Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

Resumen

El protocolo describe la generación de esferoides de alto rendimiento para la bioimpresión utilizando el análisis multiparamétrico de su oxigenación y muerte celular en un microscopio de fluorescencia estándar. Este enfoque se puede aplicar para controlar la viabilidad de los esferoides y realizar la estandarización, lo cual es importante en el modelado de tejido 3D, el microambiente tumoral y la biofabricación (micro) tisular exitosa.

Resumen

Los esferoides multicelulares son herramientas importantes para estudiar la fisiología de los tejidos y el cáncer en 3D y se utilizan con frecuencia en ingeniería de tejidos como unidades de ensamblaje de tejidos para biofabricación. Si bien el poder principal del modelo esferoide está en imitar gradientes físico-químicos en la microescala tisular, el entorno fisiológico real (incluida la dinámica de la actividad metabólica, la oxigenación, la muerte celular y la proliferación) dentro de los esferoides generalmente se ignora. Al mismo tiempo, los efectos de la composición del medio de crecimiento y el método de formación sobre el fenotipo esferoide resultante están bien documentados. Por lo tanto, la caracterización y estandarización del fenotipo esferoide son necesarias para garantizar la reproducibilidad y transparencia de los resultados de la investigación. El análisis de la oxigenación esferoide media y el valor de los gradientes de O₂ en tres dimensiones (3D) puede ser una forma simple y universal para la caracterización del fenotipo esferoide, señalando su actividad metabólica, viabilidad general y potencial para recapitular el microambiente tisular in vivo . La visualización de la oxigenación 3D se puede combinar fácilmente con el análisis multiparamétrico de parámetros fisiológicos adicionales (como la muerte celular, la proliferación y la composición celular) y aplicarse para el monitoreo continuo de la oxigenación y / o mediciones de punto final. La carga de la sonda O₂ se realiza durante la etapa de formación de esferoides y es compatible con varios protocolos de generación de esferoides. El protocolo incluye un método de alto rendimiento de generación de esferoides con nanosensores fluorescentes O₂ de emisión de emisión de infrarrojos cercanos y rojos introducidos y la descripción de la evaluación multiparamétrica de la oxigenación de esferoides y la muerte celular antes y después de la bioimpresión. Los ejemplos experimentales muestran el análisis comparativo de gradientes de O₂ en esferoides homo y heterocelulares, así como en construcciones bioimpresas basadas en esferoides. El protocolo es compatible con un microscopio de fluorescencia convencional que tiene múltiples filtros de fluorescencia y un diodo emisor de luz como fuente de luz.

Introducción

El oxígeno molecular (O₂) es uno de los metabolitos clave que regulan la viabilidad, la función y la muerte de las células y los tejidos. En condiciones fisiológicas, la oxigenación local de los tejidos está regulada dinámicamente por la vascularización tisular, el flujo sanguíneo y el metabolismo celular, lo que en algunos casos conduce a la formación de gradientes de O₂, microambiente hipóxico y / o estrés oxidativo ^1,2. Las células detectan los gradientes de O₂ a través de la participación directa del O₂ molecular en la función de señalización (a través de la señalización mediada por el factor inducible por hipoxia (HIF), histonas lisina desmetilasas KDM y por otros medios), cambios en el potencial redox celular (detección reactiva de especies de O₂ a través de la señalización Nrf2 / Keap1 o proteínas reguladoras de hierro), y posteriormente pueden ajustar su metabolismo, proliferación, potencia y diferenciación³. Por lo tanto, la heterogeneidad de la oxigenación celular y tisular, sus gradientes y los fenómenos asociados son actores importantes en el desarrollo de tejidos y la homeostasis. Diferentes tejidos y tipos de células a menudo requieren diferentes niveles fisiológicos "normales" de O₂, que definen la arquitectura tisular especial con células posicionadas de acuerdo con los microgradientes O₂ del tejido⁴. Algunos tipos de células son sensibles a la disminución de O₂ (por ejemplo, neuronas, hepatocitos, células de los islotes pancreáticos o células musculares)^5,6, mientras que otros pueden soportar hipoxia extrema y formar gradientes de O₂ pronunciados (por ejemplo, en los epitelios intestinales y de colon)⁷. Con el progreso en la bioingeniería de tejidos y la biofabricación, la necesidad de cuantificación de O₂ en microagregados y construcciones de tejidos 3D esferoides se vuelve importante. Una de las preocupaciones es la estandarización de los parámetros fisiológicos del modelo esferoide multicelular, que dependen del método de generación de esferoides y las condiciones de cultivo⁸. Además, la aplicación incontrolada de biomateriales_liberadores de O₂ o perfusión de O 2 en microtejidos que carecen de vascularización funcional puede ser tóxica para las células, conducir a la reprogramación de su metabolismo y disminuir la supervivencia en el período posterior al trasplante ^9,10. La credibilidad del enfoque de medición de O₂ y la optimización del entorno de oxigenación para alcanzar el cultivo eficiente de microagregados fisiológicamente relevantes se demostró recientemente mediante el modelado matemático de esferoides hepáticos derivados de células madre pluripotentes utilizados como ejemplo¹¹. Otro campo donde se reconoce el conocimiento de los niveles de O₂ en el tejido es la terapia contra el cáncer^12,13. La hipoxia tumoral heterogénea puede afectar el éxito de la terapia contra el cáncer. Medir y controlar los niveles exactos de oxigenación durante el tratamiento del paciente o el modelado de hipoxia tumoral permitiría mejorar las estrategias terapéuticas individuales y personalizadas¹⁴. Por lo tanto, el monitoreo cuantitativo de la oxigenación dinámica en construcciones biofabricadas y modelos tumorales 3D es una herramienta prominente para el análisis fisiológico de su actividad respiratoria, metabolismo y optimización del cultivo de tejidos, condiciones de fabricación o estudios básicos de la respuesta terapéutica mediada por hipoxia.

Varios métodos permiten el análisis multiplexado (o multiparamétrico) de la oxigenación celular en construcciones de tejidos esferoides y microagregados. Pionero con neuroesferas y esferoides tumorales 15,16,17, el enfoque basado en microscopía de imágenes de por vida de fosforescencia (PLIM) permite cuantificar directamente la oxigenación celular en microtejidos vivos y establecer su correlación con la viabilidad, proliferación o distribución celular de los tipos de células funcionales. A pesar del poder del enfoque, la actualización de la microscopía PLIM todavía no está ampliamente disponible incluso entre los proveedores populares de microscopía^18,19. Afortunadamente, un buen número de sondas de nanopartículas sensibles a O₂ que penetran en las células también se pueden utilizar para el modo de medición ratiométrica basado en la intensidad de fluorescencia ^{15,17,20,21,22,23,24}. Por lo general, la sonda mostraría dos longitudes de onda de emisión, es decir, O₂ sensible e insensible (referencia), que se pueden medir en un microscopio de fluorescencia, un generador de imágenes de detección de alto contenido o un lector de microplacas. Tales nanopartículas de detección de O₂ se pueden producir mediante la técnica de precipitación con polímeros biocompatibles, detección de O₂ y colorantes de referencia que abarcan espectros visibles e infrarrojos cercanos, o se pueden comprar comercialmente ^2,25. Dado que el análisis de microtejidos 3D gruesos se beneficiaría del uso de colorantes fluorescentes desplazados al rojo, se construyó la sonda de nanopartículas multimodal ratiométrica O_2-sensing número 1 (MMIR1), que consiste_{en PtTPTBPF} ²⁶ de detección de O 2 y colorantes de referencia aza-BODIPY²⁷ impregnados en un copolímero a base de polimetacrilato cargado positivamente²⁸. Con este diseño, una señal sensible a O₂ (infrarrojo cercano, excitación (exc.) = 635 nm, emisión (em.) = 760 nm; I_sens) se ve afectada por la concentración de [O₂] a través del proceso de enfriamiento por fosforescencia, mientras que la intensidad del colorante de referencia rojo (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; I_ref) no se ve afectado (Figura 1A). Por lo tanto, la relación de_detección I_ref / I (R) en celdas teñidas puede permitir la calibración O₂ ²².

Aquí, describimos un enfoque semicuantitativo para monitorear la oxigenación de células vivas en esferoides y construcciones bioimpresas, ayudando a estimar los gradientes de O₂ en mediciones cinéticas y de punto final. Dichas imágenes de O₂ se pueden realizar con otros tipos de sondas ratiométricas de O₂ (Figura 1B) y, dependiendo del número de fuentes de luz disponibles y filtros de fluorescencia, se pueden usar con otros colorantes para obtener información sobre células vivas / muertas, función mitocondrial y rastreo de otros tipos de células. También se pueden utilizar modos de medición avanzados, como la microscopía de imágenes de por vida útil de fluorescencia (FLIM)¹⁹. El mayor desafío con el uso de tintes de tinción celular y nanopartículas sensibles a O₂ es la optimización del protocolo de tinción. En el caso de la sonda MMIR1 y las nanopartículas relacionadas, las células se teñen previamente o se cocuban durante el proceso de formación de esferoides. En el protocolo descrito, se generaron esferoides teñidos con sonda de O₂ en la superficie de agarosa de baja adherencia 29,30,31,32 (Figura 1C), lo que permite la posterior bioimpresión basada en esferoides y el análisis multiparamétrico de O₂ y muerte celular. Para ilustrar la aplicabilidad del enfoque, los niveles de oxigenación en los esferoides homo o heterocelulares (formados con la adición de células endoteliales de la vena umbilical humana, HUVEC) de células madre de pulpa dental humana (hDPSC) se compararon antes y después de la bioimpresión, utilizando el microscopio de fluorescencia convencional.

Protocolo

1. Generación de esferoides de alto rendimiento con sonda O₂ sensible incorporada

1. Preparación de la placa de cultivo de tejido recubierta de agarosa micropatronada
   NOTA: Las placas de cultivo de tejido recubiertas de agarosa microestumante se utilizan para la generación simultánea de un alto número de esferoides (1585 por sello PDMS, consulte la Tabla de materiales) para bioimpresión y otras aplicaciones, donde se necesitan múltiples réplicas experimentales o grandes números de esferoides.
   1. Preparar todos los materiales e instrumentos estériles (espátulas y pinzas) en autoclave siempre que sea posible o mediante esterilización por filtro. Limpie los sellos PDMS^{reciclables 33} de agarosa y guárdelos asépticamente en etanol al 70%. Haga esto al menos 1 día antes de la generación de esferoides.
   2. Transfiera sellos PDMS micropatronados de un vial de almacenamiento a una placa de Petri estéril y séquelos al aire con la superficie lisa bajo las condiciones de flujo de aire laminar estéril durante 10 minutos.
   3. Coloque cada sello con una superficie microestumantada hacia arriba (y una superficie lisa hacia abajo) en el medio del pozo de una placa de cultivo de tejido estéril de 12 pocillos. Secar al aire durante 1-2 min con la tapa abierta.
      NOTA: Es muy importante evaporar el exceso de líquido, ya que solo los sellos secos se adhieren perfectamente a la superficie plástica y permanecen adheridos durante el procedimiento.
   4. Pesar 1,5 g de agarosa en una botella de vidrio limpia de 200 ml, añadir 50 ml de agua destilada estéril, cubrir con una tapa y fundir en un microondas para hacer 50 ml de solución de agarosa homogénea al 3%.
      PRECAUCIÓN: La solución de agarosa es extremadamente caliente y debe manejarse con precaución. Si se agita inmediatamente después del procedimiento de fusión, la solución de agarosa caliente puede comenzar a burbujear y salir del recipiente. Para evitar traumatismos ocasionales, use vasos suficientemente grandes llenos con un máximo del 50% del volumen con la solución de agarosa.
   5. Usando una pipeta serológica estéril, agregue inmediatamente ~ 2 ml de solución de agarosa caliente a cada pocillo de las placas de cultivo celular de 12 pocillos para cubrir completamente el sello PDMS insertado. Deje que la agarosa se solidifique durante 20 minutos incubando bajo el flujo de aire estéril con la tapa de la placa abierta.
      NOTA: La capa de agarosa debe ser al menos dos veces más gruesa que el sello PDMS para garantizar la integridad de los micropocillos de agarosa después de la eliminación del sello PDMS (Figura 1C).
   6. Usando una pequeña espátula estéril, gire con precisión la agarosa con el sello PDMS incrustado boca abajo en cada pozo para tener la superficie lisa del sello hacia arriba. Agregue ~ 200 μL de agua estéril en la parte superior lisa del sello, quítelo suavemente de la agarosa con una espátula y retírelo del pozo. Evite dañar los micropocillos.
   7. Agregue 1 ml de medios de cultivo celular estéril correspondientes a los sellos de agarosa para uso directo. Cubra el plato con la tapa e incube durante la noche a 4 °C. Use solución de PBS (en lugar de media) para el almacenamiento a largo plazo (hasta 2 semanas a 4 °C). No deje que la agarosa se seque. Antes de su uso, caliente las placas micropatronadas de agarosa durante 1 h a 37 °C en una incubadora de CO₂ .
      NOTA: La incubación es necesaria para equilibrar y eliminar las burbujas de aire de los micropocillos de agarosa. Continúe con el paso de protocolo 1.2.
2. Preparación de O₂ esferoides cargados con sonda
   1. Utilice α-mínimo medio esencial (MEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y factores de crecimiento suplementados con medio de crecimiento de células endoteliales 2 para el cultivo de líneas celulares hDPSC y HUVEC, respectivamente. Prepare el medio de crecimiento de esferoides heterocelulares hDPSC / HUVEC agregando medios de crecimiento HUVEC y hDPSC en una proporción de 1: 1.
   2. Preparar 70%-90% de cultivo celular confluente (~3-4 días de preparación). Para la generación de esferoides heterocelulares, preparar cultivos hDPSC y HUVEC respectivamente.
      NOTA: El número de paso de HUVEC y hDPSC no debe exceder de 8. Para asegurar un rápido crecimiento de los cultivos celulares, siempre se divide a 1/3 del cultivo celular total (con una confluencia del 70%-80%) utilizando un nuevo matraz cada 3 a 4 días.
   3. Enjuague el cultivo celular confluente al 70%-90% con PBS precalentado (37 °C) (10 ml por matraz de 75 cm² ). Añadir solución enzimática disociante (tripsina al 0,05% y 1 mM de EDTA; 1 ml por matraz de 75 cm² ) e incubar durante 3-5 min a 37 °C en 5% de CO₂, 95% de humedad para el desprendimiento celular y comprobar el desprendimiento celular bajo el microscopio. Una vez hecho esto, neutralice la tripsina con medios de cultivo celular completos que contengan 10% de FBS (5 ml de medios por 1 ml de solución de disociación).
      NOTA: Evite la sobreexposición de las células a la solución enzimática disociante, ya que esto puede afectar su viabilidad.
   4. Para HUVEC cultivado en un medio de FBS bajo, realice la neutralización de tripsina agregando 0.5 ml de FBS al 100% de FBS al cultivo celular tratado con tripsina, seguido de centrifugación para transferir células a su medio de crecimiento.
      NOTA: Las suspensiones celulares obtenidas deben contener ~ 1 millón de células por 1 ml. Si es necesario, se puede agregar un paso de centrifugación adicional al protocolo para concentrar la suspensión celular.
   5. Disociar los agregados celulares mediante pipeteo utilizando una punta de pipeta de 1000 μL en la parte superior de una pipeta serológica de 10 ml para obtener suspensión de una sola celda. Utilice una cámara de conteo (hemocitómetro tipo Neubauer o alternativas) para contar el número de células por 1 ml de la suspensión celular³⁴. Diluir la suspensión celular a 500.000 células por ml. Para hDPSC / HUVEC heterocelular en proporción de esferoides 1: 1, agregue volúmenes iguales de suspensiones celulares correspondientes para tener una concentración celular final de 500,000 células por ml.
      NOTA: La variación de la concentración celular en suspensión agregada a un sello de agarosa con micropatrones permite cambiar el tamaño promedio de los esferoides producidos, que depende de un número de células por micropocillo de un sello de agarosa. En la configuración descrita, se generan esferoides de ~ 300 células a partir de 1 ml que contiene 500,000 células en un sello de agarosa con 1585 micropocillos.
   6. Añadir la solución concentrada de sonda de O₂ (nanopartículas, stock de 1 mg/ml) a la suspensión celular preparada hasta una concentración final de 5 μg/ml.
      NOTA: La formación de esferoides en presencia de nanopartículas de detección de O₂ proporciona una tinción eficiente, que se conserva durante un mínimo de 5 días (Figura 1D). Por el contrario, la tinción de esferoides multicelulares preformados con nanopartículas será menos eficiente¹⁵.
   7. Intercambiar 1 ml de medios antiguos en un pozo micromodelado de placas de cultivo celular recubiertas de agarosa de 12 pocillos (ver paso 1.1.7) por 1 ml de la suspensión celular preparada (500.000 células por 1 ml, con sonda de 5 μg/mL O₂ ). Cultive los esferoides en la incubadora de CO₂ durante 2-5 días en presencia continua de la sonda O₂ para garantizar su carga durante la formación y compactación de los esferoides.
      NOTA: Evite la evaporación excesiva del medio en cultivo de esferoides. Si es necesario, con cuidado (no perturbe los esferoides en los micropocillos) agregue 0.2-0.5 ml de medios de cultivo con la dilución adicional de la sonda O₂ .
   8. Después de la formación de esferoides, intercambie el medio de crecimiento con uno nuevo sin la sonda. La tinción de la sonda se conservará en los esferoides generados durante 7-14 días o más, lo que permitirá el monitoreo a largo plazo de sus señales en los esferoides.

2. Bioimpresión de esferoides

NOTA: Los esferoides se bioimprimen en una biotinta a base de gelatina modificada con metarilamida (GelMA). A continuación se muestra una descripción de los ingredientes de la biotinta, el procedimiento de preparación de la biotinta y la bioimpresión.

1. Preparación de Bioink
   1. Prepare una solución de GelMA al 10% (p/v) (2 ml) en medio bajo un flujo de aire laminar³⁵ de la siguiente manera: pese 0,2 g de GelMA estéril con un grado de sustitución de 78 en un tubo de 15 ml, agregue 1,9 ml de α-MEM y deje que se disuelva mezclando en un agitador rotativo a 37 ° C (~ 2 h).
      NOTA: No agregue la cantidad total de medio, porque otros compuestos como los esferoides y el fotoiniciador Li-TPO-L se agregarán más adelante.
   2. Resuspend esferoides en los pozos micromodelados mediante pipeteo y recógelos en un tubo de 15 mL. Realice un enjuague adicional con PBS para asegurarse de que todos los esferoides se recojan de los micropocillos de agarosa. Evite tocar /dañar los micropocillos de agarosa, ya que las escamas de agarosa pueden bloquear la aguja durante la bioimpresión.
   3. Recoger los esferoides por centrifugación en un tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante con una pipeta, añadir 50 μL de medio a los esferoides y resuspendirlos mediante pipeteo suave.
   4. Agregue la mezcla de esferoides a la solución tibia de GelMA y mezcle mediante pipeteo suave. Mantener la concentración de esferoides a 6340-12860 esferoides (de 4-8 micropatrones) por ml de biotinta para bioimpresión. Evite concentraciones más altas de esferoides, ya que causa fácilmente el bloqueo de la aguja de impresión.
   5. Añadir solución madre de Li-TPO-L fotoiniciador esterilizado por filtro (32 mg/mL) en una concentración final de 2 mol% con respecto al número de dobles enlaces y mezclar mediante pipeteo suave^36,37.
      NOTA: La cantidad de Li-TPO-L se puede calcular de acuerdo con la ecuación:
      Volumen del fotoiniciador (PI) = (0.000385 mol NH₂- grupos / g de GelMA x 294.10 g Li-TPO-L / mol x 0.78 x 0.02) / 0.032 g Li-TPO-L / mL x 0.2 g GelMA = 0.0107 mL Li-TPO-L stock
2. Procedimiento de bioimpresión
   1. Consulte los pasos del Protocolo suplementario 1 para el diseño de andamios en CAD. Para bioimprimir el diseño, siga los pasos a continuación.
   2. Cierre el extremo de un cartucho estéril de 3 cc con una tapa de punta (luer lock) y llene con biotinta mediante pipeteo. Inserte un émbolo en el cartucho. Sostenga el cartucho boca abajo y retire la tapa de la punta, empuje el émbolo hacia la biotinta hasta que se elimine todo el aire del cartucho.
      NOTA: Evite el contacto entre la biotinta GelMA y los lados del cartucho, ya que esto puede inhibir el movimiento del émbolo debido a la gelificación de la biotinta.
   3. Deje que la biotinta se enfríe en el manto de calentamiento de la bioimpresora a 23 °C (20-30 min). Atornille un adaptador de presión en la parte superior del cartucho. Cierre el clip en el tubo de entrada para evitar que la biotinta tenga fugas, monte una aguja de PE cónica de 22 G en el cartucho. Adapte el tamaño y el diámetro de la aguja al diseño del andamio y al diámetro y concentración de los esferoides.
      NOTA: Use una máscara bucal y guantes rociados para evitar la contaminación.
   4. Rocíe la bioimpresora con 70% de etanol y séquela con papel absorbente. Instale el cartucho en el manto calefactor del cabezal de impresión basado en extrusión. Enchufe la entrada de presión y abra el clip en la entrada. Cargue el archivo G-code de su diseño en el software de impresión.
   5. Inicie la medición de la longitud de la aguja. Regula la presión de impresión dispensando un poco de biotinta en una placa de Petri estéril. Una presión de impresión de 0.025-0.045 MPa es típica para imprimir biotintas basadas en GelMA³⁸.
   6. Instale una placa de 6 pocillos, abra la placa del pozo, cierre la campana y comience a imprimir. Después de la impresión, deje que los andamios se entrecrucen físicamente durante 10 min a 5 °C e irradie los andamios impresos durante 60 s con una lámpara LED UV (365 nm; 500 mW según el fabricante).
      NOTA: El tiempo de reticulación UV depende de las propiedades de la luz UV, el tipo y la concentración del fotoiniciador, el grado de reticulación del andamio deseado, la hinchazón y el módulo de elasticidad.
   7. Añadir inmediatamente los medios de crecimiento correspondientes que contengan 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (P/S) a todos los pocillos con rejillas bioimpresas (2 mL por pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos).
   8. Cultivo en una incubadora de CO_{2 a} 37 °C hasta iniciar la microscopía. Para la microscopía de construcción bioimpresa, transfiera una rejilla de gofre impresa a un plato de microscopía, cúbrala con medios de imagen y continúe con los pasos 3.2 y 3.3.
      NOTA: En el caso de construcciones bioimpresas flotantes, deben fijarse en la placa de microscopía sin un efecto sobre la viabilidad celular, por ejemplo, con pegamento citocompatible. Para la transferencia de microscopio invertido, la bioimpresión en un plato de microscopía con fondo de vidrio y cubrir con un medio de imagen (~ 200-500 μL, consulte la Nota al paso 3.1 para la composición de los medios de imagen) para evitar la flotación no deseada de la muestra. La tinción con sondas fluorescentes adicionales se puede realizar en la placa de cultivo celular antes de la transferencia de construcciones bioimpresas a placas de microscopía (ver paso 3.1.6).

3. Microscopía en vivo de fluorescencia cientesmétrica de oxigenación esferoide en el tejido biofabricado

NOTA: Para convertir la respuesta de intensidad ratiométrica (R) de la sonda O₂ en los niveles reales de hipoxia, la respuesta de la sonda debe calibrarse utilizando los procedimientos descritos en²⁴. Sin embargo, como la calibración ratiométrica es específica del instrumento y requiere la instalación de una incubadora controlada por T/O₂/CO₂ (no siempre disponible), el uso de la detección de relación semicuantitativa es la opción preferida.

1. Preparación de esferoides para el análisis de imágenes en vivo
   1. Para la fijación de esferoides durante este paso, cubra previamente las placas de microscopía estéril con colágeno IV y / o poli-D-lisina o use las disponibles comercialmente³⁹. Compruebe la compatibilidad de las placas microscopías con la distancia de trabajo y otras características del objetivo de su microscopio.
      NOTA: En el caso de las imágenes multiparamétricas, todos los procedimientos de tinción adicionales deben realizarse en las placas de cultivo con una cantidad suficiente de medios que protejan las células de la evaporación, el choque osmótico u otra tensión. Preparar y precalentar el medio de imagen antes de su uso: DMEM suplementado con bicarbonato de sodio (1,2 g/L), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), piruvato de sodio (1 mM), L-glutamina (2 mM) y glucosa (5 mM), sin rojo fenol.
   2. Con una pipeta de 1 ml, lave suavemente los esferoides preteñidos de la sonda O₂ de los micropocillos de agarosa. Mientras los esferoides todavía flotan en los medios, transfiéralos a un tubo inferior cónico de 15 ml.
   3. Para asegurar la recolección de todos los esferoides de un pozo micromodelado, enjuague el pozo de 1 a 3 veces con 1 ml adicional de medios de cultivo, combinando todas las suspensiones de esferoides en un vial. Deje el vial en posición vertical durante un máximo de 10 minutos para que los esferoides se asienten en la parte inferior del vial formando un gránulo visible.
   4. Retire con cuidado el medio del tubo dejando los esferoides intactos. Resuspóndalos suavemente en la cantidad de medio de cultivo fresco que sea suficiente para al menos 20 esferoides por plato de muestra de microscopía. Esto minimizará el uso de los medios de cultivo y simplificará la localización de esferoides durante la obtención de imágenes.
      NOTA: Utilice la parte de silicio en autoclave de μ placa de 12 pocillos de cámara (consulte la Tabla de materiales) unida al vidrio de la cubierta como un plato de muestra de microscopía (24 x 60 mm, espesor # 1) con un volumen de medios máximo de 300 μL por pozo. La parte de silicio de esta cámara de cultivo se puede esterilizar y reutilizar con cualquier otra superficie de plástico y vidrio cuando se adhiere al plato.
   5. Agregue inmediatamente el mismo volumen de suspensión de esferoides a cada plato/pozo de microscopía. Deje los esferoides durante 1 h a 37 °C en una incubadora de CO₂ para que se adhieran a la superficie de la placa microscopía. Para el análisis de oxigenación junto con el uso de otros colorantes, proceda con el paso 3.1.6. Para el análisis de oxigenación simple, continúe con el paso 3.1.7.
      NOTA: El tiempo de incubación insuficiente (<1 h) puede conducir a la eliminación y pérdida ocasional de esferoides durante el intercambio de medios, abortando su experimento. Al mismo tiempo, la sobreincubación (>3 h) puede conducir a la pérdida parcial o completa de su organización 3D debido a la migración de las células de los esferoides a la superficie de la placa microscopía y afectar su oxigenación en tiempo real.
   6. (opcional) Intercambie cuidadosamente el medio con una que contenga sondas fluorescentes diluidas a la concentración de tinción y continúe la incubación durante 1 h adicional para alcanzar la intensidad óptima. Para evitar la eliminación de esferoides durante el intercambio de medios, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de 200 μL desde los bordes de los platos de microscopía y realice la adición de medio lateralmente en el plato de microscopía. Continúe con el paso 3.1.7.
      NOTA: Para una tinción eficiente con sondas que tengan mala difusión en agregados multicelulares, prolongue la concentración y/o el tiempo de carga. Antes de su uso, determine los parámetros opcionales de carga de la sonda en experimentos preliminares.
   7. Retire el medio de la placa de microscopía y enjuague una vez con medios de imagen. Agregue la cantidad exacta de medios de imagen a la muestra (por ejemplo, 300 μL por micropocillo de μ cámara de una placa de cultivo de 12 pocillos). Continúe con el paso 3.2.
2. Adquisición de imágenes
   1. Encienda el microscopio y los dispositivos conectados (es decir, fuente de luz de excitación, cámara, computadora, incubadora y otros bloques electrónicos operativos) 30 minutos antes de la toma de imágenes para calentarse y equilibrarse con las condiciones de medición (temperatura, diferentes valores de O₂, 5% CO₂, humedad si es necesario). Inicie el software de operación de microscopía proporcionado con la configuración exacta del microscopio.
      NOTA: El protocolo descrito está adaptado para el software CellSens Dimension v.3.
   2. Seleccione los filtros de excitación (fuente, potencia) y emisión adecuados y el tiempo de exposición para las sondas fluorescentes (o fosforescentes) elegidas. Para análisis de microscopía multiparamétrica, 3D y de lapso de tiempo, escriba los protocolos de secuencia de medición automatizados en el software del microscopio operativo.
   3. Determinar empíricamente los ajustes óptimos de imagen para cada sonda, modelo experimental y línea celular en experimentos preliminares. Asegúrese de que los ajustes tengan un mínimo de fotoblanqueo en los canales de referencia (I_ref) y detección de O₂ (I_sens) y un efecto mínimo en la relación de intensidad (R = I_ref / I_sens), especialmente en experimentos de medición 3D y time-lapse.
   4. Configure el plato de microscopía con esferoides teñidos en la etapa de microscopía. Usando el objetivo de bajo aumento, obtenga una vista previa de la muestra en la luz de transmisión, haga un enfoque preliminar en los esferoides y ubíquelos en el centro de la imagen.
      NOTA: Los objetivos de aire de aumento estándar de 4x a 10x serán suficientes para el enfoque previo, mientras que para la medición real recomendamos objetivos de 20x a 40x con apertura numérica (NA) de 0.6 o superior (inmersión en aire o agua) que tengan suficiente distancia de trabajo para los esferoides conectados al plato.
   5. Llevar el objetivo con la alta ampliación requerida al puesto de trabajo. Concéntrese en el modo de luz de transmisión en la sección transversal media (ecuatorial) del esferoide. La oxigenación en objetos 3D depende directamente de la profundidad de la sección de imágenes. Para garantizar esto, analice secciones transversales similares en y entre grupos, por ejemplo, secciones transversales medias y superiores / inferiores de esferoides.
      NOTA: Para un análisis y reconstrucción detallados y precisos de gradientes de O₂ , recomendamos escanear y producir pilas Z utilizando microscopios confocales, de hoja de luz o de dos fotones (la mejor opción). Para la microscopía convencional de campo ancho, donde la señal de todas las secciones transversales se recopilará simultáneamente, se puede hacer una estimación promedio por la sección transversal media en lugar de un análisis exacto de los gradientes de O₂ . En este caso, la sección transversal media se define como una sección focal, donde los esferoides tienen un diámetro máximo con un enfoque nítido en sus bordes.
   6. Ajuste los ajustes para la recopilación de señales de fluorescencia/fosforescencia de referencia y canales espectrales sensibles de la sonda O₂ y otras sondas de fluorescencia aplicadas para imágenes multiparamétricas.
   7. Para la comparación cuantitativa basada en la intensidad, aplique la misma configuración de imagen elegida del tiempo de exposición, la potencia de la fuente de luz de excitación, la resolución, la velocidad de escaneo y el tamaño estenopeico para todos los objetos medidos en grupos.
      NOTA: Muchas versiones de software de microscopía proporcionadas por el proveedor permiten realizar cálculos automáticos de la relación de intensidad. Aplique la combinación de funciones a las mediciones de intensidad de los canales de referencia y sensibles de la sonda O₂ , al escribir el programa de adquisición de imágenes en el administrador experimental en el software de imágenes utilizado aquí.
   8. Recopile imágenes de la misma sección óptica para referencia y canales espectrales sensibles de la sonda O₂ y, si es necesario, canales de fluorescencia adicionales. Para este protocolo, utilice la sonda MMIR1 con los espectros de referencia rojo (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) e infrarrojo cercano O_2-sensible (exc. = 635 nm, em. = 760 nm).
   9. Repita los pasos 3.2.5-3.2.8 para recopilar un número suficiente de puntos de datos para el análisis estadístico. Para el análisis dinámico de las respuestas celulares en rápida evolución tras el tratamiento con diferentes fármacos, desacopladores mitocondriales o inhibidores de la cadena de transporte de electrones y otros compuestos de acción rápida, utilice el modo de medición de lapso de tiempo (paso 3.2.10).
   10. Realice las mediciones en medios de imagen, a 37 °C con iluminación periódica de la muestra y recoja señales de los fluoróforos de interés (por ejemplo, referencia de sonda O₂ y canales de detección), por ejemplo, cada 10 s durante más de 2 min.
   11. Realice una verificación de enfoque para cada esferoide una vez que se realiza la medición periódica para asegurarse de que no hubo desviación de enfoque durante la imagen. Repita si es necesario. Continúe con el paso 3.3 para el análisis de datos.
       NOTA: Sin estimulación celular y adición de fármacos, se puede realizar una medición de lapso de tiempo para evaluar la fotoestabilidad, en comparación con el colorante de referencia, por ejemplo, fluoresceína, calceína verde AM o tetrametilrodamina metil éster.
3. Presentación de imágenes
   NOTA: Aquí describimos cómo calcular automáticamente O₂ relación de intensidad de sonda (R) en esferoides utilizando la función de análisis de relación en el software de imágenes y aplicar el cálculo de píxel a píxel R para generar imágenes de distribución R de color falso de la sección de microscopía esferoide. R también se puede calcular manualmente a partir de los datos de intensidad de los canales espectrales de referencia y sensibles recogidos de la misma región de interés (ROI) de la imagen esferoide mediante la aplicación de la fórmula simple R = I_Ref/I_sens^24,34. Si no es posible extraer los datos de intensidad de la imagen en bruto en el software de microscopía correspondiente, los datos de intensidad se pueden obtener utilizando programas como ImageJ o Fiji (ver Discusión).
   1. Abra el archivo .vsi con datos de intensidad de sonda O₂ de canales espectrales de referencia y sensibles realizados en modo combinado. Abra la ventana de la función de análisis de ratios desde el menú de medidas. Elija la intensidad del canal de referencia como numerador y la intensidad del canal sensible como denominador para el cálculo de R.
      NOTA: La relación invertida de señales de referencia y sensibles para calcular R también es posible, pero en este caso, R disminuirá con el aumento de O₂.
   2. Aplique la configuración de umbral de intensidad correspondiente a cada canal espectral para restar el fondo de la imagen de intensidad combinada. Siga aumentando los valores umbral hasta que el fondo de la imagen sea uniformemente negro. Aplique el parámetro umbral por igual a todas las imágenes esferoides del conjunto de datos utilizado en el análisis comparativo.
      NOTA: Utilice la ventana de vista previa para optimizar la configuración del umbral observando la imagen R de color falso calculada preliminarmente de los esferoides. Todos los píxeles con una intensidad inferior al valor actual en el campo umbral se eliminarán del análisis R y se presentarán como puntos negros. Después de la aplicación del umbral, solo se debe visualizar el área correspondiente a la fluorescencia esferoide. La estimación preliminar de la intensidad media de fondo (áreas sin esferoides) de los canales espectrales independientes simplifica la elección de un umbral apropiado para la imagen. Además, la aplicación de bordes ROI esferoides, identificados desde la imagen esferoide de luz de transmisión correspondiente a la imagen de fluorescencia fusionada, ayuda a la determinación precisa de los parámetros de umbral para evitar la sustracción excesiva de las intensidades de señal que no son de fondo.
   3. Mantenga la configuración de fondo para las intensidades del numerador y el denominador en 0, ya que el fondo ya se restó con la aplicación del umbral.
   4. Ajuste el factor de escala (Escala) a la imagen de relación hasta que la imagen de vista previa proporcione la resolución deseada del degradado R. Aplique el parámetro de escala por igual a todas las imágenes esferoides del conjunto de datos utilizado en el análisis comparativo.
      NOTA: El parámetro de escala debe ser lo suficientemente grande (al menos 1.000) para garantizar que la imagen R contenga la mayor cantidad de información posible y se pueda ver como un factor de resolución para los datos numéricos de R.
   5. Aplique parámetros ajustados a la imagen esferoide pulsando Aplicar. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen en la ventana de visualización de ajuste desde el menú ventanas de herramientas.
   6. Determine manualmente los límites de vinculación y desvinculación de un histograma de distribución de ratios mediante la opción de escala fija de la ventana Ajustar visualización. Esto determinará el rango de la barra de color falso para la presentación del parámetro R.
      NOTA: Para comparar imágenes esferoides entre diferentes grupos, es importante mantener un rango de barras de color similar para todas las muestras analíticas. Como un rango de cambios del parámetro R puede ser diferente entre grupos, el rango de barras de color falso elegido debe ser universal para los histogramas de distribución en todos los grupos analíticos.
   7. Los esferoides no suelen ser idealmente esféricos, supongamos que el diámetro del esferoide es la línea más larga dibujada a través del centro (a menudo un núcleo hipóxico) del esferoide. Usando la función de regla lineal del menú de medida, determine el diámetro del esferoide. Exportar datos como un archivo de tabla de hoja de cálculo.
   8. Elija el ROI de un tamaño requerido (lo más pequeño posible) y la forma (por ejemplo, redondo) y aplíquelo a la periferia y al núcleo hipóxico del esferoide. Transforme el ROI en el objeto de medición para analizar el R promedio (R-R_p periférico y R-R_c del núcleo) dentro del ROI elegido. Exporte datos en un formato de tabla compatible con hojas de cálculo.
      NOTA: Los esferoides no tienen una distribución idéntica de O₂ entre el grupo y los núcleos hipóxicos no se colocalizan perfectamente con los centros esferoides. Para simplificar y estandarizar el análisis asumimos que las áreas más hipóxicas corresponden al núcleo ideal en el centro del esferoide. R_c medida en estas zonas se aplica para cálculos de rango de gradiente O₂ (R_{p-R c}) y pendiente (R_{p-R c}) /r, donde r (idealmente, una distancia entre el ROI periférico y del núcleo hipóxico) es un radio aproximado del esferoide en μm calculado a partir de las mediciones de diámetro. Opcionalmente, los gradientes esferoides O₂ se pueden presentar como perfiles de línea lineales de alteración del parámetro R (ventana de perfil de línea en el menú de medida) realizados a lo largo del diámetro del esferoide. Estos datos también se pueden exportar como un archivo de tabla de hoja de cálculo.
   9. Aplicar mediciones a cada sección de microscopía de esferoides para obtener el conjunto de datos de diámetros de esferoides, R_c y R_p para realizar cálculos adicionales y comparación estadística. Combine todos los datos en un archivo de hoja de cálculo.
   10. Para el análisis de lapso de tiempo de fotoblanqueo o respuestas dinámicas a diferentes estímulos, aplique el ROI elegido a las mismas coordenadas en cada imagen de un conjunto. Para comparar los parámetros de R, preséntelos como un porcentaje de la R del primer ciclo en un conjunto de imágenes de lapso de tiempo.
   11. Para el análisis de fotoblanqueo, use R de varios ROI para calcular el R promedio en porcentajes para cada ciclo de lapso de tiempo y realizar un seguimiento de los cambios.
   12. Supongamos que el efecto fotoblanqueo no es crítico si hubo menos de un 5% de disminución en la intensidad inicial después de 12 ciclos de iluminación continua. Compare siempre los cambios dinámicos con una curva de fotoblanqueo como control para garantizar la importancia de la respuesta de lapso de tiempo ratiométrica (ver Figura 2A, B).
   13. A partir de los parámetros obtenidos calcule r, (R_{p-R c}) y (R_{p-R c}) / r para esferoides individuales en un conjunto de datos. Analizar la normalidad de la distribución de datos mediante el Kolmogorov-Smirnov o pruebas pertinentes. Elija el método estadístico apropiado para el análisis de datos y proceda con las cifras de presentación de datos.
       NOTA: Los datos aquí presentados se distribuyeron normalmente y se implementó una prueba t independiente a p = 0,05 para la comparación estadística entre grupos de esferoides.

Resultados

La producción de alto rendimiento de los esferoides preteñidos con sonda O₂ utilizando el método de agarosa con micropatrones se ilustra esquemáticamente en la Figura 1C que muestra ejemplos de micropocillos de agarosa sin y con los esferoides preteñidos. La eficiencia de la formación de esferoides en el recubrimiento de agarosa y su forma / esfericidad puede ser específica de la célula. Por ejemplo, las células HCT116 del colon humano nunca formaron estructuras esféricas ideales utilizando el método del micropozo de agarosa, en contraste con la superficie recubierta de lípidos¹⁷, mientras que las hDPSC solas y cocultivadas con HUVEC siempre produjeron esferoides de forma y tamaño altamente reproducibles proporcionales a la composición celular, el número celular inicial y la duración de la formación / crecimiento de esferoides. Todos los tipos de células probadas acumularon eficientemente nanopartículas de sonda O₂ durante la formación de esferoides (Figura 1B) y preservaron esta tinción durante al menos 5 días, lo que permitió su uso para la bioimpresión y el posterior monitoreo de la oxigenación del tejido bioimpreso (Figura 1D).

Figura 1: Principio de la función de sonda O₂ y su aplicación para la tinción de esferoides y la bioimpresión. (A) Un diagrama de Yablonski simplificado, que explica el principio de detección de O₂ por las sondas de nanopartículas fosforescentes (NP). La transferencia de energía al O₂ molecular durante el estado excitado del triplete prohibido (T) conduce a una disminución de la intensidad de fosforescencia inversamente proporcional a la vida útil de la fosforescencia tau, τ (cambios de τ₁ al 0% O₂ a τ₂ al 21% O₂), que es el tiempo entre la excitación al estado singlete (S₁) y su retorno al estado fundamental (G₀)⁴². La medición cuantitativa de O₂ se puede realizar mediante medición ratiométrica o midiendo τ (mediciones de la vida útil de la fosforescencia). (B) Un ejemplo de tinción de esferoides de células madre de pulpa dental humana (hDPSC) teñidos con diferentes tipos de sondas de nanopartículas O₂ , que se muestran en la luz de transmisión, la referencia y los canales de fluorescencia de colorantes sensibles a O₂. La barra de escala es de 100 μm. (C) Esquemas de generación de esferoides preteñidos de sonda O₂ de alto rendimiento utilizando el método de agarosa con micropatrones. De izquierda a derecha: sello de silicio PDMS colocado en un pozo de la placa de cultivo, un ejemplo de un patrón de micropozo en agarosa (aumento 4x), y un ejemplo de esferoides preteñidos MMIR1 producidos a partir de células de cáncer de colon humano HCT116 el día 2 después de la siembra en agarosa micropatronada (aumento 4x). La barra de escala es de 100 μm. (D) De izquierda a derecha: un análisis bioimpreso de construcción de gofres y microscopía de construcción bioimpresa de esferoides preteñidos MMIR1 en los días 1 y 5 después de la bioimpresión. La señal de fluorescencia corresponde al colorante fosforescente sensible a O₂ en nanopartículas MMIR1 (exc. = 635 nm/em. = 760 nm). La barra de escala es de 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la configuración de microscopía descrita (microscopio de fluorescencia de campo ancho convencional equipado con el diodo emisor de luz (LED) como fuente de luz) se encontró que la sonda MMIR1 roja / infrarroja cercana era la mejor en términos de fotoestabilidad de sus tintes de referencia y sensibles con la disminución de menos del 5% en el brillo de su relación de intensidad inicial (R = I_ref / I_sens ) después de 12 ciclos de iluminación continua. Esto permitió utilizar la sonda MMIR1 para el estudio dinámico en tiempo real de la respuesta respiratoria rápida en esferoides hDPSC tras el tratamiento con desacoplador mitocondrial (FCCP) e inhibidor del complejo I de la cadena de transporte de electrones (rotenona) (Figura 2A,B). Encontramos que en los esferoides derivados de células madre, FCCP mostró solo un efecto de desacoplamiento leve con una ligera disminución de la respiración celular dentro de ~ 80 s después de agregar este medicamento, de acuerdo con las características metabólicas previamente informadas de DPSC⁴⁰. Por otro lado, la rotenona inhibió fuertemente la respiración, lo que llevó a la reoxigenación de los esferoides (reflejada como el aumento de la relación de periferia R_p - esferoide y la relación R_c - núcleo esferoide) y la disipación de los gradientes O₂ de la periferia al núcleo dentro de ~ 80 s después de la estimulación (Figura 2A). La semicalibración de dos puntos de la relación de sonda MMIR1 (R) en niveles altos (atmosféricos) y bajos (en presencia de sulfito de sodio y glucosa oxidasa en medios de imagen) O₂ confirmó la disminución de R, relacionada con la disminución de la oxigenación en esferoides con respiración inhibida preliminar por tratamiento de cóctel con antimicina A / rotenona (Figura 2C ), ilustrando cómo la medición de la sonda MMIR1 R se puede aplicar para el monitoreo semicuantitativo de las respuestas de estado estacionario y oxigenación rápida a largo plazo en 3D.

Figura 2: Análisis cinético de la respuesta de la sonda O₂ a diferentes estímulos. (A) Resultado representativo de las imágenes de oxigenación de esferoides hDPSC en reposo y en respuesta a los tratamientos con FCCP y rotenona. La barra de escala es de 100 μm. (B) Respuesta cinética de la relación de intensidad MMIR1 al tratamiento con FCCP y rotenona en comparación con la cinética inicial de la relación de intensidad del fotoblanqueo (%). (C) Cambios en las imágenes de la relación de intensidad de la sonda MMIR1 en esferoides hDPSC en estados oxigenados (adición de antimicina A + rotenona) y desoxigenados (adición de glucosa oxidasa). La barra de color representa la distribución de la relación de intensidad de la sonda O₂ (R = I_ref / I_sens) en toda la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para ilustrar la aplicación de la sonda MMIR1 para imágenes metabólicas en vivo, se realizó el análisis comparativo de gradientes de O₂ en esferoides hDPSC homocelular versus spheroides heterocelulares hDPSC/HUVEC (1:1). Aprovechando la disponibilidad de canales espectrales de fluorescencia azul y verde libres co-tinción con Hoechst 34580 (HXT) y SYTOX Green (SYTOX) se realizó para demostrar la aplicación de la sonda O₂ para estudios multiparamétricos (Figura 3). Utilizando el protocolo automatizado de cálculos de relación de intensidad píxel por píxel proporcionado por el software de imágenes se produjeron imágenes de relación de color falso de distribución R en esferoides, visualizando gradientes de O₂ de periferia a núcleo detectados en tiempo real en todo tipo de esferoides: con la periferia oxigenada y los nichos hipóxicos en el centro (Figura 2 y Figura 3A). Sin embargo, los valores de R_p y R_c, así como la pendiente del gradiente O₂ en las secciones transversales medias variaron para diferentes tipos de esferoides: consulte los perfiles de línea de las secciones transversales medias en los esferoides hDPSC versus hDPSC/HUVEC y hDPSC versus los esferoides hDPSC bioimpresos (Figura 3B,C). Como no había una forma ampliamente aceptada de describir los gradientes de O₂, introdujimos varios parámetros que permitían una fácil comparación y descripción detallada de la oxigenación general de los esferoides: R_p y R_c, y características tales de los gradientes de O₂ como una diferencia entre las zonas oxigenadas e hipóxicas como (R_{p-R c}), y los cambios promedio de oxigenación por μm como (R_{p-R c}) / r, donde r es una distancia entre la periferia y el núcleo hipóxico, correlacionándose en la sección transversal media con el radio esferoide (Figura 3D). La comparación estadística de estos parámetros junto con los datos de células muertas necróticas visualizados por SYTOX en esferoides, nos ayudó a sacar conclusiones preliminares sobre el origen de los gradientes de distribución de O₂ específicos de tipo celular esferoide.

Figura 3: Análisis comparativo de gradientes de oxigenación en esferoides. (A) Ejemplos representativos de microscopía viva de oxigenación (microscopía de fluorescencia ratiométrica de MMIR1) y tinción de células vivas/muertas (Hoechst 34580, HXT, azul y SYTOX Green, SYTOX) en esferoides hDPSC homocelulares antes y después de la impresión, y esferoides heterocelulares hDPSC/HUVEC (1:1). Las hDPSC en todos los tipos de esferoides procedían del mismo cultivo celular. Los esferoides se teñieron previamente con 5 μg / ml de sonda MMIR1 durante 2 días durante su formación, y luego se utilizaron para imágenes o bioimpresión (solo esferoides hDPSC), con un análisis de imágenes posterior el día 1 después de la bioimpresión. Las imágenes en falso color de la relación de intensidad (I_ref/I_sens) de los esferoides teñidos con MMIR1 corresponden a sus gradientes O₂ de la periferia al núcleo. La barra de escala es de 100 μm. La barra de color representa la distribución de la relación de intensidad de la sonda O₂ (R = I_ref/I_sens) en toda la imagen. Los números 1 y 2 de las secciones transversales de diámetro corresponden a los perfiles de intensidad mostrados en B y C. (B,C) Comparación de perfiles de relación de intensidad entre esferoides homogéneos hDPSC versus esferoides heterogéneos hDPSC/HUVEC (B) y esferoides hDPSC homogéneos antes y después de la bioimpresión (C). Se midieron los perfiles para las secciones transversales de los esferoides que se muestran en (A). (D) Representación esquemática de los parámetros utilizados para la descripción de los gradientes O₂ de la periferia al núcleo en esferoides, donde r es un radio de esferoide y R_p y R_c son relaciones de intensidad de la periferia y la región central del esferoide correspondientemente. La barra de color representa esquemáticamente la distribución del gradiente O₂ de niveles altos (rojo) a bajos (azul) en esferoide esférico ideal. (E,F) Análisis comparativo de los gradientes O₂ de la periferia al núcleo (R_{p-R c}) / r en los esferoides hDPSC/HUVEC y hDPSC (E) y en los esferoides hDPSC antes y el día 1 después de la bioimpresión (F). Se realizó un análisis estadístico para una repetición experimental (n = 18-23). Las casillas corresponden a desviaciones estándar. Los asteriscos indican la diferencia estadística entre los grupos (a p = 0,05); ** = p < 0,0005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En comparación con los esferoides hDPSC homocelulares, los esferoides hDPSC/HUVEC tenían gradientes significativamente más pronunciados: valores más altos de (R_{p-R c}) / r parámetro y rango (R_{p-R c}; Figura 3F). Al mismo tiempo, mostraron una mayor oxigenación de la periferia (R_p) y el núcleo (R_c) (Figura 4A, Tabla 1). Curiosamente, también fueron estadísticamente más grandes (Figura 4A, Tabla 1), lo que sugiere que tales diferencias en la oxigenación fueron causadas por sus diferentes perfiles bioenergéticos celulares. Estos datos están de acuerdo con las características metabólicas bien conocidas de las células HUVEC que generalmente tienen una menor actividad respiratoria de las células con la fuerte dependencia de las vías de glucólisis y pentosa-fosfato como las principales fuentes bioenergéticas de ATP y NAD(P)H⁴¹. Al mismo tiempo, el pronunciado gradiente de O₂ de la periferia al núcleo formado en esferoides heterogéneos es probablemente generado por hDPSC en su composición, caracterizado por mitocondrias hiperpolarizadas y cadena activa de transporte de electrones⁴⁰ y, de acuerdo con los resultados sobre la oxigenación de los esferoides hDPSC, tiene una fuerte actividad respiratoria (Figura 3, Figura 4A y Tabla 1 ). Por lo tanto, generalmente una mayor viabilidad de los esferoides hDPSC / HUVEC confirmada por la menor intensidad de la tinción de sus células muertas con SYTOX (Figura 3A) está potencialmente relacionada con sus niveles más altos de oxigenación.

Para ilustrar la aplicabilidad de las imágenes de microscopía viva de la oxigenación de esferoides en biofabricación, se utilizaron esferoides preteñidos con sonda MMIR1 O₂ para la bioimpresión en biotinta GelMA con la siguiente comparación de gradientes de O₂ en esferoides hDPSC antes y el día 1 después de la bioimpresión (Figura 3A, C, F, Figura 4B y Tabla 2). Los esferoides hDPSC bioimpresos tenían una periferia significativamente oxigenada (R_p más alta) en comparación con los esferoides, medidos antes de la bioimpresión, mientras que su oxigenación central tenía valores similares (Figura 4B). Los cambios en su oxigenación periférica afectan el rango (un aumento de (R_{p-R c}) y la pendiente (aumento (R_{p-R c})/r) de sus gradientes O₂ de la periferia al núcleo, que fueron estadísticamente diferentes de los esferoides hDPSC medidos antes de la bioimpresión (Figura 3F y Figura 4B). La tinción de las células muertas fue generalmente más brillante en los esferoides bioimpresos, lo que sugiere que la disminución de la viabilidad de los esferoides está involucrada en la alteración de la oxigenación de los esferoides (Figura 3A).

Figura 4: Análisis comparativo del diámetro y la relación de intensidad de los esferoides teñidos con MMIR1. (A) Comparación entre los esferoides hetero-hDPSC/HUVEC y los esferoides homocelulares hDPSC. (B) Comparación de esferoides homocelulares hDPSC antes y después de la bioimpresión. R_p y R_c - relación de intensidad en la periferia y el núcleo de los esferoides correspondientemente; (R_{p-R c}) - la diferencia en la relación de intensidad, correspondiente al rango de gradiente O₂ en esferoides. Se realizó un análisis estadístico para una réplica experimental (n = 18-23). Las casillas corresponden a desviaciones estándar. Los asteriscos indican la diferencia estadística entre grupos (en p = 0,05), donde * = p < 0,005 y ** = p < 0,0005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de esferoide (N)	Diámetro [μm]	Rp [a.u.]	Rc [a.u.]	Rp-R c [a.u.]	(Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18)	113,2 ± 10,6	0,779 ± 0,034	0,398 ± 0,055	0,982 ± 0,051	0.00677 ± 0.00091
hDPSC (18)	88,1 ± 9,9	0,558 ± 0,025	0,331 ± 0,034	0,227 ± 0,032	0.00520 ± 0.00090
p-valor	1,5 x 10-8 *	1,5 x 10-21 *	1,3 x 10-4 *	1,4 x 10-12 *	9,2 x 10-6 *

Tabla 1. Diámetro esferoide, relación de intensidad en el núcleo (R_c) y periferia (R_p) de los esferoides, la diferencia en la relación de intensidad (R_{p-R c}) y (R_{p-R c}) / r valor en hDPSC /HUVEC heterogéneos y esferoides hDPSC homogéneos. El valor p de una prueba t en N esferoides demuestra una diferencia estadística y también se indica con un asterisco.

Tipo de esferoide (N)	Diámetro [μm]	Rp [a.u.]	Rc [a.u.]	Rp-R c [a.u.]	(Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC (18)	88,1 ± 9,9	0,558 ± 0,025	0,331 ± 0,034	0,227 ± 0,032	0.00520 ± 0.00090
hDPSC bioimpreso (23)	80,9 ± 12,5	0,584 ± 0,023	0,323 ± 0,038	0,261 ± 0,039	0,00658 ± 0,00144
p-valor	0.054	0.0024 *	0.46	9,9 x 10-4 *	6,3 x 10-6 *

Tabla 2. Diámetro esferoide, relación de intensidad en el núcleo (R_c) y periferia (R_p) de los esferoides, la diferencia en la relación de intensidad (R_{p-R c}) y (R_{p-R c}) / r valor en esferoides hDPSC homogéneos antes y después de la bioimpresión. p-valor del análisis estadístico (N esferoides). La diferencia estadística se indica con un asterisco.

Discusión

Importancia. La medición de la oxigenación de los tejidos proporciona una idea del metabolismo celular y específico del tejido, el crecimiento y desarrollo de los tejidos, la viabilidad, la tumorigénesis y la migración celular, y la interacción con microbios y otros patógenos. El método presentado proporciona una nueva herramienta para una mejor comprensión de la fisiología de los cultivos de esferoides multicelulares: análisis de oxigenación con sondas de nanopartículas O₂ ratiométricas y proporciona medios para evaluar la hipoxia, visualizar la dependencia de vías particulares de producción de energía y complementar estudios de modelado y enfoques alternativos de imágenes metabólicas^43,44 en un microscopio de fluorescencia de bajo costo ampliamente disponible. Las mediciones ratiométricas se pueden realizar en un campo ancho de fluorescencia (se prefiere la excitación LED pulsada), confocal de escaneo láser, lámina de luz y microscopios de dos fotones, idealmente equipados con cámaras de incubadora T y O₂. Es importante destacar que la medición de microscopía O₂ presentada se puede combinar fácilmente con el análisis multiparamétrico en vivo de varios parámetros fisiológicos y trazadores celulares (en caso de cultivos de esferoides heterocelulares), viabilidad (tinción viva / muerta), metabolismo lipídico (sondas fluorescentes sensibles a lípidos), dinámica del pH (colorantes, nanopartículas y proteínas fluorescentes) o [Ca²⁺ ], realizado en canales espectrales de fluorescencia disponibles o en paralelo, dando una visión ampliada de la función celular en tiempo real en esferoides, construcciones bioimpresas y posibles trasplantes de tejidos.

Los cultivos de esferoides encuentran uso en estudios de células cancerosas, microambiente de nicho de células tumorales y madre, tumoroides, detección de toxicidad y eficiencia farmacológica, y de hecho como bloques de construcción de tejidos para la biofabricación de tejidos y el autoensamblaje⁴⁵. Se pueden generar a partir de múltiples tipos de células mediante una variedad de enfoques diferentes⁴⁶. La popularidad del modelo esferoide requiere su estandarización desde el punto de vista de la integridad de la investigación y la mejora del análisis de datos, lo que se intentó recientemente mediante el desarrollo de la primera base de datos de esferoides⁸.

Se espera que nuestro protocolo ayude a comprender mejor el metabolismo de los esferoides vivos, estandarice este modelo experimental y, posteriormente, mejore su estabilidad, reproducibilidad y viabilidad a largo plazo dentro de materiales bioimpresos e implantables.

Modificaciones. Este protocolo describe el uso de la superficie de baja adherencia de agarosa con micropatrones (formación basada en micromoldes²⁹) para la generación de alto rendimiento de esferoides cargados con sonda O₂ para el análisis de oxigenación. Los métodos alternativos de producción de esferoides, como la caída colgante, la aplicación de placas de fijación ultra bajas, el recubrimiento lipídico o la formación de flotación libre también son compatibles con el protocolo de carga de sonda O₂ sugerido. El protocolo presentado fue optimizado para esferoides hDPSC y esferoides de co-cultivo de hDPSC con HUVEC (1:1). Otras líneas celulares son ciertamente aplicables ^15,17,47,48; sin embargo, es posible que se requiera cierta optimización del protocolo debido a las diferentes propiedades de adhesión celular, condiciones de cultivo, requisitos de sustrato metabólico y compatibilidad celular con la tinción de nanopartículas. La elección de una sonda sensible a O₂ basada en nanopartículas ratiométrica adecuada debe realizarse en función del modelo celular específico y de acuerdo con las propiedades de fotoblanqueo de la sonda en la configuración de microscopía utilizada (intensidad y tipo de la fuente de luz, sensibilidad espectral de la cámara) y la disponibilidad de filtros de excitación / emisión apropiados para los canales espectrales de referencia y O₂ sensibles correspondientes de la sonda.

Algunas sondas ratiométricas de O₂ están disponibles comercialmente². Alternativamente, se pueden preparar internamente mediante co-precipitación de colorantes de referencia y O₂ sensibles con un polímero como se describe en otra parte 24,25,49. Para cada modelo individual, las pruebas preliminares deben realizarse para determinar la sonda adecuada y las condiciones óptimas de microscopía y para minimizar el efecto del fotoblanqueo de la sonda o el consumo de O₂ fotoinducido durante las mediciones ratiométricas. Estudios previos de nanopartículas sensibles a O₂ demostraron su baja toxicidad celular, lo que permite la aplicación en una amplia gama de concentraciones de tinción (1-20 μg / ml). Como algunas nanopartículas catiónicas pueden autoagregarse durante el almacenamiento, recomendamos mantener su concentración de carga lo más baja posible para minimizar su efecto potencial sobre la formación de esferoides. Opcionalmente, la suspensión de nanopartículas se puede filtrar (0,2 μm) o limpiar por centrifugación (10.000 x g, 5 min) antes de su uso para eliminar todos los agregados de la suspensión.

Aunque el software BioCAD y HMI son específicos para la bioimpresora presentada, este protocolo es aplicable a otras bioimpresoras, ya que se proporciona la preparación de la biotinta, el ensamblaje, el llenado de un cartucho estándar y el diseño de un andamio de hidrogel poroso. Además, los parámetros de bioimpresión, como la velocidad de impresión y la temperatura, deben ser comparables para diferentes bioimpresoras basadas en extrusión. La presión de impresión y el diámetro del puntal dependen del tipo y diámetro de la aguja, la composición de la biotinta, la temperatura y la viscosidad resultante, pero pueden ser un punto de partida para optimizar los parámetros de impresión para bioimprimir biotintas basadas en GelMA con diferentes bioimpresoras, aunque algunas bioimpresoras usan husillos en lugar de presión de aire para extruir la biotinta⁵⁰.

Pasos críticos y solución de problemas. Uno de los pasos críticos es la elección de la sonda O₂ , que se basa en las siguientes consideraciones: en primer lugar, la configuración disponible del microscopio de fluorescencia (es decir, fuente de luz de excitación compatible, filtros para excitación y emisión, sensibilidad de la cámara y transmitancia espectral y apertura numérica del objetivo), que puede limitar el número de sondas disponibles con respecto a su fotoestabilidad, brillo y fototoxicidad potencial. También es importante tener en cuenta que algunos tipos de aceite de inmersión (en el caso de los objetivos de inmersión en aceite) pueden interferir con las señales de fluorescencia roja e infrarroja. Consideramos que las pruebas de fotoestabilidad son muy importantes y que deben realizarse durante la configuración inicial y las pruebas preliminares. Se debe considerar la posible diafonía espectral entre los canales fluorescentes y los diferentes colorantes. De hecho, la potencial toxicidad oscura y fotoinducida de la sonda O₂ y otros colorantes seleccionados, en relación con el modelo celular específico, debe evaluarse durante la optimización del protocolo⁵¹. El problema específico para las nanopartículas puede ser su autoagregación, que puede mitigarse optimizando su concentración de trabajo, la composición del medio de tinción (por ejemplo, el contenido sérico), la sonicación de las nanopartículas antes de mezclarlas con el medio o mediante el uso de células preteñidas y lavadas de O_2-probe para la formación de esferoides en lugar de la carga de la sonda durante la formación de esferoides y el procedimiento de compactación.

No observamos problemas asociados con la profundidad de penetración de la luz con los modelos esferoides descritos, pero esto debe considerarse al elegir las señales de intensidad ratiométrica, el tamaño de las construcciones esferoides y biofabricadas (injertos de tejido) y la optimización de la tinción celular con los respectivos colorantes. Se espera que la sonda MMIR1 que tiene longitudes de onda de emisión rojas e infrarrojas cercanas que coincidan estrechamente proporcione el fondo más bajo y la mejor penetración de luz tisular, en comparación con otras sondas biosensores fluorescentes emisoras de rojo / azul o verde.

La producción y el manejo de imágenes de relación (y potencialmente la desmezcla o deconvolución espectral) se pueden realizar en un software proporcionado por el proveedor o en las opciones de código abierto como ImageJ, Fiji ^52,53, napari (https://napari.org), MATLAB y otros. Un paso crítico será restar el fondo y medir los cambios de intensidad de la señal en un rango lineal.

Calibración de la sonda O₂: La rotenona y la antimicina A son inhibidores de los complejos I y III de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, respectivamente, bloqueando la respiración celular ^54,55,15 e induciendo la disipación de gradientes de O₂ en esferoides y su equilibrio con el O₂ ambiental. Por lo tanto, cambiar la concentración ambiental de O₂ (es decir, 20%, 15%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0% O₂) permitirá la calibración de la intensidad ratiométrica o la vida útil de fosforescencia de la sonda sensible a O₂ en las células. Por lo general, las incubadoras controladas con O₂ no pueden alcanzar el 0% absoluto de O₂ y, en ciertas situaciones, se requiere una prueba rápida de respuesta de la sonda a la desoxigenación. En tales casos, se deben agregar a la muestra 25-100 μg/ml de glucosa oxidasa o una_{mezcla de Na}2 SO₃/K₂HPO₄ (50 mg/ml por cada compuesto para 10x solución en agua destilada). Es importante destacar que si la línea celular tiene un grado significativo de consumo de O₂ no mitocondrial, considere esto al realizar experimentos de inhibición de la respiración y calibración.

Limitaciones e investigaciones futuras. La principal limitación del método propuesto y de la detección ratiométrica en general, es la calibración y conversión de los niveles de relación observados en los niveles reales de O₂ , lo que debido a las diferencias intrínsecas en la configuración de adquisición de hardware e imagen de usuario haría que el instrumento de calibración de la relación y la celda fueran específicos. Es importante destacar que para un microscopio de fluorescencia de campo amplio y la configuración descrita, las imágenes de relación reflejan proyecciones combinadas en lugar de secciones ópticas ideales y la calibración de O₂ no tendría sentido. Por otro lado, mostramos que las mediciones de la relación semicuantitativa proporcionan fenotipado comparativo estadísticamente significativo y fácil de medir de los esferoides producidos a partir de diversas fuentes y que tienen diferencias en la oxigenación.

La investigación futura para hacer que los enfoques de microscopía más accesibles y asequibles diseñados para objetos 3D en vivo como SPIM, lámina de luz, theta, imágenes de vida útil de dos fotones y luminiscencia combinadas con el aprendizaje automático 56,57,58,59,19, ayudarán a llevar las imágenes multiparamétricas de O 2 a aplicaciones aún más cuantitativas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054	También disponible en placas de cultivo celular Sigma
de 12 pocillos, estériles	Greiner bio-one	665-180	Productos similares también están disponibles en Sarstedt, Corning y otras compañías.
Portaobjetos de 12 pocillos, extraíble	Ibidi	81201	También disponible en Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific y otros
Tubos de centrífuga de 15 mL Nerbe	plus	02-502-3001	Productos similares también están disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas
Cartucho de 3 cc, seguro UV, bloqueo Luer	RegenHU	C-033CC-UV	También disponible en CelIink y otros
Descubrimiento 3D Bioprinter	RegenHU	N/A	Bioprinter equipada con un cabezal de impresión basado en extrusión, manto calefactor, lámpara de curado UV-LED, software HMI 3D Discovery (software CAD/CAM con control directo de la máquina) y software BioCAD (versión 1.1-12)
Placas de cultivo celular de 6 pocillos, estériles	Greiner bio-one	657160	También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas
Antimicina A de Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG	Utilizado como inhibidor del complejo III de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, bloqueando la respiración celular
B-Braun Tip Cap, luer lock	RegenHU	TC-BB-B	También disponible en Regemat, Cellink y otros
Placa de cultivo celular Cell view, PS, 35/10 mm, fondo de vidrio, 1 compartimento, estéril	Greiner bio-one	627861	Para microscopía de esferoides bioimpresos
Colágeno de placenta humana, tipo IV	Sigma	C5533	Para la preparación de placas de microscopía recubiertas de colágeno 0,07 mg/ml y 0,03 mg/ml de poli-D-lisina
(+)-glucosa	Merck	8342	Prepare 1M solución madre, 1/100 para la preparación de medio de imagen (concentración final 10mM)
modificado de Dulbecco (DMEM), sin rojo de fenol, glucosa, piruvato y glutamina	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	Para la preparación del medio de imagen Medio de crecimiento de
células endoteliales 2	PromoCell	C-22011	También disponible en Lonza y otros
Suplemento de crecimiento endotelialMix	PromoCell	C-39216	También disponible en Lonza y otros
FCCP, Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona	Sigma-Aldrich	C2920-10MG	Utilizado como desacoplador mitocondrial
Suero fetal bovino	Gibco	10270-098	También disponible en Sigma
GelMA	N/A	N/A	GelMA fue sintetizado por el grupo PBM (Prof. Dr. Peter Dubruel y Sandra Van Vlierberghe, Universidad de Gante) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] pero también están disponibles en Xpect Inx
Glucosa-oxidasa de Aspergillus nige (10000 u)	Sigma-Aldrich	G7141	Se utiliza para probar la respuesta de la sonda a la desoxigenación
GlutaMAX 100x Suplemento	Gibco	35050-038	Dilución 1/100 para la preparación del medio de imagen (concentración final 2mM)
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilución 1/100 para la preparación del medio de imagen (concentración final 10mM)
Hoechst 34580	Invitrogen (Life Technologies)	H21486	También disponible en Sigma, BDBiosciences y otros
Células madre de la pulpa dental humana (hDPSC)	Lonza	PT-5025	También disponible en ATCC u otros proveedores
Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)	Lonza	CC-2517	También disponible en ATCC u otros proveedores
KH2PO4 (fosfato de dihidrógeno de potasio)	Merck	4873	Para la preparación de solución de sulfito de sodio (5 mg/mL de Na2SO3 y 5 mg/mL de KH2PO4). Prepare fresco a partir de 10 veces la solución madre concentrada diariamente.
Li-TPO	N/A	N/A	Li-TPO-L fue sintetizado por el grupo PBM (Prof. Dr. Peter Dubruel y Sandra Van Vlierberghe, Universidad de Gante)  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] pero fotoiniciadores comparables están disponibles en Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium	Gibco	32561-029	También disponible en Sigma y otros
Sellos PDMS impresos en 3D con micropatrones, pocillos con un diámetro 400 y micro; m, espesor, número total de pozos 1585	Autofabricado		Estos sellos fueron fabricados por el Centro de Tecnología de Microsistemas (Profesor Dr. Jan Vanfleteren, Universidad de Gante), pero también se pueden obtener comercialmente de Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Plate micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sulfito de sodio)	Sigma-Aldrich	239321-500G	Para la preparación de solución de sulfito de sodio (5 mg/mL de Na2SO3 y 5 mg/mL de KH2PO4). Prepare fresco a partir de 10 veces la solución madre concentrada diariamente.
Sondas de O2: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+	N/A	N/A	Se pueden preparar ' internamente' utilizando tintes, polímeros y métodos de precipitación disponibles comercialmente [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Algunas nanopartículas están disponibles comercialmente, como se explica en [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x
Estreptococo :P enicilina (10.000 U/mL) / estreptomicina (10.000 μ g/mL) solución 100x	Gibco	15140-122	También disponible en Sigma . Aplicar en dilución 1:100
placas de Petri,	Greiner bio-one	633181	También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas
Pistón para cartucho de 3cc	RegenHU	P-03CC-UV	También disponible en Cellink, Regemat y otros
Poly-D-lisina	Sigma	P6407-5mg	Para la preparación de microscopía recubierta de colágeno de 0,07 mg/ml y 0,03 mg/ml de poli-D-lisina platos
PVDF filtro de jeringa 0.22 y micro; m	Novolab	A35149	También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875-1G	Se utiliza como inhibidor del complejo I de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, bloqueando la respiración celular
Piruvato de sodio (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilución 1/100 para la preparación del medio de imagen (concentración final 1mM)
SYTOX Green	Invitrogen (Life Technologies)	S7559	También disponible en Sigma, Promega y otros
Punta cónica calibre 22 (aguja cónica de PE	Amada Myachi Europe	22K62222	Productos similares también están disponibles en RegenHU, Cellink, Regemat y otros
Matraz de cultivo de tejidos (75 cm2)	VWR	734-2313	Productos similares también están disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas
Ultrapure Agarosa	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Otros tipos de Agarosa como Agarosa de bajo punto de fusión (A-9414, Sigma), Agarosa de uso rutinario (A-9539, Sigma)
Microscopio invertido de fluorescencia de campo amplio	Olympus	N/A	Microscopio de fluorescencia invertida IX81, con control motorizado del eje Z, CoolLED pE4000 (16 canales, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) Cámara cMOS, placa calefactora de vidrio Okolab, software CellSens Dimension v.3 y objetivos aéreos 4x/0.13 UPlanFLN y 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Opcional, para imágenes de alta resolución) 60x/1.0 LUMPLFLN agua