Simulación basada en la estructura y muestreo de los movimientos de proteínas del factor de transcripción a lo largo del ADN desde el paso a escala atómica hasta la difusión de grano grueso

Summary

El objetivo de este protocolo es revelar la dinámica estructural de la difusión unidimensional de la proteína a lo largo del ADN, utilizando una proteína de dominio WRKY del factor de transcripción vegetal como un sistema ejemplar. Para ello, se han implementado simulaciones de dinámica molecular tanto atomísticas como de grano grueso junto con extensos muestreos computacionales.

Abstract

El deslizamiento unidimensional (1-D) de la proteína del factor de transcripción (TF) a lo largo del ADN es esencial para facilitar la difusión del TF para localizar el sitio de ADN objetivo para la regulación genética. La detección de la resolución de par de bases (bp) del TF deslizando o pisando el ADN sigue siendo un desafío experimental. Recientemente hemos realizado simulaciones de dinámica molecular (DM) de todos los átomos que capturan el paso espontáneo de 1 pb de una pequeña proteína TF del dominio WRKY a lo largo del ADN. Basado en la ruta de paso WRKY de 10 μs obtenida de tales simulaciones, el protocolo aquí muestra cómo realizar muestreos conformacionales más extensos de los sistemas TF-DNA, mediante la construcción del modelo de estado de Markov (MSM) para el paso de proteína de 1 pb, con varios números de micro y macro estados probados para la construcción de MSM. Con el fin de examinar la búsqueda de difusión 1-D procesiva de la proteína TF junto con el ADN con base estructural, el protocolo muestra además cómo realizar simulaciones de MD de grano grueso (CG) para muestrear la dinámica a escala a largo plazo del sistema. Tales modelos y simulaciones de CG son particularmente útiles para revelar los impactos electrostáticos proteína-ADN en los movimientos de difusión procesivos de la proteína TF por encima de decenas de microsegundos, en comparación con los movimientos de paso de proteínas de submicrosegundos a microsegundos revelados a partir de las simulaciones de todos los átomos.

Introduction

Los factores de transcripción (TF) buscan que el ADN objetivo se una y regule la transcripción de genes y las actividades relacionadas¹. Aparte de la difusión tridimensional (3D), se ha sugerido que la difusión facilitada de TF es esencial para la búsqueda de ADN objetivo, en la que las proteínas también pueden deslizarse o saltar a lo largo del ADN unidimensional (1D), o saltar con transferencia intersegmental en el ADN 2,3,4,5,6,7.^....

Protocol

1. Construcción del modelo de estado de Markov (MSM) a partir de simulaciones de MD atómica

1. Vía de paso espontánea de proteínas y recolección de estructuras iniciales
   1. Utilice una trayectoria MD de 10 μs de todo átomo⁸ obtenida previamente para extraer 10000 fotogramas de manera uniforme de un camino de paso "hacia adelante" de 1 pb (es decir, un fotograma por cada nanosegundo). El número total de marcos debe ser lo suficientemente grande como para incluir todas las conformaciones representativas.
   2. Prepare la ruta de transición con 10000 fotogramas en VMD haciendo clic en Archivo > Guardar coo....

Results

Deslizamiento acoplado a rotación o paso a paso de 1 pb de WRKY desde la construcción de MSM
Todas las conformaciones de proteínas en el ADN se asignan al movimiento longitudinal X y al ángulo de rotación de la proteína COM a lo largo del ADN (ver Figura 3A). El acoplamiento lineal de estos dos grados indica un paso acoplado a la rotación de la proteína del dominio WRKY en el ADN. Las conformaciones se pueden agrupar en 3 macroestados (S1, S2 y S3) en el MSM. El paso adel.......

Discussion

Este trabajo aborda cómo realizar simulaciones computacionales basadas en la estructura y muestreos para revelar un factor de transcripción o proteína TF que se mueve a lo largo del ADN, no solo en el detalle atómico del paso, sino también en la difusión procesiva, que es esencial para la difusión facilitada de TF en la búsqueda de objetivos de ADN. Para hacer eso, primero se construyó el modelo de estado de Markov o MSM de una pequeña proteína de dominio TF WRKY que avanza para 1-pb a lo largo del ADN poli-A homogéneo, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CafeMol		Kioto	Simulaciones de grano grueso (CG)
GROMACS	Universidad de Groningen Real Instituto de Tecnología Universidad de Uppsala		software de simulaciones de dinámica molecular
Matlab	MathWorks		Software de cálculo numérico
MSMbuilder	Universidad de Stanford		build MSM
VMD	UNIVERSIDAD DE ILLINOIS EN URBANA-CHAMPAIGN Programa		de visualización molecular