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Artículo de método

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

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DOI:

10.3791/63413

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24 de mayo de 2022

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1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

En este artículo

Resumen

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Resumen

La capacidad de visualizar interacciones fisiológicas complejas y dinámicas entre numerosos tipos de células y la matriz extracelular (ECM) dentro de un microambiente tumoral vivo es un paso importante hacia la comprensión de los mecanismos que regulan la progresión del tumor. Si bien esto se puede lograr a través de las técnicas actuales de imágenes intravitales, sigue siendo un desafío debido a la naturaleza heterogénea de los tejidos y la necesidad de contexto espacial dentro de la observación experimental. Con este fin, hemos desarrollado un flujo de trabajo de imágenes intravitales que combina imágenes de segunda generación armónica de colágeno, fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H y microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) como un medio para compartimentar no invasivamente el microambiente tumoral en dominios básicos del nido tumoral, el estroma circundante o ECM, y la vasculatura. Este protocolo no invasivo detalla el proceso paso a paso que va desde la adquisición de imágenes de lapso de tiempo de modelos de tumores mamarios hasta el análisis de posprocesamiento y la segmentación de imágenes. La principal ventaja de este flujo de trabajo es que explota las firmas metabólicas para contextualizar el microambiente tumoral vivo que cambia dinámicamente sin el uso de etiquetas fluorescentes exógenas, lo que lo hace ventajoso para los modelos de xenoinjerto derivado de pacientes humanos (PDX) y el uso clínico futuro donde los fluoróforos extrínsecos no son fácilmente aplicables.

Introducción

Se sabe que la matriz extracelular (ECM) en el microambiente tumoral se deposita y remodela dinámicamente por múltiples tipos de células para facilitar aún más la progresión de la enfermedad 1,2,3. Estas alteraciones de la matriz proporcionan señales mecánicas y biológicas que alteran el comportamiento celular y, a menudo, resultan en un ciclo continuo de remodelación de la matriz4. La investigación sobre la interacción dinámica y recíproca entre las células tumorales y la matriz extracelular a menudo se lleva a cabo utilizando sistemas tridimensionales (3D) de cultivo in vitro o microfluídicos. Si bien estos enfoques de abajo hacia arriba han demostrado mecanismos de remodelación de la ECM 5,6,7, aumento de la proliferación 8, transición epitelial a mesenquimal 9,10,11,12 y migración e invasión de células tumorales 7,13,14,15,16 , su enfoque se ha centrado principalmente en unos pocos tipos de células (por ejemplo, células tumorales o fibroblastos) dentro de una matriz 3D homogénea en comparación con la diversidad y heterogeneidad de las interacciones presentes dentro de un tejido fisiológico. Además de los sistemas in vitro, la histología tumoral ex vivo también puede proporcionar cierta información sobre estas interacciones célula-célula y célula-ECM17. La inmunohistoquímica tiene la ventaja de poder analizar múltiples tipos de células con respecto a la composición espacialmente heterogénea y la arquitectura de la ECM, pero los puntos finales estáticos del tejido fijo no capturan la naturaleza dinámica de las interacciones entre las células y el microambiente. Las imágenes intravitales han abierto la puerta a interrogar interacciones diversas y dinámicas dentro del contexto fisiológico del microambiente tumoral nativo.

Las capacidades de las imágenes tumorales intravitales están avanzando rápidamente. Las mejoras en el diseño de ventanas de imágenes y las técnicas quirúrgicas para implantar las ventanas han permitido la obtención de imágenes tumorales longitudinales a largo plazo en una variedad de ubicaciones anatómicas (es decir, tumor primario, ganglios linfáticos, sitios metastásicos 18,19,20). Además, la capacidad de la instrumentación óptica para visualizar y recopilar datos en múltiples dimensiones (es decir, espectral, intensidad de fluorescencia espacial y vida útil), y a alta resolución y velocidad (velocidad de video) se está volviendo ampliamente accesible. La tecnología mejorada brinda la oportunidad de explorar cambios rápidos en la señalización celular y la dinámica fenotípica dentro de un entorno fisiológico. Por último, la expansión de las herramientas optogenéticas y la amplia gama de construcciones fluorescentes genéticas permiten el etiquetado de tipos celulares específicos para capturar la migración celular en el microambiente tumoral o el rastreo del linaje celular durante el desarrollo o la progresión de la enfermedad21,22. El uso de estas herramientas en combinación con la tecnología CRISPR / Cas9 brinda a los investigadores la oportunidad de generar modelos animales únicos de manera oportuna.

Si bien todos estos avances hacen que las imágenes intravitales sean un método cada vez más poderoso para explorar las interacciones celulares dinámicas y fisiológicas, todavía existe una necesidad importante de desarrollar estrategias que proporcionen un contexto espacial, temporal y estructural a nivel tisular a estas interacciones biológicas. Actualmente, muchos estudios de imágenes intravitales compensan la falta de puntos de referencia visuales, como los vasos sanguíneos, inyectando tintes fluorescentes en la vasculatura o empleando modelos de ratón que expresan exógenamente proteínas fluorescentes para delinear las características físicas. Los colorantes inyectables y los sustratos como el dextrans fluorescente se utilizan ampliamente para etiquetar con éxito la vasculatura en colecciones intravitales19, 23, 24. Sin embargo, este enfoque no está exento de limitaciones. Por un lado, requiere manipulaciones adicionales del ratón y su utilidad se limita a experimentos a corto plazo. Para estudios longitudinales, el dextrano fluorescente puede ser problemático ya que observamos la acumulación de dextrano en las células fagocíticas o la difusión en el tejido circundante a lo largo del tiempo25. La incorporación de proteína fluorescente exógena en el modelo de ratón se ha presentado como una alternativa al dextrans fluorescente pero presenta limitaciones propias. La disponibilidad y diversidad de fluoróforos exógenos dentro de los modelos de ratón siguen siendo limitadas y costosas de crear. Además, en modelos específicos, como los modelos PDX, las manipulaciones genéticas no son deseables ni posibles. También se ha demostrado que la presencia de proteínas fluorescentes o bioluminiscentes dentro de las células se reconocen como extrañas dentro del ratón, y dentro de los modelos de ratón inmunocompetentes, esto reduce la cantidad de metástasis debido a la respuesta del sistema inmune huésped26,27. Por último, las proteínas fluorescentes exógenas o los colorantes fluorescentes utilizados para el contexto espacial o para segmentar datos posteriores a menudo ocupan rangos primos del espectro de luz que de otro modo podrían usarse para investigar las interacciones fisiológicas de interés.

El uso de la señal intrínseca de la ECM o fluorescencia endógena de las células dentro del tejido representa un medio potencial universal sin etiquetas para segmentar los datos intravitales para un análisis celular y espacial más profundo. La segunda generación armónica (SHG) se ha utilizado durante mucho tiempo para visualizar el ECM28. Con el posterior desarrollo de herramientas importantes para ayudar en la caracterización de la organización de la fibra 29,30,31, es posible caracterizar el comportamiento celular en relación con la estructura local de ECM. Además, la autofluorescencia del metabolito endógeno, NAD(P)H, proporciona otra herramienta sin etiquetas para compartimentar el microambiente tumoral in vivo. NAD(P)H fluorescencia intensamente en las células tumorales y se puede utilizar para discriminar los límites del nido tumoral en crecimiento de su estroma circundante21,32. Por último, la vasculatura es una estructura fisiológica importante en el microambiente tumoral y el sitio de interacciones clave específicas del tipo celular 33,34,35. La excitación de los glóbulos rojos (RBC) o plasma sanguíneo se ha utilizado para visualizar la vasculatura tumoral, y utilizando la excitación de dos o tres fotones (2P; 3P) se ha demostrado que la medición de las tasas de flujo sanguíneo es posible36. Sin embargo, mientras que los vasos sanguíneos más grandes son fácilmente identificables por sus firmas de fluorescencia endógena, la identificación de vasos sanguíneos pequeños sutiles, variables y menos fluorescentes requiere más experiencia. Estas dificultades inherentes dificultan la segmentación óptima de la imagen. Afortunadamente, estas fuentes de fluorescencia endógena (es decir, glóbulos rojos y plasma sanguíneo) también se pueden medir mediante imágenes de fluorescencia de por vida37, que capitalizan las propiedades fotofísicas únicas de la vasculatura y representan una adición útil a la creciente caja de herramientas intravital.

En este protocolo, se describe un flujo de trabajo para la segmentación de imágenes intravitales de cuatro dimensiones (4D) utilizando explícitamente señales intrínsecas como la fluorescencia endógena y SHG desde la adquisición hasta el análisis. Este protocolo es particularmente pertinente para estudios longitudinales a través de una ventana de imágenes mamarias donde la fluorescencia exógena puede no ser práctica o posible, como es el caso de los modelos PDX. Los principios de segmentación descritos aquí, sin embargo, son ampliamente aplicables a los usuarios intravitales que investigan la biología tumoral, el desarrollo de tejidos o incluso la fisiología normal de los tejidos. El conjunto de enfoques de análisis reportado permitirá a los usuarios diferenciar el comportamiento celular entre regiones de configuraciones de fibra de colágeno alineadas o aleatorias, comparar números o comportamientos de células que residen en regiones específicas del microambiente tumoral y mapear la vasculatura al microambiente tumoral utilizando solo señal intrínseco o sin etiquetas. Juntos, estos métodos crean un marco operativo para maximizar la profundidad de la información obtenida de las imágenes intravitales 4D de la glándula mamaria al tiempo que minimizan la necesidad de etiquetas exógenas adicionales.

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Protocolo

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison. El bienestar y el manejo del dolor en todos los experimentos con animales es primordial. Por lo tanto, se hace todo lo posible para asegurarse de que el animal esté cómodo y bien cuidado en cada paso del procedimiento.

1. Generación de la ventana de imagen mamaria (MIW)

  1. Para construir la ventana de imágenes mamarias, fabrique un anillo de 14 mm de acero inoxidable de grado quirúrgico.
  2. Limpie el marco de la ventana mecanizada con una solución caliente de detergente de limpieza al 5%, enjuague durante 10 minutos con agua desionizada (DI) corriente, sumérjase en etanol al 100% durante 10 minutos y luego séquelo bajo una lámpara de calor. Autoclave el marco MIW seco y guárdelo para su uso posterior.
  3. Prepare el vidrio de la cubierta MIW de la siguiente manera: Remoje el vidrio de la cubierta redonda # 1.5 de 12 mm en etanol al 100% durante 10 minutos, seque bajo una lámpara de calor y luego asegúrelo al marco MIW de metal con adhesivo de cianoacrilato. Curar el adhesivo durante la noche.
  4. Limpie el MIW ensamblado del exceso de adhesivo con un hisopo empapado de acetona y límpielo sumergiéndolo en etanol al 70% durante 10 minutos. Deje que la ventana limpia se seque. Prepare el MIW con anticipación y guárdelo en una placa de Petri estéril antes de la implantación quirúrgica.

2. Implantación quirúrgica del MIW

  1. Herramientas quirúrgicas en autoclave y desinfecte las superficies con etanol al 70% antes de comenzar la cirugía para la implantación de la ventana.
  2. Realice la cirugía en una mesa desinfectada con una manta de calentamiento cubierta con un campo estéril. Coloque la manta de calentamiento de tal manera que la temperatura medida en la parte superior del campo estéril sea de 40 ° C.
  3. Use iluminación fría auxiliar para ayudar a prevenir el secado de los tejidos. Use lupas para facilitar el procedimiento quirúrgico. Use EPP que consista en una bata de laboratorio estéril de un solo uso, mangas quirúrgicas, guantes, protección ocular y máscara facial según lo recomendado por las mejores prácticas quirúrgicas.
  4. Anestesiar al ratón utilizando una máquina vaporizadora de anestesia con un ajuste de isoflurano de 2.0% y un caudal de oxígeno de 2.0 L/min. Administrar analgésico (10 mg/kg de meloxicam) mediante inyección subcutánea.
    NOTA: Proporcione dosis adicionales dentro de las primeras 24 h, preferiblemente cada 8-12 h durante los primeros 2 días después de la cirugía.
  5. Una vez anestesiado (confirmado por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie), aplique un gel hidratante para los ojos para evitar el secado de los ojos. Use una crema depilatoria para eliminar el pelaje en el sitio de la cirugía (4ª glándula mamaria inguinal) seguido de enjuague con una gasa estéril empapada en agua.
  6. Prepare el sitio quirúrgico depilado para la cirugía desinfectando la superficie de la piel con 3 exfoliantes alternativos de betadina y etanol.
  7. Para comenzar la cirugía, levante suavemente la piel sobre la 4ª glándula mamaria número 4 con fórceps. Una vez que la piel se aleje de la pared del cuerpo, retire una sección de ~ 1 mm de la capa dérmica en la punta de los fórceps con microcijeras quirúrgicas. Si se produce sangrado, aplique una presión suave con una gasa estéril hasta que el sangrado se detenga.
    NOTA: En general, los tumores más grandes tienen un mayor potencial de sangrado que los tumores más pequeños o los tejidos normales.
  8. Separe la glándula mamaria de la capa dérmica con movimientos suaves de los fórceps en la abertura quirúrgica para evitar cortar la glándula subyacente.
  9. Cree una incisión de 10 mm y libere la glándula mamaria de la capa dérmica en la periferia para que las suturas se puedan colocar sin penetrar en la glándula mamaria. Agregue PBS para cubrir la glándula/tumor expuesto y para evitar el secado.
  10. Cree una sutura de cuerda de bolso a lo largo de la periferia de la abertura usando una sutura trenzada de seda 5-0. Inserte un borde del MIW para que la capa dérmica se enganche en la muesca receptora del MIW.
  11. Estire suavemente el epitelio en el lado opuesto del MIW y empuje el MIW metálico en su lugar de tal manera que la capa dérmica enganche completamente la muesca receptora alrededor de toda la circunferencia miW. Apriete la cuerda del bolso para dibujar la capa dérmica en la muesca y átela para asegurar completamente el MIW.
  12. Agregue un antibiótico tópico a la capa dérmica en el MIW y monitoree continuamente al ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. Coloque el ratón implantado por MIW por separado en una cama blanda con un iglú colocado en la jaula y permita que el ratón se recupere durante 48 horas antes de la toma de imágenes.

3. Posicionamiento y mantenimiento del ratón en la etapa del microscopio para la obtención de imágenes

  1. Configure la cámara de calentamiento en el escenario del microscopio. Utilice un sistema de aire forzado ajustado a 30 °C o cualquier otro sistema similar. Use un calentador objetivo para evitar la deriva en el enfoque z. Permita que el sistema llegue al equilibrio durante al menos 1 h antes de la toma de imágenes.
    NOTA: Los ratones anestesiados son incapaces de mantener adecuadamente su temperatura corporal y, por lo tanto, es necesario tener un ambiente calentado para cualquier adquisición de lapso de tiempo. El calentador objetivo ayuda a combatir los efectos de la expansión térmica, un fenómeno que causa la deriva en el enfoque z a medida que la lente objetivo y el tejido que se visualiza llegan al equilibrio térmico.
  2. Una vez que la cámara de calentamiento del microscopio se haya estabilizado a 30 °C, anestesiar al ratón receptor con ajustes de la máquina de anestesia de 2% de isoflurano y un caudal de oxígeno de 2 L/min.
  3. Después de sedar al ratón (confirmado por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie), limpie el exterior del vidrio MIW con un aplicador de algodón y un limpiador de vidrio, agregue ungüento para los ojos para evitar el secado e inserte un catéter de vena de la cola si es necesario.
  4. Para mantener una hidratación adecuada, administre una inyección inicial de 0,5 ml de PBS por vía subcutánea o 100 μL a través del catéter de la vena de la cola. Repetir cada 2 h durante la duración de la sesión de imagen.
  5. Una vez que el ratón se haya preparado correctamente, configure el microscopio para obtener imágenes. Para reducir la evaporación durante las mediciones de lapso de tiempo, use un gel a base de agua en lugar de agua para el medio de inmersión. Esto debe hacerse antes de colocar el mouse en el escenario. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de los componentes ópticos.
  6. Coloque el ratón en el escenario del microscopio, ajuste la manguera de isoflurano y presione el collar del MIW en un orificio de recepción de 14 mm en el inserto del escenario para estabilizar las imágenes. Enfoque el campo de imágenes utilizando los oculares del microscopio y use iluminación de campo brillante para observar la vasculatura con el flujo sanguíneo.
  7. Compruebe la estabilidad del campo de visión. Si hay artefactos de movimiento respiratorio, aplique una compresión suave en la parte posterior de la glándula con un pequeño bloque de espuma y un trozo de cinta adhesiva similar a una cintura. Después de aplicar la compresión, verifique que el flujo sanguíneo se mantenga en todo el campo de visión.
  8. Ajuste periódicamente los niveles de isoflurano en incrementos del 0,25% durante la sesión de imágenes para mantener un nivel adecuado de sedación contando manualmente la respiración animal.
  9. Mantenga una tasa de 36-40 respiraciones por minuto (rpm) para mejorar la longevidad animal y las imágenes ópticas. Las tasas de respiración más bajas pueden hacer que el ratón no sobreviva al experimento, mientras que las tasas de respiración superiores a 60 rpm pueden resultar en una sedación deficiente, lo que puede aumentar la respiración y los artefactos de movimiento en los datos de la imagen.

4. Configuración para imágenes intravitales 4D, basadas en intensidad y sin etiquetas del comportamiento dinámico de las células

  1. Una vez que el ratón esté sedado y colocado de forma segura en la etapa de microscopio invertido, comience a localizar las regiones de interés.
  2. Usando una fuente de luz dirigida al MIW, use los oculares del microscopio para identificar áreas potenciales para la investigación. Agregue y guarde las posiciones x, y en el software para volver a estas posiciones.
    NOTA: Los detalles finos del tumor no serán fácilmente visibles con este tipo de iluminación. El objetivo es simplemente identificar regiones para una mayor investigación. La atención se centra en ver la vasculatura y el flujo sanguíneo.
  3. Después de guardar varias posiciones en el software, obtenga una vista previa de los campos de visión elegidos utilizando la excitación de 890 nm y el cubo de filtro FAD / SHG. Utilice un tiempo máximo de permanencia de 4 μs con menor potencia y alto ajuste de PMT. El objetivo es obtener una vista previa de los campos de visión sin sobreexponer el tejido a una luz láser excesiva.
  4. Una vez que se hayan establecido los niveles de potencia adecuados, configure las pilas z. Observe la aparición de abundantes fibras de colágeno (SHG) a 20-50 μm debajo de la superficie de vidrio del MIW. El colágeno se volverá menos prevalente a medida que el microscopio se seccione más profundamente en el tumor (Figura 1B). Los vacíos en el SHG revelan la ubicación de las masas tumorales.
  5. Coloque la rebanada z superior, debajo de la capa de células solitarias donde aparecen las primeras fibras de colágeno a ~ 50-100 μm. Establezca la rebanada z inferior en ~ 250 μm, donde las fibras se desvanecen y la señal pobre domina. Repita esto para todas las posiciones x-y guardadas.
  6. Una vez que se establece el rango z-stack, aumente el tiempo de permanencia (hasta 8 μs) y optimice la configuración de potencia y detector. Optimice los niveles de potencia según sea necesario para excitar el tejido para cada experimento. El uso de potencias de hasta 90 mW a 750 nm o 70 mW a 890 nm en la apertura posterior del objetivo está dentro de un rango aceptable.
    NOTA: La profundidad de la imagen, la cantidad de dispersión dentro del tejido, las características objetivas y la sensibilidad del detector afectarán significativamente la cantidad de energía necesaria para obtener una imagen.
  7. Ajuste los intervalos de tiempo de acuerdo con los objetivos experimentales. Comience con intervalos de 10 minutos entre los puntos de recolección para la mayoría de las películas de migración intravital.
  8. A pesar de que la excitación 2P es suave para las células y los tejidos, tenga en cuenta los signos de fototoxicidad, como el sangrado celular o el rápido aumento de la autofluorescencia, y el fotoblanqueo excesivo. Reduzca la potencia del láser o aumente los intervalos de lapso de tiempo según lo indiquen las condiciones.

5. Imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) de NAD(P)H

  1. Mientras conserva las posiciones x-y de las adquisiciones de lapso de tiempo, configure el microscopio para recolectar una pila FLIM. Inserte un filtro 440/80 en un soporte de filtro frente al detector GaAsP y ajuste el voltaje del detector GaAsP a 800 en el software. Apague las luces de la habitación cuando los detectores estén encendidos.
  2. En el software, cambie de la imagen de intensidad basada en galvanómetro a un modo de imagen FLIM.
  3. Con el fin de identificar y enmascarar la vasculatura, establezca la resolución en 512 x 512 píxeles. Para recopilar información metabólica complementaria, establezca la resolución en 256 x 256 píxeles para aumentar la resolución temporal de la firma de por vida. Ajuste el tiempo de permanencia a 4 μs y ajuste el láser a 750 nm.
  4. Inicie el escaneo de vista previa y comience a ajustar la potencia del láser. Ajuste la potencia del láser hasta que la lectura para el discriminador de fracción constante (CFD) esté entre 1 x 105 y 1 x 106. No exceda 1 x 106 , ya que esto dará como resultado la acumulación de fotones y malos resultados generales.
  5. Una vez establecido el nivel de potencia, establezca el tiempo de integración entre 90 s y 120 s e inicie la colección FLIM. Adquirirá fotones del campo de visión durante el tiempo asignado.
  6. Opcional: Después de que se hayan realizado todas las colecciones necesarias y se haya retirado el ratón del escenario, recoja una función de respuesta del instrumento (IRF). Mida el IRF mediante la obtención de imágenes de la superficie de los cristales de urea disponibles comercialmente en un plato con fondo de vidrio con los mismos parámetros y la configuración utilizada para obtener imágenes del tejido.
    NOTA: El IRF tiene en cuenta cualquier retraso o reflexión debido a la configuración electrónica u óptica. El IRF está involucrado en todas las adquisiciones de FLIM, y desconvolverlo a partir de los datos puede mejorar la precisión de las curvas de desintegración de fluorescencia calculadas. Dicho esto, los IRF calculados a menudo pueden replicar razonablemente la calidad de las curvas de desintegración de fluorescencia a partir de IRF medidos. Es una buena práctica medir el IRF hasta que se haya determinado que el IRF calculado producirá ajustes equivalentes de las curvas de desintegración y se aproximará adecuadamente a los resultados del IRF medido.

6. Análisis de imágenes NADH Lifetime

  1. Abra el software FLIM e importe la imagen de por vida NAD(P)H desde el conjunto de datos. Para obtener más detalles sobre cómo utilizar correctamente el software, consulte los manuales de vida útil de los fluorescentes (consulte la Tabla de materiales).
  2. Para comenzar, defina los parámetros del modelo en el software. En la barra de menús, haga clic en Opciones > modelo. Seleccione las siguientes casillas: Configuración > decaimiento multiexponencial, Método de ajuste > MLE, Agrupación espacial > cuadrado, Umbral > pico y marque Corregir desplazamiento antes de calcular la imagen.
  3. En la barra de menús, haga clic en Color > A1% en el menú desplegable. En el lado derecho de la ventana, defínalo como un ajuste de tres componentes. Establezca el tamaño de la > 3.
  4. Ajuste el umbral > ~10. Vuelva a evaluar la precisión del umbral después de que se haya calculado la matriz de desintegración por primera vez.
  5. Fijar el τ1 a 200 ps. Esto representa la corta vida útil de los glóbulos rojos. Trate de encontrar el valor que mejor coincida con múltiples puntos en el vaso sanguíneo más grande, que se puede ver en la imagen de intensidad. Fijar el τ2 a 1200 ps. Esto representa la larga vida útil de los glóbulos rojos.
    NOTA: Los valores establecidos son solo el punto de partida. Los valores deberán optimizarse para resaltar más la vasculatura. En la mayoría de los casos, pero no siempre, estos valores disminuirán.
  6. En Calcular en la barra de menús, seleccione Matriz de decaimiento. Esto generará una primera A1% de imágenes de por vida con la vasculatura teniendo valores altos. Use el cursor (punto de mira) para pasar el cursor sobre la vasculatura. Sistemáticamente y uno a la vez, flote (desmarque la casilla Fijar ) el τ1 y el τ2. Registre estos valores, ya que ayudarán a optimizar los parámetros fijos.
    NOTA: El objetivo no es necesariamente obtener los valores más precisos en la imagen, sino más bien maximizar la disparidad entre la vasculatura y el tejido sin disminuir drásticamente el área identificada como vasculatura.
  7. Una vez identificados los parámetros apropiados para τ1 y τ2, en la barra de menús seleccione Calcular > procesamiento por lotes. Asegúrese de que la mayoría de los ajustes sean similares entre los segmentos z.
  8. Asegúrese de verificar que no haya una configuración muy diferente a las demás. Si es así, ajuste el cambio primero e inténtelo de nuevo. Si el problema persiste, vuelva a ajustar con nuevos parámetros. Un cambio incorrecto puede ser una gran causa de ruido en los ataques y puede aumentar los valores de A1% en las regiones tumorales adyacentes.
  9. En la pestaña de menú, guarde los archivos y luego exporte los archivos A1%. Cargue estos archivos en ImageJ para enmascarar y segmentar.

7. Segmentación de la imagen de la vasculatura

  1. Abra ImageJ e importe la imagen A1% como una imagen de texto. Repita esto para todas las imágenes dentro de la pila.
  2. Con todas las imágenes de A1% abiertas, seleccione Image > Stack > Z-Project. Utilice la proyección de intensidad máxima y guarde las imágenes. Consulte Datos complementarios 1 para obtener una imagen representativa.
  3. Vaya a Plugins > Segmentación. Seleccione el plugin de segmentación WEKA entrenable38.
  4. Una vez que se abra la ventana WEKA, use la configuración predeterminada y comience a entrenar el software creando dos clases y líneas de rastreo sobre la vasculatura (regiones altas A1%) y no vasculatura (regiones bajas A1%).
  5. Continúe agregando nuevos rastros a las dos clases hasta que el software identifique consistentemente las regiones altas de A1% de la vasculatura mientras elimina cualquier región más alta de ruido de fondo. Consulte Modelo suplementario para el modelo de clasificador representativo.
  6. Una vez que se produce la imagen clasificada, haga clic en Imagen > Tipo > 8 Bits. Umbral de la imagen y crear una máscara. Si la imagen con umbral aún necesita limpiarse más, utilice la función Analizar partículas .
  7. Ajuste el tamaño y la circularidad hasta que se excluyan las regiones más pequeñas y circulares de la imagen umbralizada. Se obtiene una máscara limpia con solo la vasculatura y muy poco fondo.
  8. Haga clic en Editar > selección > Crear selección. Transfiera la selección al administrador de ROI haciendo clic en Analizar herramientas de > > administrador de ROI.
  9. Duplicar la imagen clasificada. Proceda a Procesar > binario. Para expandir la máscara y definir la distancia desde la vasculatura que se incluirá en la segmentación de la imagen, seleccione Dilatar. Repita hasta que la máscara se haya expandido al rango deseado. Registre esta región de interés (ROI) en el administrador de ROI.
    NOTA: El objetivo de este paso es cuantificar la cantidad o el comportamiento dentro de una cierta proximidad del vaso sanguíneo (por ejemplo, el número de células presentes dentro de X μm de los vasos sanguíneos). La cantidad de dilatación requerida está totalmente determinada por la cuestión científica.
  10. Para cuantificar el número de celdas dentro de las regiones restrictivas, seleccione la ventana (imagen/canal) de interés. Esta puede ser cualquier ventana que comparta el mismo campo de visión que la máscara vascular. Aplique ambos ROI utilizando la función XOR del menú desplegable.
    NOTA: Esta operación medirá los elementos dentro de la distancia deseada de la vasculatura, excluyendo la vasculatura en sí. Este enfoque combinado de ROI se puede utilizar para medir una multitud de parámetros, como la intensidad, el número de células o la migración.

8. Segmentación de la imagen del nido tumoral

  1. Abra la imagen NADH desde un escaneo de alta resolución de intensidad o una colección FLIM en ImageJ.
    NOTA: Esto se puede hacer en cortes z individuales, pilas completas o aplicarse a proyecciones z de algunos segmentos.
  2. Vaya a Plugins > Segmentación. Seleccione el plugin de segmentación WEKA entrenable.
  3. Una vez que se abra la ventana WEKA, use la configuración predeterminada y comience a entrenar el software en dos clases de regiones altas de NADH y regiones bajas de NADH. Las regiones altas de NADH tendrán un patrón muy discernible de células con núcleos y el software lo identificará fácilmente.
  4. Continúe alternando hacia adelante y hacia atrás con la superposición para refinar el algoritmo con entrenamiento adicional hasta que reconozca todas las regiones del tumor según lo determinado por el ojo y el conocimiento previo de la morfología del tumor. Este es un proceso iterativo.
  5. Una vez que el algoritmo reconozca todas las regiones del tumor, seleccione el botón Crear resultado . Esto producirá una nueva imagen. Duplica esta imagen.
  6. Seleccione la primera imagen duplicada y conviértala en una imagen de 8 bits seleccionando Tipo de > de imagen > 8 bits. Umbral de esta imagen para crear una máscara binaria. Luego cree una selección y transfiérala al administrador de ROI. Estos ROI definirán el estroma.
  7. Seleccione el segundo de la imagen duplicada y conviértalo en una imagen de 8 bits. Invierta esta imagen seleccionando Imagen > Editar > Invertir y, a continuación, umbral esta imagen para crear una máscara binaria. Una vez más, cree una selección y transfiérala al administrador de ROI. Este ROI definirá el nido tumoral.

9. Segmentación de imágenes por organización o alineación de fibras

  1. Para comenzar, abra las imágenes SHG, prepare cualquier proyección z y evalúe la necesidad de cualquier preprocesamiento. Para obtener buenos resultados, se requieren imágenes de alta calidad con fibras discernibles y bajo nivel de ruido.
  2. Opcional: Para el preprocesamiento en ImageJ para aumentar la señal a ruido (SNR) del canal SHG, reste el fondo mediante una sustracción de bola rodante. Para la mayoría de las aplicaciones, use una resta de bola rodante entre 20 píxeles y 50 píxeles. A continuación, suaviza la imagen y guárdala.
  3. Abra el complemento OrientationJ y establezca los parámetros de procesamiento. En la ventana OrientationJ, defina el tamaño de la ventana tensorial local. Para obtener una imagen de 20x de esta densidad de fibra, establezca 10 píxeles en 15 píxeles como punto de partida.
  4. Seleccione Spline cúbico como modelo de degradado y marque el cuadro De inspección de color. Defina la encuesta de color. Establezca el tono y la saturación como coherencia y, a continuación, defina el brillo como imagen original, pulse Ejecutar.
  5. El archivo de salida del plugin es RGB colormap. Ajuste el valor de la ventana tensorial local hasta que las regiones alineadas, según lo determinado por el ojo, se resalten correctamente con tonos azules y magenta.
  6. Una vez que la imagen de salida sea satisfactoria, separe esta imagen RGB en 3 canales. Seleccione Imagen > color > canal dividido.
  7. Para mejorar la apariencia de las regiones alineadas con el fin de enmascarar, utilice la calculadora de imágenes seleccionando Procesar > Calculadora de imágenes. Con este operador, reste la imagen verde de la imagen azul. Para una máscara más restrictiva, reste la imagen verde de la imagen roja. Para regiones aleatorias, reste el canal azul del canal verde.
  8. Umbral de la imagen resultante mediante el algoritmo Moments . En la mayoría de los casos, esto no debería necesitar más ajustes. Sin embargo, ajuste si es necesario. Esto producirá una imagen binaria.
  9. Una vez hecha la imagen binaria, rellene los taladros seleccionando Procesar > binario > Rellenar taladros entre fibras y redondee los límites de la máscara con un filtro mediano. Un filtro mediano de 10 es un buen punto de partida, ajústelo para que se ajuste bien a los datos. Inspeccione manualmente la máscara para ver si hay acuerdo y elimine cualquier ROI que sea erróneo.
  10. Una vez que la máscara sea satisfactoria, cree una selección seleccionando Editar > Selección > Crear selección. Transfiera esta selección al administrador de ROI.

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Resultados

La instalación del MIW y la planificación experimental básica son los primeros pasos en este proceso. Este diseño y protocolo MIW en particular son más susceptibles a estudioslongitudinales 19 y se han utilizado con éxito con microscopios verticales e invertidos. En este caso, se utilizó un microscopio invertido, ya que ha dado como resultado una mayor estabilidad de la imagen de la glándula mamaria con menos artefactos respiratorios. En la Figura 1A, proporcionamos l...

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Discusión

La imagen intravital 4D es una herramienta poderosa para investigar interacciones fisiológicas dinámicas dentro del contexto espacial y temporal del microambiente tumoral nativo. Este manuscrito proporciona un marco operativo muy básico y adaptable para compartimentar las interacciones celulares dinámicas dentro de la masa tumoral, el estroma adyacente o dentro de la proximidad a la red vascular utilizando solo señales endógenas de segunda generación armónica o autofluorescencia NAD(P)H. Este protocolo proporciona un mét...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer las subvenciones del NCI R01 CA216248, CA206458 y CA179556 por financiar este trabajo. También nos gustaría agradecer al Dr. Kevin Eliceiri y su grupo de imágenes por su experiencia técnica en el desarrollo temprano de nuestro programa intravital. También agradecemos al Dr. Ben Cox y a otros miembros del Grupo de Fabricación Eliceiri en el Instituto Morgridge de Investigación por su diseño técnico esencial durante las primeras fases del MIW. Ellen Dobson ayudó con conversaciones útiles sobre la herramienta de segmentación WEKA entrenable ImageJ. Además, nos gustaría agradecer a la Dra. Melissa Skala y a la Dra. Alexa Barres-Heaton por el uso oportuno de su microscopio. Por último, nos gustaría agradecer a la Dra. Brigitte Raabe, D.V.M, por todas las discusiones reflexivas y consejos sobre nuestro manejo y cuidado del ratón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#1.5 Cubierta de vidrio redonda de 12 mmWarner Instruments# 64-0712Construcción MIW
Jeringa de 1,0 mL para inyección SQJeringaBD309659
objetivo 20xZeiss421452-988inmersión en agua
27G para inyección SQAgujaCovidien1188827012
objetivo 40xNikonMRD77410Inmersión en agua
5-0 sutura trenzada de sedaEthiconK870Sutura para implantación de MIW
Gel de lágrimas artificialesAkornNDC 59399-162-35Gel para ojos
Solución de Betadine, 5%Fisher ScientificNC1558063antiséptico
con punta de algodónFisher Scientific23-400-101
Adhesivo de cianoacrilatoLoctite1365882construcción MIW
dextrano fluorescenteSigmaT1287-50mgmarcaje intravenoso de pinzas de vasculatura
Mckesson.comMiltex #18-782acero inoxidable, 4 pulgadas, tubo fotomultiplicador de GaAsP curvo
Hamamatsu 
manta térmicaCARA 72 almohadilla térmica  038056000729seleccionable por temperatura
vida útil fluorescente de construcción
https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks base de microscopio invertidoNikon
IsofluranoAkornNDC 59399-106-01Anestesia
Scientific16-000-125Limpieza MIW
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10analgésica
Scientific Commodities INC.  Cabezal de escaneo multifotónico BB31695-PE/1
Bruker Ultima IICabezal de escaneo multifotónico y plataforma de imagen
NADH Filtro FLIMChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS 339826Crema depilatoria
calentador de objetivoTokai HitSTRG-WELSX-SET
Filtro SHG/FADChroma320740ET450/ 40m-2P
Limpiador de cristales SparkleAmazon.comB00814ME24Limpiador de cristales para tablero
de conteo de fotones MIW SPC-150implantado Lámpara quirúrgica Becker and Hickl
FAJB06XV1VQVZLuz de cuello de cisne LED magnética
Microtijeras quirúrgicasExcelta366inoxidable, 3 pulgadas
Pomada antibiótica tripleActavis PharmaNDC 0472-0179-34Catéter antibiótico
TVAguja BD30G personalizada: 305106Catéter para inyección de TV
dos fotonesChroma320282ET585/65m-2P
Láser de dos fotonesCharmeleonláser multifotónico sintonizable
ParkerPKR-03-02Gel de inmersión en agua
Urea cristalesSigmaU5128-5GOpcional: FLIM IRF
Aguja de Surgery aplicador Cámara de calentamiento manual de casera Becker and Hickl Liqui-Nox Fisher Micro manguera Filtro de coherente Gel de ultrasonido

Referencias

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