación 2D e introduzca las partículas extraídas del paso 3.8. Establezca el número de clases 2D en 50 y ponga en cola el trabajo.
  2. Para seleccionar las mejores clases 2D para su posterior procesamiento, abra Seleccionar clases 2D. Introduzca las partículas y los promedios de clase obtenidos en el paso 4.1. Haga clic en la pestaña Interactivo y elija clases 2D en función de la resolución y el número de partículas de la clase (Figura 3). No seleccione clases que contengan artefactos. Después de seleccionar, haga clic en Listo.
    NOTA: Por lo general, se requieren múltiples rondas de clasificación 2D para eliminar partículas, que no convergen en clases distintas y bien definidas. Ejecute tantas rondas de clasificación 2D como sea necesario para eliminar dichas partículas del conjunto de datos (Figura 3).

5. CryoSPARC v3 - reconstrucción ab-initio y refinamiento homogéneo

  1. Para generar un volumen 3D inicial, abra Ab-initio Reconstruction e introduzca las partículas obtenidas en el paso 4.2 o de la clasificación 2D final. Ajuste la simetría a icosaédrica. Ponga en cola el trabajo.
    NOTA: La simetría depende de la muestra y debe cambiarse en consecuencia. Si se desconoce, utilice la simetría C1.
  2. Refinamiento homogéneo abierto. Introduzca el volumen del paso 5.1 y las partículas del 4.2 o la clasificación 2D final. Cambie la simetría y ponga en cola el trabajo. Cuando termine el trabajo, inspeccione la curva de Fourier Shell Correlation (FSC) y descargue el volumen para examinarlo en UCSF Chimera18.

6. Exportación de coordenadas de partículas desde cryoSPARC v3 e importación a RELION-3 usando PyEM

NOTA: Las coordenadas de partículas llevan información sobre la ubicación de partículas individuales en cada micrografía. La transferencia de coordenadas en lugar de pilas de partículas a RELION-3 permite ejecutar pasos de refinamiento que de otro modo no estarían disponibles. Por ejemplo, el pulido de partículas requiere acceso a fotogramas de película iniciales. Por lo tanto, antes de exportar las coordenadas de partículas de cryoSPARC v3 a RELION-3, importe películas y realice la corrección de movimiento y la estimación de CTF en RELION-3. Consulte el tutorial de RELION-319 para obtener más información.

  1. Navegue hasta el directorio del proyecto RELION-3 e inicie RELION-3.
  2. Abra Importar desde el explorador de tipo de trabajo y especifique la ruta a las películas y los parámetros de adquisición como en el paso 1.3.
  3. Para realizar la corrección de movimiento, utilice UCSF MotionCor220 a través de la GUI de RELION-3, abra Corrección de movimiento y establezca los parámetros predeterminados como en el manual de UCSF MotionCor221. Introduzca la ruta de acceso a las películas importadas en el paso 6.2. En la pestaña Movimiento, especifique el trazado al ejecutable motioncor2.
    NOTA: MotionCor2 se puede ejecutar en paralelo utilizando varias GPU.
  4. Realice la estimación de CTF utilizando CTFFIND-4.122 a través de la GUI relion-3. Abra CTF Estimation e introduzca el micrographs.star generado en el paso 6.3. En la ficha CTFFIND-4.1, especifique la ruta de acceso al ejecutable CTFFIND-4.1 y establezca parámetros como en el tutorial de RELION-3.119.
  5. Para importar pilas de partículas de cryoSPARC v3 a RELION-3, primero deben exportarse desde cryoSPARC v3. En cryoSPARC v3, abra la tarjeta de trabajo del trabajo Seleccionar clase 2D desde el paso 4.2 o la clasificación 2D final. En la pestaña Detalles , haga clic en Exportar trabajo. El trabajo de exportación genera el archivo particles_exported.cs.
  6. Antes de importar las coordenadas de partículas de cryoSPARC v3 a RELION-3, el archivo de particles_exported.cs del paso 6.5 debe convertirse al formato .star. Con PyEM23, convierta el archivo particles_exported.cs al formato .star ejecutando el siguiente comando: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. En RELION-3, haga clic en la pestaña Selección manual y en la pestaña E/S , ingrese las micrografías del refinamiento de CTF descritas en el paso 6.4. En la ficha Pantalla , introduzca los siguientes parámetros: Diámetro de partícula (A): 220, Filtro de paso bajo (A): -1 , Escala para imagen CTF: 0,5. Ejecute el trabajo. Se genera un directorio llamado ManualPick en la carpeta de inicio de RELION-3.
    NOTA: Este paso se realiza para crear una estructura de carpetas de selección manual en RELION-3. Mientras se ejecuta la selección manual, se crea un único archivo .star que contiene las coordenadas de las partículas seleccionadas para cada micrografía promediada utilizada para la selección en la GUI de RELION-3.
  8. Navegue hasta la carpeta que contiene el archivo particles_exported.star del paso 6.6 y ejecute un script escrito en casa que produzca un único archivo manualpick.star para cada micrografía promediada utilizada para la selección de partículas crio-SPARC v3, lo que contribuyó a la clasificación 2D final exportada en el paso 6.5. Los archivos de coordenadas resultantes se guardan en la carpeta ManualPick/Movies.
  9. Vuelva a RELION-3 y vuelva a abrir el trabajo de picking manual . Haga clic en Continuar. Esto mostrará las partículas previamente recogidas en cryoSPARC v3 en la GUI de RELION-3. Inspeccione algunas micrografías para verificar si se ha logrado la transferencia de coordenadas de partículas y si las partículas se seleccionan correctamente.

7. RELION-3 - Extracción de partículas y clasificación 2D

  1. Haga clic en Extracción de partículas. En la ficha E/S , introduzca las micrografías corregidas de CTF del paso 6.4 y las coordenadas del paso 6.9. Haga clic en la pestaña Extraer y cambie el tamaño de la caja de partículas (pix) a 300. Ejecute el trabajo.
  2. Realice la clasificación 2D para limpiar aún más el conjunto de partículas generado en cryoSPARC v3 para lograr una reconstrucción de mayor resolución. Haga clic en Clasificación 2D y en la pestaña E/S , introduzca el archivo particles.star generado en el paso 7.1. En la pestaña Optimización , establezca el número de clases en 50 y el diámetro de máscara (A) en 280. Ejecute el trabajo.
    NOTA: La máscara debe abarcar toda la partícula.
  3. Para elegir las mejores clases 2D, haga clic en el método De selección de subconjuntos , ingrese el archivo _model.star del paso 7.2 y Ejecute el trabajo. Seleccione las clases como se describe en el paso 4.2.
  4. Repita los pasos 7.2 y 7.3 para eliminar las partículas no convergentes.

8. RELION-3 - Refinamiento 3D, creación de máscaras y post-procesamiento

  1. Utilice el mapa generado en cryoSPARC v3 (paso 5.2) como modelo inicial para el refinamiento 3D en RELION-3. Seleccione el método Import y establezca los siguientes parámetros en la pestaña E/S : Importar películas/micrografías RAW: No, Archivos de entrada RAW: Movies/*.mrc.
  2. Proporcione el archivo MTF e introduzca los parámetros de adquisición de películas como se describe en el paso 1.3. En la pestaña Otros , seleccione el mapa cryoSPARC v3 como archivo de entrada, cambie Tipo de nodo a referencia 3D (.mrc) y Ejecute el trabajo.
  3. Seleccione Refinamiento automático 3D y, en la pestaña E/S , establezca Imágenes de entrada como el archivo particles.star del paso 7.3 o el último trabajo de selección. Proporcione la reconstrucción de cryoSPARC v3 como mapa de referencia. Haga clic en la pestaña Referencia y cambie el filtro de paso bajo inicial (Å) a 50 y la simetría a icosaédrica. En la pestaña Optimización , cambie el diámetro de la máscara (Å) a 280 y ejecute el trabajo.
  4. Una vez finalizada la carrera, abra run_class001.mrc en UCSF Chimera.
  5. En UCSF Chimera, haga clic en Herramientas y, en Datos de volumen, seleccione Visor de volúmenes. Esto abrirá una nueva ventana para ajustar la configuración de volumen. Cambie el paso a 1 y ajuste el control deslizante hasta alcanzar el valor de nivel donde el mapa no tiene ruido. Registre este valor, ya que se utilizará para la creación de máscaras en el siguiente paso.
  6. El mapa producido a partir del refinamiento automático no refleja el verdadero FSC, ya que el ruido del disolvente circundante reduce la resolución. Antes del post-procesamiento, cree una máscara para distinguir la muestra de la región del solvente.
    1. Haga clic en Creación de máscaras e ingrese run_class001.mrc del paso 8.3.
    2. Haga clic en la pestaña Máscara y ajuste los parámetros de la siguiente manera: Mapa de filtro de paso bajo (Å): 10, Tamaño de píxel (Å): 1.045, Umbral de binarización inicial: el valor de nivel obtenido en el paso 8.5, Extender mapa binario tantos píxeles: 3 y Agregar un borde suave de tantos píxeles: 3. Ejecute el trabajo.
  7. Examine la máscara en UCSF Chimera. Si la máscara está demasiado apretada, aumente Extender mapa binario tantos píxeles y/o Añadir un borde suave de tantos píxeles. Es importante crear una máscara con bordes suaves, ya que una máscara afilada puede provocar un sobreajuste.
  8. Haga clic en Post-Procesamiento y en la pestaña E/S , ingrese los semi-mapas creados en el paso 8.3 y la máscara desde 8.6. Establezca el tamaño de píxel calibrado en 1.045 å. En la pestaña Enfocar , ingrese lo siguiente: ¿Estimar el factor B automáticamente?: Sí, la resolución más baja para el ajuste automático B (A) : 10, ¿usa su propio factor B?: No. En la pestaña Filtro , establezca Omitir ponderación FSC? en No. Ejecutar el trabajo.

9. RELION-3 - Entrenamiento de pulido y pulido de partículas

  1. Antes de corregir el movimiento inducido por haz por partícula, primero use el modo de entrenamiento para identificar las pistas de movimiento óptimas para el conjunto de datos. Abra El pulido bayesiano y, en la pestaña E/S , introduzca las micrografías corregidas por movimiento del paso 6.3, las partículas del paso 8.3 y el archivo .star del postproceso del paso 8.8. Haga clic en la pestaña Entrenamiento y establezca los siguientes parámetros: Parámetros óptimos del tren: Sí, Fracción de píxeles de Fourier para pruebas: 0.5, Use esta cantidad de partículas: 5000. Ejecute el trabajo.
    Nota : este script producirá opt_params_all_groups.txt archivo en la carpeta polaca RELION-3 que contiene los parámetros de pulido optimizados necesarios para ejecutar el siguiente paso.
  2. Una vez finalizado el trabajo de entrenamiento, haga clic en Pulido bayesiano. Haga clic en la pestaña Entrenamiento y establezca ¿Parámetros óptimos del tren? en No. Seleccione la ficha Polaco y, en Archivo de parámetros optimizados , especifique la ruta al archivo de opt_params_all_groups.txt del paso 9.1. Haga clic en Ejecutar.
  3. Repita el refinamiento 3D (paso 8.3) y el postprocesamiento (paso 8.8) con un conjunto de partículas pulidas.

10. RELION-3 - Refinamientos CTF y por partícula

  1. Para estimar aberraciones de orden superior, abra Refinamiento de CTF y, en la pestaña E/S en Partículas, seleccione la ruta al archivo .star que contiene partículas pulidas del reciente trabajo Refine 3D (run_data.star).
    1. En Postprocess Star File, establezca la ruta de acceso a la salida del último trabajo de posprocesamiento (paso 9.3).
    2. Seleccione la pestaña Ajustar y establezca los siguientes parámetros: Estimación (aumento anisotrópico): No, ¿Realizar ajuste de parámetros CTF? No, estima Beamtilt: Sí, ¿ también estima trefoil? Sí, ¿estima las abberaciones de 4º orden? Sí. Ejecute el trabajo.
  2. Repita el paso 10.1 utilizando como entrada las partículas (de Refine3D) generadas en el trabajo anterior (particles_ctf_refine.star). En la pestaña Ajustar , cambie Estimación (ampliación anisotrópica) a Sí y Ejecutar el trabajo.
  3. Repita el paso 10.2 utilizando como entrada partículas (de Refine3D) producidas en el trabajo anterior (particles_ctf_refine.star). En la pestaña Ajustar , establezca los siguientes parámetros: Estimación (aumento anisotrópico): No, ¿Realizar ajuste de parámetros CTF?: Sí, ¿Ajustar desenfoque?: ¿Por partícula, Astigmatismo de ajuste? ¿Por micrografía, ajuste del factor B?: No, Ajuste de cambio de fase: No, ¿Estimar el haz?: No, ¿Estimar aberraciones de 4º orden?: No. Ejecutarlo .
    NOTA: Dado que la partícula tiene suficiente contraste, la pestaña ¿Astigmatismo de ajuste? se puede establecer en Per-partícula. Para este conjunto de datos, el refinamiento del astigmatismo por partícula no mejoró la calidad y la resolución del mapa.
  4. Repita el refinamiento 3D con las partículas del paso 10.3 y en la pestaña E/S, establezca ¿Usar FSC aplanados con disolvente? en sí. Cuando termine de ejecutarse, ejecute un trabajo de posprocesamiento (paso 8.8) y examine el mapa en UCSF Chimera (paso 5.2).

11. Transferencia de coordenadas de partículas RELION-3 y mapa 3D a Scipion 3

  1. Para refinar y validar aún más el mapa RELION-3, primero importe el volumen y las partículas del último trabajo de posprocesamiento (paso 10.4) a Scipion 3. Inicie Scipion 3 y cree un nuevo proyecto.
  2. En el panel Protocolos de la izquierda, seleccione el menú desplegable Importaciones y haga clic en Importar partículas. Cambie los siguientes parámetros: Importar desde: RELION-3, Archivo estrella: postprocess.star y especifique los parámetros de adquisición como en el paso 1.3. Haga clic en Ejecutar.
  3. Haga clic en el menú desplegable Importaciones y seleccione Importar volúmenes. En Importar desde , indique la ruta al mapa RELION-3. Cambie el tamaño de píxel (frecuencia de muestreo) Å/px a 1.045 y ejecute.

12. Scipion 3 - Refinamiento de alta resolución

  1. Primero, realice una alineación global. Seleccione el menú desplegable Refinar en el panel Protocolos y haga clic en Xmipp3 - highres24. Introduzca las partículas y volúmenes importados de los pasos 11.2 y 11.3 como imágenes de tamaño completo y volúmenes iniciales, respectivamente, y establezca el grupo de simetría en icosaédrico. En la pestaña Alineación de imagen, en Asignación angular, elija Global y establezca la Resolución máxima de destino en 3 Å, y Ejecute el trabajo.
  2. Cuando finalice el trabajo, haga clic en Analizar resultados. En la nueva ventana, haga clic en el icono de UCSF Chimera para examinar el volumen refinado. Además, haga clic en Gráficos de resolución de pantalla (FSC) para ver cómo ha cambiado el FSC después del refinamiento, así como histograma de gráfico con cambios angulares para ver si las asignaciones de ángulo de Euler han cambiado.
    NOTA: Dependiendo de la resolución de la estructura RELION-3 de entrada, este paso puede repetirse varias veces con diferentes valores establecidos para la resolución de destino máximo en la pestaña Asignación angular . Para obtener más información, consulte el tutorial de Scipion25.
  3. Repita el paso 12.1 con una alineación local. Copie el trabajo anterior y cambie Seleccionar ejecución anterior a Xmipp3 - highres Global. En la pestaña Asignación angular , cambie Alineación de imagen a Local. Establezca la resolución de destino máxima en 2,1 Å.
  4. Examine el mapa refinado en UCSF Chimera y analice el cambio en fsc y asignaciones angulares (paso 12.2). Repita el refinamiento local hasta que la resolución no mejore y las asignaciones angulares hayan convergido, ajustando la resolución máxima de destino según sea necesario.
  5. El mapa de salida de Scipion 3 se puede modificar y afilar adicionalmente en Phenix26.

13. Scipion 3 - Validación de mapas

  1. Examine la resolución local del mapa final generado en Xmipp3 - highres. Abra Xmipp - MonoRes27 local e introduzca el volumen final del trabajo anterior y la máscara generada en el paso 8.6. Establezca el rango de resolución de 1 a 6 Å con un intervalo de 0,1 Å y ejecute el trabajo.
  2. Cuando termine de ejecutarse, haga clic en Analizar resultados y examine el histograma de resolución y los segmentos de volumen coloreados por resolución.
  3. Para ver si las partículas están bien alineadas, abra Multireference Alignability28 e introduzca las partículas y el volumen del paso 12.3. Haga clic en Analizar resultados para mostrar el gráfico de validación. Idealmente, todos los puntos deben agruparse alrededor (1.0,1.0).
  4. Abra Xmipp3 - Validar sobreajuste. Introduzca las partículas y los volúmenes del paso 12.3. Cuando termine de ejecutarse, analice los resultados e inspeccione la parcela de sobreajuste. El cruce de las curvas de ruido gaussiano alineado y partículas alineadas indica sobreajuste.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos presentado una completa cartera de SPA para obtener una estructura de alta resolución utilizando tres plataformas de procesamiento diferentes: cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3. La Figura 1 y la Figura 4 resumen el flujo de trabajo de procesamiento general, y la Tabla 1 detalla los protocolos de refinamiento. Estos protocolos se utilizaron durante los refinamientos de una estructura de 2.3 Å de AAV, logrando una resolución cercana a Nyqui...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo, presentamos un sólido flujo de trabajo SPA para el procesamiento de datos crio-EM en varias plataformas de software para lograr reconstrucciones 3D de alta resolución (Figura 1). Este flujo de trabajo es aplicable a una amplia variedad de macromoléculas biológicas. Los pasos posteriores del protocolo se describen en la Figura 4, incluido el preprocesamiento de películas, la selección y clasificación de partículas y múltiples métodos para el ref...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Carlos Oscar Sorzano por su ayuda con la instalación de Scipion3 y a Kilian Schnelle y Arne Moeller por su ayuda con la transferencia de datos entre diferentes plataformas de procesamiento. Una parte de esta investigación fue apoyada por la subvención U24GM129547 de los NIH y realizada en el PNCC en OHSU y se accedió a través de EMSL (grid.436923.9), una Instalación de Usuario de la Oficina de Ciencia del DOE patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental. Este estudio fue apoyado por una subvención inicial de la Universidad de Rutgers a Arek Kulczyk.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Instituto Médico Howard Hughes, Facultad de Medicina Chan de UMass https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2UCSFhttps://msg.ucsf.edu/software
HerramientasComputacionales Phenix para la Cristalografía de Neutrones Macromoleculares (MNC)http://www.phenix-online.org/
PyEMUniversidad de California, San Franciscohttps://github.com/asarnow/pyem
Laboratorio de Biología EstructuralRELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstru (I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Resource for Biocomputing, Visualización e Informáticahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Grupo de Estructura Macromolecular MRC Centro de Procesamiento deImágenes

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