La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.
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Artículo de método
In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada
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Resumen
Resumen
La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de los tejidos biológicos en su microambiente natural basado en la vibración molecular intrínseca, proporcionando así una herramienta perfecta para el estudio in vivo de los procesos biológicos a resolución subcelular. Al integrar imágenes de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) en el microscopio SRS, las imágenes in vivo de doble modal de los tejidos pueden adquirir información bioquímica y biofísica crítica desde múltiples perspectivas, lo que ayuda a comprender los procesos dinámicos involucrados en el metabolismo celular, la respuesta inmune y la remodelación de tejidos, etc. En este protocolo de video, se introduce la configuración de un sistema de microscopio TPEF-SRS, así como el método de imágenes in vivo de la médula espinal animal. La médula espinal, como parte del sistema nervioso central, juega un papel crítico en la comunicación entre el cerebro y el sistema nervioso periférico. La vaina de mielina, abundante en fosfolípidos, rodea y aísla el axón para permitir la conducción saltatoria de los potenciales de acción. Las imágenes in vivo de las vainas de mielina en la médula espinal son importantes para estudiar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas y la lesión de la médula espinal. El protocolo también describe la preparación animal y los métodos de imagen TPEF-SRS in vivo para adquirir imágenes biológicas de alta resolución.
Introducción
La microscopía Raman1,2 está emergiendo como un poderoso método libre de etiquetas para obtener imágenes de tejidos biológicos basado en las frecuencias características de varios enlaces químicos en biomoléculas. Debido a su capacidad de imagen no invasiva y bien adaptativa, la microscopía Raman se ha utilizado ampliamente para obtener imágenes de componentes enriquecidos con lípidos en tejidos biológicos como la vaina de mielina3,4,5, los adipocitos6,7 y las gotas lipídicas8,9,10
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Protocolo
Todos los procedimientos en animales realizados en este trabajo se llevan a cabo de acuerdo con las directrices de la Instalación de Animales de Laboratorio de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST) y han sido aprobados por el Comité de Ética Animal de HKUST. Se requiere capacitación en seguridad para el manejo del láser para configurar y operar el microscopio TPEF-SRS. Siempre use gafas de seguridad láser con el rango de longitud de onda apropiado cuando se trate de láser.
1. Configuración del microscopio TPEF-SRS (para el esquema de configuración, consulte la Figura 1
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Resultados
La obtención de imágenes dual-modales in vivo de los axones espinales, así como de las vainas de mielina, se realiza utilizando los ratones transgénicos Thy1-YFPH, que expresan EYFP en las neuronas aferentes del ganglio de la raíz dorsal (Figura 3). Estas neuronas aferentes marcadas transmiten la información sensorial del nervio periférico a la médula espinal, con la rama central ubicada en la columna dorsal de la médula espinal. Con el microscopio TPEF-SRS, la vaina de mielina dens.......
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Discusión
En este protocolo, se describe en detalle la configuración básica del microscopio TPEF-SRS. Para las imágenes SRS, la bomba y los haces stokes se superponen temporal y espacialmente dentro del OPO. Sin embargo, esta superposición puede interrumpirse después de pasar a través del sistema de microscopio. Por lo tanto, la optimización espacial y temporal de la colocalización de la bomba y los haces de Stokes es necesaria y crítica para lograr una imagen SRS óptima. El retardo temporal entre la bomba y el haz de Stokes está .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar y no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong a través de subvenciones 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Comisión de Innovación y Tecnología (ITCPD/17-9), el Esquema de Área de Excelencia del Comité de Becas Universitarias (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) y la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST) a través de la subvención RPC10EG33.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #2 Pinzas | Dumont | 11223-20 | Para laminectomía |
| 10X objetivo | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objetivo | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Cámara | Sonyα 6300 | ||
| Amplificador de corriente | Stanford research | SR570 | |
| Módulos fotomultiplicadores de corriente | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 Espejo dicroico de paso largo de 665 nm | Semrock | FF665-Di02-25x36 | Para dirigir la señal de epifluorescencia al módulo de detección |
| D3 Espejo dicroico de paso corto de 700 nm | Edmund | 69-206 | Para separar el SRS de Ruta de detección de TPEF |
| Crema depilatoria | Veet | ||
| FS1 975 nm filtro de paso corto | Edmund | 86-108 | Para el bloqueo de haces de carreras |
| FS1 Filtro de paso de banda | Semrock | FF01-850/310 | Para el bloqueo de haces de carreras |
| Fs2 Filtro de paso de banda | Semrock | FF01-525/50 | Para seleccionar la señal YFP |
| Fs2 Filtro de paso corto | Semrock | FF01-715/SP-25 | Para el bloqueo del rayo láser de excitación fs |
| Placa de media onda | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| Fotodetector de alta velocidad | MenloSystems | FPD 310-F | Para comprobar la modulación del haz de Stokes |
| Yodo | Betadine | ||
| IR Visor | FJW | FIND-R-SCOPE Visor de infrarrojos 2X Kit modelo 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, recubrimiento AB | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Amplificador de bloqueo | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Aleta motorizada | Thorlabs | MFF101/M | |
| de adquisición multifuncional | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Osciloscopio | Tektronix | TDS2012C | |
| Fotodiodo | APE | Para la detección de señal SRS | |
| Fuente láser de picosegundos | APE | picoEmerald | |
| Divisor de haz polarizador | Thorlabs | CCM1-PBS252/M Medidor | |
| potencia | Newport | 843-R | |
| Braun Salina | |||
| L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Espejo de escaneo | Cambridge Technology | 6215H | |
| Gel de silicona | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:zafiro fs láser | Camaleón Ultra II | ||
| Lente de tubo L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
Referencias
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711(1928).
- Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
- Tian, F., et al.
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Reimpresiones y permisos
