La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia
En este artículo
Resumen
Resumen
La membrana corioalantoidea (CAM) de un embrión aviar es una membrana delgada y extraembrionaria que funciona como un órgano respiratorio primario. Sus propiedades lo convierten en un excelente modelo experimental in vivo para estudiar angiogénesis, crecimiento tumoral, sistemas de administración de fármacos o diagnóstico fotodinámico (PDD) y terapia fotodinámica (PDT). Al mismo tiempo, este modelo aborda el requisito de reemplazar animales de experimentación con una alternativa adecuada. El embrión cultivado ex ovo permite una fácil aplicación, acceso, monitoreo y documentación de sustancias. El más utilizado es el chick CAM; sin embargo, este artículo describe las ventajas de la CAM de codorniz japonesa como un modelo de bajo costo y alto rendimiento. Otra ventaja es el desarrollo embrionario más corto, que permite una mayor rotación experimental. Aquí se explora la idoneidad de la CAM de codorniz para PDD y PDT de cáncer e infecciones microbianas. Como ejemplo, se describe el uso del fotosensibilizador hipericina en combinación con lipoproteínas o nanopartículas como sistema de administración. Se determinó la puntuación de daño de las imágenes en luz blanca y los cambios en la intensidad de fluorescencia del tejido CAM bajo luz violeta (405 nm), junto con el análisis de las secciones histológicas. La CAM de codorniz mostró claramente el efecto de la TFD en la vasculatura y el tejido. Además, se pueden observar cambios como hemorragia capilar, trombosis, lisis de vasos pequeños y sangrado de vasos más grandes. La CAM de codorniz japonesa es un modelo in vivo prometedor para el diagnóstico fotodinámico y la investigación terapéutica, con aplicaciones en estudios de angiogénesis tumoral, así como terapia antivascular y antimicrobiana.
Introducción
El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es bien conocido y ampliamente utilizado en diversas áreas de investigación. Es un órgano extraembrionario ricamente vascularizado que proporciona intercambio gaseoso y transporte mineral1. Debido a la transparencia y accesibilidad de esta membrana, los vasos sanguíneos individuales y sus cambios estructurales se pueden observar en tiempo real2. A pesar de las ventajas, la CAM de los pollitos también tiene algunas limitaciones (por ejemplo, instalaciones de cría más grandes, producción de huevos y consumo de alimento) que podrían evitarse mediante el uso de otras espec....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Todos los equipos y reactivos deben ser esterilizados en autoclave o esterilizados con etanol al 70% o luz UV.
1. Incubación de huevos
- Almacene los huevos de codorniz fertilizados a 10-15 °C durante un máximo de 4-5 días antes de comenzar la incubación. Use solo huevos limpios y sin daños.
- Incubar los huevos en una incubadora de tiro forzado durante ~ 53-54 h. Ponga los huevos horizontalmente con la rotación de huevos desactivada, al 50% -60% de humedad y a 37,5 °C de temperatura de incubación.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La localización del tumor en la superficie CAM es difícil con luz blanca. Se espera que el fotosensibilizador (aquí, hipericina) utilizado en el PDD sea absorbido selectivamente por el tumor y ayude a visualizar el tumor. La adición de hipericina y el uso de luz fluorescente (p. ej., 405 nm) mostraron muy bien la posición del tumor (carcinoma de células escamosas TE1) (Figura 6A). El análisis histológico mostró células tumorales vitales invadiendo tejidos sanos. Las estructuras concéntricas .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Para un cultivo ex ovo exitoso, es importante seguir el protocolo anterior. Además, si los huevos no se abren con suficiente cuidado o no hay humedad suficiente durante el cultivo, el saco vitelino se adhiere a la cáscara y, a menudo, se rompe. El inicio de un cultivo ex ovo en el momento de aproximadamente 60 h de incubación de huevos asegura la alta tasa de supervivencia de los embriones, ya que ya son lo suficientemente grandes como para sobrevivir a la manipulación. En las etapas posteriores del des.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por VEGA 2/0042/21 y APVV 20-0129. La contribución de V. Huntošová es el resultado de la implementación del proyecto: Comunidad científica abierta para la investigación interdisciplinaria moderna en medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoyado por el Programa Operativo Infraestructura Integrada, financiado por el FEDER.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| placa de cultivo celular de 6 pocillos | Sarstedt | 83.392 | Poliestireno transparente, estéril |
| Incubadora de CO2 ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapur | CCL-050B-8 | CO2 incubadora de cultivo celular |
| criocorte Leica CM 1800 | Reichert-Jung, Estados Unidos | ||
| cámara digital Canon EOS 6D II | Canon, Japón | ||
| láser de diodo 405 nm | Ocean Optics, EE. UU. | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimetilsulfóxido |
| eosina | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| etanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| cepillo fino tamaño 2 | Faber-Castell | 281802 | cepillo para la separación y manipulación CAM |
| glutaraldehído | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxilina | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hipericina | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubadora Bios Midi | Bios Sedl any, República | Checa Incubadora de tiro forzado para incubadora inicial | |
| incubadora Memmert IF160 Memmert | , Alemania | Incubadora de circulación de aire forzado para incubación CAM | |
| Kaiser slimlite plano, caja de luz LED | Kaiser, Alemania | 2453 | Transilluminator |
| Luz LED 405 nm | luz LED circular hecha a medida | ||
| Canon MP- E 65 mm f/ 2.8 | Canon, Japón | ||
| microscopio Kapa 2000 | Kvant, Eslovaquia micrótomo | de microscopio óptico | |
| Auxilab 508 | Auxilab, España | micrótomo rotatorio manual | |
| paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | medio de parafina para la inclusión de tejidos |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Tijeras tampón salino fosfato |
| Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro tijeras para CAM software de separación |
| ImageJ 1.53 | programa de procesamiento y análisis de imágenes | dominio | |
| solución stock HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | lipoproteínas de alta densidad |
| solución madre LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | lipoproteínas de baja densidad |
| Tissue-Tek O.C.T. Compuesto | Sakura Finetek | 4583 | Temperatura óptima de corte Compuesto 118 mL botellas exprimibles |
Referencias
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
