Este artículo describe cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento crio-EM, es decir, cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3, para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos de una sola partícula para la determinación de estructuras de alta resolución.
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Artículo de método
Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion
En este artículo
Resumen
Resumen
Los avances recientes tanto en instrumentación como en software de procesamiento de imágenes han hecho que la microscopía crioelectrónica de una sola partícula (cryo-EM) sea el método preferido por los biólogos estructurales para determinar estructuras de alta resolución de una amplia variedad de macromoléculas. Múltiples suites de software están disponibles para usuarios nuevos y expertos para el procesamiento de imágenes y el cálculo de estructuras, que agilizan el mismo flujo de trabajo básico: las películas adquiridas por los detectores de microscopio se someten a corrección para la estimación de la función de transferencia de contraste y movimiento inducida por haz (CTF). A continuación, las imágenes de partículas se seleccionan y extraen de fotogramas de película promediados para la clasificación iterativa 2D y 3D, seguida de la reconstrucción, el refinamiento y la validación en 3D. Debido a que varios paquetes de software emplean diferentes algoritmos y requieren diferentes niveles de experiencia para operar, los mapas 3D que generan a menudo difieren en calidad y resolución. Por lo tanto, los usuarios transfieren datos regularmente entre una variedad de programas para obtener resultados óptimos. Este documento proporciona una guía para que los usuarios naveguen por un flujo de trabajo a través de los paquetes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3 para obtener una estructura de resolución casi atómica del virus adenoasociado (AAV). Primero detallamos una canalización de procesamiento de imágenes con cryoSPARC v3, ya que sus algoritmos eficientes y su GUI fácil de usar permiten a los usuarios llegar rápidamente a un mapa 3D. En el siguiente paso, utilizamos PyEM y scripts internos para convertir y transferir coordenadas de partículas de la reconstrucción 3D de mejor calidad obtenida en cryoSPARC v3 a RELION-3 y Scipion 3 y recalcular mapas 3D. Finalmente, describimos los pasos para un mayor refinamiento y validación de las estructuras resultantes mediante la integración de algoritmos de RELION-3 y Scipion 3. En este artículo, describimos cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos para la determinación de estructuras de alta resolución.
Introducción
La microscopía crioelectrónica (crio-EM) y el análisis de partículas individuales (SPA) permiten la determinación de la estructura de una amplia variedad de conjuntos biomoleculares en su estado hidratado, ayudando a iluminar el papel de estas macromoléculas en detalle atómico. Las mejoras en la óptica del microscopio, el hardware informático y el software de procesamiento de imágenes han permitido determinar estructuras de biomoléculas a una resolución que supera los 2 Å1,2,3. Más de 2.300 estructuras crio-EM se depositaron en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) en 2020, en....
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Protocolo
1. Creación de un nuevo proyecto cryoSPARC v3 e importación de datos
NOTA: Los datos se adquirieron en la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón (OHSU) en Portland utilizando un microscopio electrónico Titan Krios de 300 kV equipado con un detector de electrones directo Falcon 3. Las imágenes se recogieron en un modo de conteo con una dosis total de 28,38 e−/Å2 fraccionadas en 129 fotogramas, y un rango de desenfoque de -0,5 μm a -2,5 μm, a un tamaño de píxel de 1,045 Å utilizando EPU. La muestra de AAV-DJ fue proporcionada por el personal de OHSU.
- Abra cryoSPARC v3 en un navegador web y ha....
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Resultados
Hemos presentado una completa cartera de SPA para obtener una estructura de alta resolución utilizando tres plataformas de procesamiento diferentes: cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3. La Figura 1 y la Figura 4 resumen el flujo de trabajo de procesamiento general, y la Tabla 1 detalla los protocolos de refinamiento. Estos protocolos se utilizaron durante los refinamientos de una estructura de 2.3 Å de AAV, logrando una resolución cercana a Nyqui.......
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Discusión
En este artículo, presentamos un sólido flujo de trabajo SPA para el procesamiento de datos crio-EM en varias plataformas de software para lograr reconstrucciones 3D de alta resolución (Figura 1). Este flujo de trabajo es aplicable a una amplia variedad de macromoléculas biológicas. Los pasos posteriores del protocolo se describen en la Figura 4, incluido el preprocesamiento de películas, la selección y clasificación de partículas y múltiples métodos para el ref.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Carlos Oscar Sorzano por su ayuda con la instalación de Scipion3 y a Kilian Schnelle y Arne Moeller por su ayuda con la transferencia de datos entre diferentes plataformas de procesamiento. Una parte de esta investigación fue apoyada por la subvención U24GM129547 de los NIH y realizada en el PNCC en OHSU y se accedió a través de EMSL (grid.436923.9), una Instalación de Usuario de la Oficina de Ciencia del DOE patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental. Este estudio fue apoyado por una subvención inicial de la Universidad de Rutgers a Arek Kulczyk.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Instituto Médico Howard Hughes, Facultad de Medicina Chan de UMass https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | ||
| MotionCorr2 | UCSF | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Herramientas | Computacionales Phenix para la Cristalografía de Neutrones Macromoleculares (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Universidad de California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| Laboratorio de Biología Estructural | RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instru (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualización e Informática | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
Referencias
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M.,
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Reimpresiones y permisos
