Estrategia eficiente de diagnóstico de saliva por PCR con transcriptasa inversa cuantitativa del SARS-CoV-2 utilizando robots pipeteadores de código abierto

Summary

El protocolo describe un método de diagnóstico de SARS-CoV-2 que utiliza la automatización de código abierto para realizar pruebas moleculares RT-qPCR de muestras de saliva. Este enfoque escalable se puede aplicar a la vigilancia clínica de la salud pública, así como para aumentar la capacidad de los laboratorios universitarios más pequeños.

Abstract

La aparición de la reciente crisis sanitaria mundial del SARS-CoV-2 introdujo desafíos clave para la investigación epidemiológica y las pruebas clínicas. Caracterizada por una alta tasa de transmisión y baja mortalidad, la pandemia de COVID-19 requirió pruebas de diagnóstico precisas y eficientes, particularmente en poblaciones cerradas como las universidades residenciales. La disponibilidad inicial de pruebas de ácido nucleico, como los hisopos nasofaríngeos, fue limitada debido a la presión de la cadena de suministro, que también retrasó la notificación de los resultados de las pruebas. Las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcriptasa inversa basadas en saliva (RT-qPCR) han demostrado ser comparables en sensibilidad y especificidad a otros métodos de prueba, y la recolección de saliva es menos invasiva físicamente para los participantes. En consecuencia, desarrollamos un ensayo de diagnóstico multiplex RT-qPCR para la vigilancia de la población de la Universidad de Clemson y la comunidad circundante. El ensayo utilizó robots de manejo de líquidos y termocicladores de código abierto en lugar de complejos sistemas de automatización clínica para optimizar el flujo de trabajo y la flexibilidad del sistema. La automatización de rt-qPCR basada en saliva permite la detección rápida y precisa de una amplia gama de concentraciones de ARN viral para demandas de pruebas a gran y pequeña escala. El tiempo de respuesta promedio para el sistema automatizado fue de < 9 h para el 95% de las muestras y < 24 h para el 99% de las muestras. El costo de una sola prueba fue de $ 2.80 cuando todos los reactivos se compraron en cantidades a granel.

Introduction

El coronavirus-2 asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), un nuevo coronavirus, surgió a fines de 2019 y se propagó rápidamente a través de las poblaciones ^mundiales1. La infección por SARS-CoV-2 causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), una enfermedad altamente contagiosa con síntomas respiratorios e inflamatorios potencialmente graves. La alta transmisibilidad junto con la baja mortalidad indicaron que el virus se propagaría rápidamente a través de las poblaciones y requeriría mayores pruebas diagnósticas2,3. Las recomendaciones de salud pública alentaron el cribado poblacional a gran escala para aislar los casos y, posteriormente, reducir las tasas de transmisión4,5,6. Además, los modelos de vigilancia de la población revelaron que el aumento de la frecuencia de las pruebas y la disminución del tiempo de notificación tuvieron un mayor efecto en la reducción de la transmisión que el aumento de la sensibilidad de las ^pruebas7. Esto es probable porque las personas infectadas podrían ser puestas en cuarentena antes, rompiendo así las cadenas de infección.

El estándar original de pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) fueron hisopos nasofaríngeos (NP) procesados por RT-qPCR8. Sin embargo, surgen complicaciones con esta forma de prueba para poblaciones muy grandes, como el aumento del costo relativo y la presión exacerbada de la cadena de ^{suministro9,10}. Además, tanto la recolección de muestras como el procesamiento de métodos comunes de NAAT (incluidos los hisopos NP, los hisopos orofaríngeos, los hisopos de cornetes medios y los hisopos nasales) dependen de equipos especializados, reactivos y personal ^médico9,10.

Un sustituto adecuado para las pruebas RT-qPCR de hisopo NP son las pruebas basadas en saliva, que son una herramienta de diagnóstico precisa para la detección del SARS-CoV-211,12,13,14. La realización directa de RT-qPCR en muestras de saliva produce una sensibilidad y especificidad similares a las de los hisopos ^NP15. Una de las principales ventajas que tienen las pruebas de saliva sobre las pruebas de hisopo NP es que permiten la auto-recolección de ^muestras16. Esto minimiza la necesidad de personal médico y maximiza la facilidad de recolección de muestras para los pacientes al ser menos invasivo que los hisopos NP. Además, dado que las muestras de saliva no requieren tampones para extraer la muestra de un hisopo (como en el caso de las muestras NP), las pruebas basadas en saliva pueden utilizar directamente la extracción de ácido ribonucleico (ARN) a base de calor, lo que disminuye los costos de prueba al eliminar la necesidad de tampones adicionales, medios de transporte y / o reactivos de extracción de ^ARN14,17.

El Laboratorio de Investigación y Educación en Diagnóstico e Intervención de Enfermedades (REDDI) de la Universidad de Clemson se estableció para abordar las necesidades de la universidad para las pruebas y la vigilancia de COVID-19. En poblaciones cerradas, incluidas las universidades, las pruebas de vigilancia frecuentes junto con el distanciamiento social produjeron los resultados más favorables en los modelos epidemiológicos de prevalencia de la ^enfermedad18. Se adaptaron los protocolos consolidados CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 y ^{SalivaDirect14}, y se utilizó la automatización en el flujo de trabajo clínico para disminuir el costo y mejorar el tiempo de respuesta. Grupos anteriores habían utilizado robots de manipulación de líquidos de código abierto para los pasos de extracción de ARN del SARS-CoV-220,21, pero maximizamos el uso de los robots para preparar placas de prueba y cargar ^muestras22. Aquí, mostramos que el protocolo adaptado y la utilización de sistemas de manejo de líquidos de código abierto (Figura 1) permiten rt-qPCR basados en saliva rápidos y precisos y es una estrategia efectiva para la vigilancia de la salud pública a gran escala.

Protocol

Toda la investigación se realizó de conformidad con las Juntas de Revisión Institucional de La Universidad de Clemson y Prisma Health (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 de julio de 2020).

1. Configuración del robot de manejo de líquidos de código abierto

1. Instale módulos de filtro de aire particulado de alta eficiencia (HEPA) (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior de cada robot de manejo de líquidos según las instrucciones del fabricante.
2. Conecte una pipeta P20 de 8 canales al soporte izquierdo de los robots de preparación de placas de mezcla maestras según las instrucciones del fabricante.
3. Conecte una pipeta P20 al soporte derecho del robot o robots de carga de muestras según las instrucciones del fabricante.
4. Descargue los scripts de Python personalizados (Archivo suplementario 1 y Archivo suplementario 2) en los equipos apropiados.
5. Abra TigerSaliva Full 384 Loading.py en la aplicación de escritorio en las computadoras robóticas de carga de muestras. Haga clic en Calibrar y configure tanto la pipeta como el programa según las instrucciones del software.
6. Abra 12 full Plates.py en la aplicación de escritorio en la computadora del robot de mezcla maestra. Haga clic en Calibrar y configure tanto la pipeta como el programa según las instrucciones del software.
7. Imprima bastidores de muestra personalizados con una impresora tridimensional (3D) de modelado por deposición fundida utilizando un archivo de diseño asistido por ordenador (CAD) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Imprima 16 bastidores por robot de carga de muestras, para dos juegos de ocho bastidores.

2. Preparación de la sonda multiplex 20x N1 + P1 / mezcla de imprimación

1. Prepare un lote de 20x multiplex N1+P1 probe/primer mix (volumen total de 20 mL, Tabla 1) en un tubo cónico de 50 mL en un ambiente estéril lejos del ARN sintético del SARS-CoV-2 o de muestras de pacientes.
2. Alícuota 1,6 ml de la mezcla utilizando una pipeta serológica en tubos de centrífuga estériles de 2,0 ml y etiquételos adecuadamente.
3. Guarde las alícuotas en un congelador de -20 °C hasta que estén listas para usar.

3. Preparación de la mezcla de control positivo

NOTA: La mezcla de control positivo no debe fabricarse en el mismo ambiente estéril que la mezcla de sonda/imprimación u otros componentes de la mezcla maestra. Se debe usar un recipiente separado de agua libre de nucleasas.

1. Diluir el ARN sintético (N1) del SARS-CoV-2 de 1.000.000 de copias de genes/μL (cpμ) a 10.000 cpμ añadiendo 10 μL de solución madre a 990 μL de agua libre de nucleasa. Alícuota 25 μL de 10.000 cpμ en tubos estériles de 0,2 ml y etiquetar adecuadamente. Guarde las alícuotas no utilizadas a -80°C.
   NOTA: El ARN sintético debe almacenarse a -80 °C para evitar la degradación.
2. Diluir Hs_RPP30 ADN sintético (P1) de 200.000 cpμ a 10.000 cpμ añadiendo 50 μL de solución madre a 950 μL de agua libre de nucleasas. Alícuota 25 μL de 10.000 cpμ en tubos estériles de 0,2 ml y etiquetar adecuadamente. Guarde las alícuotas no utilizadas a -80°C.
3. Diluir cada componente a una concentración final de 200 cpμ añadiendo 20 μL de SARS-CoV-2 y Hs_RPP30 10.000 cpμ a 960 μL de agua libre de nucleasa, para un total de 1000 μL. Alícuota 20 μL de control positivo mixto de 200 cpμ en tubos de 0,2 ml y etiquetar adecuadamente. Guarde las alícuotas a -80°C hasta que estén listas para su uso.

4. Preparación de placas de mezcla maestras

NOTA: Haga la mezcla maestra en un ambiente estéril lejos del ARN sintético del SARS-CoV-2 o de muestras de pacientes. Todos los componentes deben descongelarse completamente antes de agregarlos a la mezcla; sin una descongelación adecuada, las concentraciones pueden ser incorrectas. La descongelación inadecuada está indicada por la presencia de hielo o el color desigual de los reactivos. Almacene en un bloque congelador mientras prepara la mezcla.

1. Prepare un lote de mezcla maestra multiplex (volumen total de 48 ml, Tabla 2) en un tubo cónico de 50 ml.
2. Homogeneizar la mezcla girando el tubo más de 3x. No mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo o vórtice, ya que esto dañará la enzima.
3. Llene las columnas 1-4 de un depósito de pozo profundo estéril de 96 pozos transfiriendo 1.48 ml de mezcla maestra a cada pozo. Una cónica de 50 ml llena cuatro columnas, suficiente para 12 placas.
4. Cubra el depósito del pozo profundo con un sello de lámina y colóquelo en el robot de manejo de líquidos de mezcla maestra dedicado. Coloque el depósito de pozo profundo lleno en la cubierta 10, coloque seis placas vacías de 384 pocillos en las cubiertas 1-6 y la caja de puntas P20 en la cubierta 11. Destapa la placa del pozo profundo y las cajas de punta y cierra el robot.
5. Inicialice el protocolo operativo python personalizado haciendo clic en Iniciar ejecución en la aplicación de escritorio del robot.
6. Después de 40 minutos, la carrera se detendrá. Cubra las placas de 384 pozos llenas con sellos de lámina mientras permanecen en el robot y presione hacia abajo con el rodillo para garantizar la adherencia. Etiquete el borde de cada placa con un identificador de lote.
7. Coloque seis nuevas placas vacías de 384 pocillos en las cubiertas 1-6 y reanude el protocolo de operación haciendo clic en Reanudar ejecución. Una vez completada la ejecución, cubra el conjunto final de 384 placas de pozo con sellos de lámina.
8. Pipetear 2 μL de la mezcla maestra restante en las columnas 1-3 y 22-24 de una placa vacía de 384 pocillos para el control de calidad del lote. Selle con un sello ópticamente transparente y corra sobre el termociclador (sección 10.1-10.2). Si algún pozo tiene valores de ciclo umbral N1 (Ct) o si más de 10 pozos tienen valores P1 Ct, el lote está contaminado y no se puede usar.
9. Guarde las placas de mezcla maestra preparadas a 4 °C y utilícelas dentro de los 7 días posteriores a la preparación.

5. Recolección de muestras, ingesta y tratamiento térmico

1. Instruya a los participantes a evitar comer, beber, fumar o realizar una higiene dental 30 minutos antes de la recolección de saliva. Indique a los participantes que recolecten al menos 1 ml de saliva que se acumula naturalmente en la boca y la depositen en un tubo cónico estéril de 50 ml sin conservantes, luego cubra el tubo (Expediente suplementario 3).
2. Descontaminar el exterior de los tubos de recolección de saliva con etanol al 70% o toallitas desinfectantes y transferirlos al laboratorio para su análisis.
3. Registre la llegada de la muestra escaneando cada código de barras de muestra en la hoja de cálculo de ingesta diaria (Archivo Suplementario 4).
4. Tratar térmicamente las muestras escaneadas durante 30 min en un horno de 95 °C. Retire las muestras mientras usa guantes resistentes al calor.
   NOTA: Las muestras no tratadas son estables a temperatura ambiente (23 °C) durante un máximo de 72 h. Una vez tratadas térmicamente, las muestras deben almacenarse a 4 °C, si no se procesan inmediatamente.

6. Asignación de muestra

1. Abra las hojas de cálculo de carga de muestras diarias para cada robot de carga de muestras (archivo suplementario 5) en el equipo de la estación de asignación de muestras.
2. Asigne 188 muestras a cada placa de 384 pocillos de la siguiente manera: las muestras 1-48 se consideran el trimestre 1, las muestras 49-96 se consideran el trimestre 2, las muestras 97-144 se consideran el trimestre 3 y las muestras 145-188 se consideran el trimestre 4. Las muestras se analizan por duplicado.
3. Etiquete las bandejas con el nombre de la placa, la fecha y el número de cuarto. Escanee las muestras en orden en la hoja de cálculo de carga de muestras.
   NOTA: Es posible que las muestras de placas anteriores deban ejecutarse manualmente, como se define en la Figura 3. Consulte las secciones 8.1 a 8.3 para obtener instrucciones manuales de asignación y carga de muestras.

7. Funcionamiento de robots de carga de muestras

1. En la estación de carga de muestras, alinee dos juegos completos de ocho bastidores impresos en 3D correspondientes a la ubicación de la cubierta en el robot.
2. Desencapar los tubos cuarto 1 y colocarlos en bastidores impresos en 3D, comenzando por la posición A1 en el rack 1. Llene cada estante de izquierda a derecha y de arriba a abajo. Continúe con este patrón de carga en el rack 2, luego diríjase a los racks 4 y 5 (consulte la Figura 2C).
   NOTA: Los bastidores no están numerados consecutivamente debido a los parámetros del programa del robot.
3. Coloque los bastidores de muestra del cuarto 1 cargados en las cubiertas 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Coloque las puntas P20 en las cubiertas 3 y 9. Para simplificar el proceso de configuración, cargue materiales de atrás hacia adelante en el robot.
4. Tome una placa de mezcla maestra prefabricada de 4 ° C, etiquétela con el nombre de la placa y use una cuchilla afilada para cortar una línea en la lámina alrededor de los pozos de control (N23/24, O23/24 y P23/24).
5. Coloque la placa de mezcla maestra en la cubierta 6 y despegue la cubierta de la lámina, dejando atrás el pequeño rectángulo que cubre los pozos de control. Destapa las cajas de puntas y cierra el robot.
6. Inicialice el protocolo operativo python personalizado haciendo clic en Iniciar ejecución a través de la aplicación de escritorio del robot. Cada cuarto tarda 24,5 minutos en cargarse en la placa; establezca un temporizador como recordatorio.
7. Mientras el robot está funcionando, destapar y cargar los tubos de muestra del cuarto 2 en el segundo conjunto de bastidores impresos en 3D como se describe en la sección 7.2.
8. Cuando el robot se detenga, retire los bastidores del cuarto 1 y reemplácelos por bastidores del cuarto 2. Haga clic en Reanudar ejecución en la aplicación de escritorio.
9. Recapitule los tubos de muestra del cuarto 1 y guárdelos en un refrigerador de 4 ° C mientras espera los resultados.
   Repita este proceso de carga para los trimestres 3 y 4.
10. Transfiera la placa cargada a un gabinete de bioseguridad. Para minimizar la contaminación, mantenga la placa cubierta durante la transferencia.

8. Carga manual de muestras

NOTA: Realice una sola ejecución manual en muestras repetidas (N1 Rerun o Rerun, consulte la Figura 3) en caso de carga robótica inadecuada.

1. Recoger las muestras repetidas y asignarlas como las últimas muestras en el cuarto 4 (ver sección 6.2). Numere muestras, escanee los códigos de barras e ingrese la ubicación original de la muestra y el resultado en la hoja de cálculo de carga de muestras.
2. Transfiera muestras repetidas al gabinete de bioseguridad. No cargue tubos de muestra repetidos en los bastidores de carga del robot.
3. Pipetear 2 μL de cada muestra de repetición a los pocillos correctos siguiendo el diagrama de diseño de la placa (Archivo Suplementario 6). Use una pipeta designada para agregar muestras de pacientes. Mantenga los pozos de control cubiertos con papel de aluminio mientras agrega muestras para minimizar la contaminación.

9. Adición de controles a las placas de prueba

1. Despegue la cubierta de papel de aluminio sobre los pozos de control con fórceps.
2. Pipetear 2 μL de agua libre de nucleasa (sin control de plantilla) a pozos N23-N24 y 2 μL de 200 cpμ de control positivo mixto (consulte la sección 3) a pozos O23-O24. Pipetear 2 μL de un control de muestra de paciente positivo confirmado en pozos M23-M24 como control adicional. Deje los pocillos P23-P24 vacíos para monitorear la calidad del lote de mezcla maestra.
3. Cubra la placa con un sello ópticamente transparente y use el rodillo aplicador para adherir el sello a todos los pozos. Vórtice la placa a 2500 rpm durante 30 segundos para mezclar bien. Centrifugar la placa a 500 x g durante 1 min.

10. Realización de RT-qPCR

1. Crear un programa de protocolo en el software del termociclador de acuerdo con las condiciones descritas (Tabla 3). Guarde el protocolo para futuras placas. Coloque la placa sellada en el termociclador y ejecute el protocolo.
2. Exporte los valores de Ct como un archivo .xslx y copie los valores en la hoja de cálculo de carga de muestra (archivo complementario 5).
   NOTA: Estas hojas fueron diseñadas a medida para los archivos de salida Ct del software del fabricante y pueden necesitar modificaciones para aceptar otros formatos.

11. Determinación de la validez de la placa

1. Validar tanto las muestras de control positivo y/o positivas conocidas como el control negativo para considerar los resultados de la placa como válidos. Evaluar los pozos de control con los siguientes criterios.
   1. Para el control positivo, compruebe si al menos un pozo de control positivo (O23/O24) produce valores de Ct de entre 22-28 para las sondas P1 y N1. Alternativamente, los pozos de muestra positivos conocidos (M23/M24) producen valores de P1 y N1 Ct <33 en las sondas P1 y N1.
   2. Para el control negativo, compruebe que no hay valores de N1 o P1 Ct en ninguno de los dos pozos de control negativos (N23/N24). Confirme que los valores de Ct tienen curvas de amplificación válidas antes de invalidar la placa.

12. Interpretación de los resultados de la muestra

1. Determinar el resultado del paciente siguiendo el diagrama (Figura 3) e informar de las muestras resueltas.
   1. Evalúe el resultado P1 como VÁLIDO o INVÁLIDO. Si P1 produce un resultado de Ct <33, considere el pozo VÁLIDO y proceda a resultar de N1. Si P1 produce un resultado de Ct >=33 o ningún valor de Ct, considere el pozo INVALID.
      1. Evalúe el resultado N1 como SÍ, NO o NO*. Si N1 produce un resultado de Ct <33, el pozo es SÍ. Si N1 no produce un valor de Ct, el pozo es NO. Si N1 produce un Ct >=33, el pozo es NO*. Confirme que todos los valores de N1 Ct están asociados a una curva de amplificación real. Si un valor de Ct para N1 no tiene curva de amplificación, el pozo es NO.
      2. Identifique las muestras repetidas (N1 Rerun o Rerun), etiquételas con un número de muestra interno y un tipo de muestra y devuélvalas al flujo de trabajo de carga (sección 8.1-8.3).

13. Limpieza de laboratorio

1. Robots de manipulación de líquidos
   1. Limpie todos los lados con desinfectante de nivel intermedio. No use etanol, ya que degradará el plástico.
   2. Limpie suavemente el extremo de la punta de la pipeta y el contenedor de basura con una toallita con alcohol (70% de etanol o 100% de isopropanol). Limpie el teclado y el ratón.
2. Gabinete de bioseguridad
   1. Limpie todas las superficies con desinfectante de nivel intermedio. Encienda la luz UV durante 15 minutos.

Results

Determinamos el rango de detección para sondas RT-qPCR y cebadores para el contenido de ácido nucleico sintético tanto para SARS-CoV-2 (N1) como para Hs_RPP30 (P1). Se realizó una dilución en serie de 10 veces de las concentraciones conocidas de ARN sintético combinado del SARS-CoV-2 y ADN Hs_RPP30 sintético en agua. Se utilizó la siguiente fórmula para convertir el peso molecular en número de copia de genes

Número de copia del gen = (ng * 6.0221 x ¹⁰²³)/((longitud en pares de bases*660 g/mol) *1 x ¹⁰⁹ ng/g)

y se realizó RT-qPCR. Después de realizar RT-qPCR, las curvas lineales para la detección de N1 (Figura 4A) y la detección de P1 (Figura 4B) mostraron buenos coeficientes de correlación en una amplia gama de concentraciones de copias de genes (^R2 = 0,9975 y ^R2 = 0,9884, respectivamente). Este resultado indica que la combinación de conjuntos de cebadores y sondas no es inhibitoria y puede detectar con precisión el ARN del SARS-CoV-2 en una copia del gen/μL (Cq=33). Una copia del gen es aproximadamente equivalente a una copia viral; sin embargo, no se determinaron los números cuantitativos de copias virales en la saliva debido a la naturaleza semicuantitativa de la RT-qPCR. Intentamos simular muestras de saliva positivas aumentando el ARN sintético del SARS-CoV-2 de concentraciones conocidas en saliva libre de virus (tanto tratada térmicamente como no tratada térmicamente), pero no pudimos producir amplificación de N1 a bajas concentraciones de ARN (datos no mostrados). Esto podría deberse a la degradación de la RNasa u otros factores de confusión.

También se evaluó la variabilidad entre e intraensayos entre los métodos de carga de muestras automatizados y manuales. Para evaluar la variabilidad entre ensayos, se cargaron 20 muestras positivas únicas utilizando los métodos manual (descrito en la sección 8.1-8.3) y automatizado (descrito en la sección 7.1-7.11). Se compararon los valores de N1 Ct para determinar si los robots de manipulación de líquidos y la carga manual de muestras produjeron resultados equivalentes (Figura 5A). La relación lineal entre los métodos manuales y automatizados produjo un alto coeficiente de correlación (^R2= 0,9088), lo que indica que ambos métodos son funcionalmente equivalentes. A medida que los valores de N1 Ct aumentaron, la variabilidad de los valores de Ct también aumentó. Esta tendencia probablemente se deba a la distribución heterogénea de partículas virales dentro de la saliva, que es más pronunciada cuando hay menos partículas presentes. Para evaluar la variabilidad intraensayo, se realizó una comparación entre los valores de N1 Ct de pocillos replicados de muestras de saliva únicas utilizando ambos métodos de carga de muestras (Figura 5B). La relación lineal entre réplicas de carga automática de muestras (^R2= 0,9622) produjo un coeficiente de correlación ligeramente superior al de la carga manual (^R2= 0,9589), lo que indica una alta reproducibilidad de la detección del SARS-CoV-2 para ambos métodos de carga.

Finalmente, se realizó una evaluación de la reducción de la viscosidad de la saliva con respecto a los métodos de tratamiento térmico (Figura 6). La saliva se obtuvo de una sola fuente para eliminar la variabilidad de la muestra. Una mayor variabilidad en los valores de P1 Ct dentro de un método de tratamiento térmico puede ser indicativa de una mayor viscosidad de la muestra, ya que la saliva viscosa no se puede aspirar y dispensar con precisión. Los métodos de tratamiento térmico de 30 min y 60 min produjeron una variabilidad significativa de la muestra en comparación con ningún control de tratamiento (p = 0,0006 y p = 0,0429, respectivamente). No hubo diferencias significativas entre los tratamientos de 30 min y 60 min (p = 0,2245); por lo tanto, se implementó el método de tratamiento térmico de 30 minutos para reducir el tiempo de procesamiento.

Figura 1: Flujo de trabajo de laboratorio que utiliza el sistema de diagnóstico RT-qPCR basado en saliva. (A) Las muestras se recogen y se tratan térmicamente a 95 °C durante 30 min. Las muestras tratadas se clasifican y rastrean con información del paciente a través de un sistema de hoja de cálculo interno. Un robot de manipulación de líquidos carga muestras en pozos duplicados de placas de mezcla maestras preparadas. Un técnico carga manualmente los controles, sella la placa y coloca la placa en un termociclador para su procesamiento. Los resultados son analizados a través de un sistema informático automatizado y verificados por un técnico. (B) Un técnico prepara reactivos para la mezcla maestra que se agregan a un depósito de pozo profundo en un gabinete de bioseguridad estéril. Los depósitos de pozos profundos llenos se cargan en un robot de manejo de líquidos dedicado. Las placas completadas se sellan con papel de aluminio, se etiquetan y se almacenan a 4 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diseños utilizados para el robot de manipulación de líquidos. (A) Diseño de la cubierta para el robot o robots de preparación de placas de mezcla maestras. Con una pipeta de ocho canales, el robot está programado para recoger las puntas de la pipeta, aspirar la mezcla maestra de un depósito de pozo profundo de 96 pozos, dispensar la mezcla maestra en placas vacías de 384 pocillos y expulsar las puntas de la pipeta a un contenedor de basura. Esto se repite durante seis placas por tirada. (B) Configuración de la cubierta para el robot o robots de carga de muestras. Con una pipeta de un solo canal, el robot está programado para recoger una punta de pipeta, aspirar una muestra de saliva, dispensar una muestra de saliva en pozos duplicados de una placa de mezcla maestra de 384 pocillos y expulsar la punta de la pipeta a un contenedor de basura. Esto se repite para 48 muestras por tirada. (C) Orden de carga de tubos de muestra para bastidores impresos en 3D. Las flechas rojas indican el orden de carga dentro de un bastidor, y los números en caja blanca indican el orden de carga de todo el conjunto de bastidores. Toda la configuración cargará 188 muestras por duplicado en una placa de 384 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama de flujo resultante de la muestra. Se determinó que las muestras con P1 válido y N1 positivo eran muestras de saliva humana positivas para SARS-CoV-2. Los resultados de la muestra válidos y positivos/negativos se consideraron concluyentes. Las muestras que no produjeron resultados concluyentes en la primera ejecución se clasificaron como Rerun (denotado RR) o N1 Rerun (denotado N1 RR). Las muestras de repetición no tenían amplificación P1 válida, y las muestras de repetición N1 tenían amplificación positiva de N1 en una sola réplica. Si no se pudo producir una amplificación P1 válida mediante una ejecución manual posterior, o si ambas réplicas tenían valores de N1 Ct por encima del umbral positivo (Ct >33), los resultados de la muestra se consideraron no concluyentes. Para fines clínicos, las muestras de pacientes que no llegaron al laboratorio, tenían una cantidad insuficiente de saliva para pipetear o estaban dañadas se consideraron inválidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Detección RT-qPCR de ARN sintético N1 (SARS-CoV-2) y ADN sintético P1 (Hs_RPP 30). Las curvas estándar se trazaron con desviaciones estándar para determinar el rango de detección precisa utilizando esta combinación de sonda / imprimación. (A) Los valores medios de Ct (n = 4) obtenidos en las respectivas diluciones se trazaron contra la cantidad estimada de ARN sintético (1x100 a 1x104 copias de ARN en 10 μL de reacción RT-qPCR). (B) Los valores medios de Ct (n = 3) obtenidos en las respectivas diluciones se trazaron contra la cantidad estimada de ADN sintético (1 x ¹⁰⁰ a 1 x ¹⁰⁴ copias de genes en 10 μL de reacción RT-qPCR). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación entre los valores de transferencia de saliva manual y automatizada de SARS-CoV-2 (N1) Ct. Las muestras de saliva positivas conocidas para el SARS-CoV-2 (n = 20) fueron cargadas por duplicado en una placa de mezcla maestra RT-qPCR por un robot de manejo de líquidos. Las muestras tienen un valor de Ct que oscila entre 18-32 para N1. Las mismas muestras se cargaron manualmente en pozos duplicados en una ubicación de placa diferente. (A) Los valores de N1 Ct obtenidos de muestras únicas utilizando tanto el robot como la carga manual de muestras se transpusieron para determinar la variabilidad entre ensayos entre la carga manual y la del robot. (B) La variabilidad intraensayo también se determinó mediante el uso de réplicas transpuestas de los valores de N1 Ct obtenidos tanto de la carga de muestras robótica como manual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Evaluación de los métodos de tratamiento térmico para la reducción de la viscosidad de la saliva. La saliva negativa al SARS-CoV-2 se recogió de una sola fuente y las alícuotas se trataron térmicamente durante 0 min, 30 min o 60 min a 95 °C. Los valores de P1 Ct de las réplicas técnicas (n = 12) de cada afección se trazaron para determinar la variabilidad entre los métodos de tratamiento. Las comparaciones por pares entre los grupos se evaluaron con una prueba t no emparejada (*** indica p <0,001, * indica p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Comparación de N1 Ct en muestras de saliva de P1 Ct bajo. Se seleccionaron las muestras positivas con P1 Ct bajo y se compararon con el N1 Ct (n = 106). Los valores de N1 Ct variaron de 14 a 33, lo que indica que el ensayo tiene un rango dinámico en muestras de saliva que es comparable a la curva estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Componente		Secuencia (5'→3')		Concentración de existencias	Volumen
Sonda 2019-nCoV-N1		/5FAM/ACCCCGCAT/ZEN/TACGTTTGGTGGACC/3IABkFQ		50 μM	500 μL
2019-nCoV-N1-Para		GACCCCAAAATCAGCGAAAT		100 μM	2000 μL
2019-nCoV-N1-Rev		TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG		100 μM	2000 μL
Sonda Hs RPP30 Cy5		/5Cy5/TTCTGACCT/ZEN/GAAGGCTCTGCGCG/3IABkFQ		50 μM	500 μL
Hs-RPP30-Para		AGATTTGGACCTGCGAGCG		100 μM	2000 μL
Hs-RPP30-Rev		GAGCGGCTGTCTCCACAAGT		100 μM	2000 μL
Agua		-		-	11000 μL

Tabla 1: Componentes de la mezcla de sonda/imprimación N1+P1.

Componente		Concentración de existencias		Volumen por reacción	Concentración final	Volumen de lotes
Luna WarmStart RT Enzyme Mix		20 veces		0,5 μL	1X	3 ml
Mezcla de reacción de Luna Buffer		2X		5,0 μL	1X	30 ml
Mezcla de imprimación/sonda N1 +P1		nCoV N1 F: 10 μM		0,5 μL	500 nM	3 ml
		nCoV N1 R: 10 μM			500 nM
		Sonda nCoV N1: 2,5 μM			125 nM
		RPP_30 P1 F: 10 μM			500 nM
		RPP_30 P1 R: 10 μM			500 nM
		Sonda RPP_30 P1: 2,5 μM			125 nM
Agua libre de nucleasas		---		2 μL	---	12 ml
Subtotal		---		8 μL	---	48 ml
Plantilla				2 μL

Tabla 2: Componentes de la mezcla maestra multiplex SARS-CoV-2.

Etapa	Temperatura (°C)	Duración	Número de ciclos
Transcripción inversa	55	10 minutos	1
Desnaturalización inicial	95	1 min	1
Touchdown	95	10 segundos	3
	72	30 segundos
	95	10 segundos	3
	69	30 segundos
	95	10 segundos	3
	66	30 segundos
Amplificación principal	95	10 segundos	40
	65	30 segundos

Tabla 3: Protocolo Touchdown RT-qPCR. Condiciones de termociclamiento para el ensayo de diagnóstico RT-qPCR SARS-CoV-2 de un solo paso.

	Paso de touchdown		Sin paso de touchdown
	Media N1 Ct	Media P1 Ct	Media N1 Ct	Media P1 Ct
Ejemplo 1	19.65	22.7	27.8	28.3
Ejemplo 2	22.24	24.9	28.77	30.5
Ejemplo 3	18.85	19.2	24.65	25.9
Ejemplo 4	25.56	22.8	31.93	29.2
Ejemplo 5	22.34	24.8	38.48	40.0 (Detección fallida)

Tabla 4: Comparación de los valores de Ct de touchdown para cinco muestras positivas contra valores de Ct sin touchdown.

Muestra	TigreSaliva		Ensayo de SARS-CoV-2 basado en saliva disponible comercialmente
	N1 Ct	P1 Ct	Valor de Covid-19	Valor de RNaseP
D11	16.4	18.1	20.86	23.4
E11	18.9	19.1	25.6	21.2
F11	19.5	18.4	22.8	22.2
G11	22.2	19.1	23.7	22.9
H11	26.4	21.3	32.2	26.7
A12	14.8	16.5	29.15	19
B12	24	19.6	31.05	21.35
C12	14.9	17.5	20.84	18.9

Tabla 5: Comparación de los resultados de TigerSaliva Ct y los resultados del ensayo de SARS-CoV-2 basado en saliva disponibles comercialmente. Ambos ensayos se realizaron en las mismas muestras de saliva (n = 8).

Archivo suplementario 1: Script personalizado para la creación de placas de mezcla maestra de robots. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Script personalizado para el procesamiento de saliva en robots de carga de muestras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Instrucciones para la auto-recolección de muestras de saliva de alta calidad de los participantes. Se pueden encontrar más detalles en la breve descripción en video del proceso de prueba disponible en https://www.clemson.edu/centers-institutes/reddilab/index.html. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Hoja de cálculo de admisión de muestra. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 5: Hoja de cálculo de carga de muestra. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 6: Ejemplo de diagrama de diseño de placa de 384 pocillos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El ensayo descrito en el protocolo fue evaluado por un estudio de validación independiente. Se encontró que el ensayo tuvo una especificidad del 98,9% (1,1% falso positivo) y una sensibilidad del 90,0% (10,0% falso negativo) cuando se evaluó contra hisopos nasofaríngeos pareados tomados al mismo tiempo (n = 837; 817 negativos, 20 positivos). Es importante destacar que tres participantes que dieron positivo con TigerSaliva y negativo con un hisopo nasofaríngeo se volvieron a probar con hisopos 48 horas después y arrojaron resultados positivos, lo que indica que TigerSaliva puede ser capaz de detectar infecciones por SARS-CoV-2 más temprano en el curso de la enfermedad.

Simulamos muestras de saliva positivas mediante el aumento de saliva libre de virus (tanto tratada térmicamente como no tratada térmicamente) con concentraciones conocidas de ARN sintético del SARS-CoV-2 y realizamos una dilución de 10 veces para determinar el límite de Ct en la saliva. El gen N1 no fue detectable por debajo de 10.000 copias de genes (aproximadamente Ct = 28) en muestras positivas simuladas. Sospechamos que esto se debe a la degradación de la RNasa u otros factores de confusión. Sin embargo, la interacción de las RNasas de saliva con el ARN sintético desnudo es probablemente diferente de la interacción con las partículas virales, incluso después de que hayan sido desnaturalizadas por el calor. Se han identificado muestras de saliva positivas con Ct >30 y laboratorios externos obtuvieron datos de secuencia genética del SARS-CoV-2 a partir de estas muestras. Especulamos que las proteínas virales proporcionan protección contra la degradación del ARN en muestras de saliva de pacientes.

El paso más crítico en el protocolo es la implementación de la automatización para la preparación de mezcla maestra y el procesamiento de muestras de saliva (secciones 4 y 7 respectivamente). Esto permite la superposición de procesos de tareas, lo que reduce drásticamente el tiempo de respuesta. Otro paso crítico es la interpretación de los resultados clínicos (secciones 11 y 12). El establecimiento de categorías de resultados intermedios (Rerun y N1 Rerun) también minimizó la aparición de resultados de pruebas no concluyentes.

Demostramos que la variación entre los métodos manuales y automatizados de carga de muestras de saliva es insignificante (Figura 5A) y que la automatización puede mejorar la reproducibilidad de la detección del SARS-CoV-2 (Figura 5B). Se debe favorecer la automatización para facilitar las pruebas al diseñar y expandir los laboratorios ^clínicos25. El flujo de trabajo de laboratorio se mejora con la implementación de tareas automatizadas ^{por robot26}. Las capacidades de código abierto de los robots de manejo de líquidos permiten la implementación de scripts personalizados para el diseño de protocolos. Esto hace que los robots de manipulación de líquidos sean un sistema económico y altamente modificable en comparación con los métodos tradicionales de automatización clínica. También es una estrategia ideal para ejecutar tareas de laboratorio altamente repetitivas. El alto nivel de personalización del sistema se traduce en libertad para alterar el material de laboratorio (por ejemplo, tubos de recolección, puntas de pipeta o placas de 384 pocillos) en caso de escasez. Por lo tanto, la automatización mediante el uso de robots de manipulación de líquidos es viable tanto para la vigilancia y la investigación a gran escala como a pequeña escala.

Una ventaja importante de esta estrategia de prueba es un tiempo de respuesta mucho más corto en relación con otros laboratorios clínicos. La utilización de robots automatizados de manipulación de líquidos desempeña un papel clave en la reducción del tiempo de respuesta, pero el uso simultáneo de robots y termocicladores también es fundamental para maximizar la eficiencia de las pruebas. Un robot y un termociclador deben funcionar como un par, donde ambas máquinas se utilizan en tándem para la carga ininterrumpida de muestras y el análisis de resultados de muestras. Una vez que se establece un flujo constante de muestras asignadas, todos los pares de máquinas se pueden operar simultáneamente. El uso simultáneo constante de robots y termocicladores aumenta drásticamente la capacidad de prueba y la eficiencia, lo cual es crucial para adaptarse al alto volumen de pruebas.

A diferencia de otros protocolos establecidos sars-CoV-2 RT-qPCR, incluimos un paso de touchdown en el protocolo del termociclador para mejorar el recocido de la sonda y los conjuntos de cebadores a los genes ^objetivo27, reduciendo el riesgo de amplificación fallida. Los resultados demostraron que el touchdown mejoró la detección de muestras positivas sin arriesgar la pérdida de unión específica de la imprimación (Tabla 4). Determinamos que una amplia gama de copias de ARN del SARS-CoV-2 (Figura 4A) y Hs_RPP30 copias de ADN (Figura 4B) pueden detectarse simultáneamente mediante el ensayo RT-qPCR.

Una limitación de los robots de manipulación de líquidos es la posibilidad de contaminación cruzada de muestras positivas durante la transferencia de saliva. La saliva es un fluido viscoelástico28 y puede encadenarse a través de los pozos adyacentes después de ser dispensada desde la punta de la pipeta. Además, la heterogeneidad de la ^saliva29 puede provocar una distribución desigual de las partículas virales a lo largo de la muestra. Esto aumenta la posibilidad de falsos positivos y negativos, lo que requiere la designación de muestras N1 Rerun y Rerun. Sin embargo, el 14,1% de las muestras inicialmente designadas como N1 Rerun se resolvieron como positivas para SARS-CoV-2 y tenían más de 30 veces más probabilidades que las muestras de Rerun de resolverse como positivas después de volver a realizar la prueba. En consecuencia, diferenciar Rerun de N1 Rerun (Figura 3) permitió una separación más precisa de muestras potencialmente positivas, aumentando la sensibilidad y especificidad de nuestro ensayo diagnóstico. Otros parámetros resultantes para las pruebas diagnósticas de saliva no hicieron esta distinción12,14,24,30,31.

Las muestras de saliva pueden ser difíciles de pipetear debido a la heterogeneidad y ^viscosidad32. El tratamiento térmico desnaturaliza adecuadamente las proteínas de la biomatriz de saliva, reduciendo la viscosidad y eliminando la necesidad de reactivos de extracción de ^ARN9, que eran escasos durante las primeras etapas de la ^pandemia10. El tratamiento térmico extendido también inactiva los virus ^{presentes33, lo} que permite el procesamiento en laboratorio a niveles de bioseguridad más bajos. En consecuencia, se implementó una extracción de ARN basada en calor (descrita en la sección 5.4) para disminuir la viscosidad a través de la desnaturalización de proteínas (Figura 6). En base a los resultados, postulamos que el tratamiento térmico también puede homogeneizar muestras de saliva además de desnaturalizar la proteína biomatrix. Otros grupos combinaron el tratamiento térmico y el tratamiento con proteinasa K para aumentar la homogeneidad9,14,34. Elegimos no implementar este paso, ya que puede desnaturalizar las proteínas del virión a una velocidad que deja el ARN viral expuesto a la degradación por ^calor35. Además, la dilución de la muestra con proteinasa K puede enmascarar muestras positivas que contienen menos partículas virales, disminuyendo así la sensibilidad. Además, los resultados del ensayo se compararon con un ensayo de SARS-CoV-2 basado en saliva disponible comercialmente (Logix Smart COVID-19) que utiliza la extracción de ARN de perla magnética (Tabla 5). Se encontró que el ensayo actual era más adecuado para detectar muestras positivas débiles en comparación con el ensayo disponible comercialmente.

Es difícil cuantificar el número de copias de virus en la saliva utilizando solo RT-qPCR, porque la qPCR es semicuantitativa. Existe una variación inherente entre los valores de Ct que se origina a partir de limitaciones técnicas. El número de copias de genes se puede determinar a partir de los valores de Ct (Figura 4) y es aproximadamente equivalente al número de copias virales. Una posible solución para determinar el número de copias virales en muestras de saliva es la ddPCR, que proporciona una cuantificación completa de las copias de genes en la reacción. Sin embargo, creemos que es adecuado proporcionar resultados cualitativos a los médicos y el contenido viral relativo se puede comparar entre muestras procesadas con nuestros métodos.

A pesar de algunas limitaciones que surgen al usar saliva, el ensayo de SARS-CoV-2 mediante RT-qPCR basado en saliva demuestra ser un método efectivo para la detección rápida y confiable de ARN viral a cualquier escala de pruebas. Esto es especialmente cierto cuando se combina con la utilización de sistemas de manejo de líquidos de código abierto. Este enfoque de prueba se puede modificar para detectar otras secuencias de ácidos nucleicos relevantes para el diagnóstico, como agentes de enfermedades infecciosas, marcadores de enfermedades u otros virus. Esto hace que el ensayo sea aplicable tanto para los esfuerzos de diagnóstico clínicos como de investigación.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% EtOH	Fisher scientific	22-032-601
Puntas de pipeta filtradas de 20 uL	Opentrons		20 uL
Tubos de microcentrífuga de 2 ml	Fisher Scientific	14-666-313	puede utilizar un producto alternativo
Placa de PCR Armadillo, 384 pocillos, pocillos transparentes, blancos	Thermo Scientific	AB3384	Se puede utilizar un producto alternativo
Celltreat 2mL 96 Placas de pozos profundos	Fisher Scientific	50-828-743	Para la preparación de mastermix
Hojas de sellado de PCR transparentes	Thermo Scientific	AB0558	Se puede utilizar un producto alternativo
DPEC Agua tratada	Ambion (Thermo Scientific)	AM9916
Flip Cap 50 mL Tubos cónicos VWR		75845-210	Para la recogida de muestras
Láminas	de sellado de PCR de láminaThermo Scientific	AB0626	Para el almacenamiento de placas de mezcla maestra, se puede utilizar un producto alternativo
HS_RPP30 ADN sintético	Tecnologías de ADN integrado	299788131	control positivo P1
Sonda de tampón Luna Reacción en un solo paso	England Biolabs	M3006B
Luna WarmStart RT Mezcla de enzimas	England Biolabs	M3002B
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol	Tecnologías de ADN integradas	10006830
nCOV_N1 Sonda Alícuota, 50 nmol	Tecnologías de ADN integradas	10006832	sonda puede ser sintetizada por otros proveedores con fluóforos SYBR o FAM
nCOV_N1 Imprimación inversa, 100 nmol	Tecnologías de ADN integradas	10006831
Opentron Módulo de filtro HEPA	Opentrons N	/A	No es necesario, pero es útil para reducir contaminación
Opentron Accesorio multicanal, P20	Opentrons	999-00005	Para la preparación de mastermix
Opentron OT-2 Robot de manipulación de líquidos	Opentrons	OT-2
Opentron Accesorio de pipeta, P20	Opentrons	999-0000215	Para la carga de muestras
Horno	Memmert	UF450 PLUS 208V-3PH
Tubos de PCR (sin RNASA, sin DNASA)	Fisher Scientific	14-230-225	Para alícuotas de controles positivos y negativos Bloque de enfriamiento de
aluminio PolarSafe, 15 pocillos (tubos de 1,5/2,0 ml)	VWR	10808-952
Bloque de enfriamiento de aluminio PolarSaf, 24 pocillos (tubos de 0,5 ml)	Sonda VWR	10808-956
RNAse P (ATTO 647), 50 nmol	Integrated DNA Technologies	10007062	sonda puede ser sintetizada por otros proveedores con Cy5 Cartilla directa
ARNasa P fluoróforo, 100 nmol	Tecnologías de ADN integradas	10006836
Imprimación inversa de ARNasa P, 100 nmol	Tecnologías de ADN integradas	10006837
Sars-CoV-2 Control de ARN sintético 2	Torsión Biosciences	102024 / 103907 / 103909	N1
Escáneres de	Código	CR1500	Solo se requiere cuando se amplía
Campana con filtro HEPA pequeña	Erlab	Captair Bio 321	Para la preparación de mastermix
Termociclador CFX384 Touch	Biorad	CFX384 Touch	Se pueden utilizar modelos alternativos, p. ej. CFX384 Opus
X-acto Juego de cuchillas	Grapas	N/A	Para cortar papel de aluminio para mantener cubiertos los pozos de control