Micro-CT es una herramienta no destructiva que puede analizar estructuras de plantas en tres dimensiones. El presente protocolo describe la preparación de la muestra para aprovechar la micro-TC para analizar la estructura y función de las plantas parásitas. Se utilizan diferentes especies para resaltar las ventajas de este método cuando se combina con preparaciones específicas.
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Artículo de método
Aprovechamiento de la micro-tomografía computarizada para analizar las interacciones parásitas planta-huésped
En este artículo
Resumen
Resumen
La micro-tomografía computarizada se ha convertido en una herramienta establecida en la investigación de la estructura y función de la planta. Su naturaleza no destructiva, combinada con la posibilidad de visualización tridimensional y seccionamiento virtual, ha permitido un análisis novedoso y cada vez más detallado de órganos vegetales complejos. También se pueden explorar las interacciones entre las plantas, incluso entre las plantas parásitas y sus huéspedes. Sin embargo, la preparación de la muestra antes del escaneo se vuelve crucial debido a la interacción entre estas plantas, que a menudo difieren en la organización y composición del tejido. Además, la amplia diversidad de plantas con flores parásitas, que van desde cuerpos vegetativos altamente reducidos hasta árboles, hierbas y arbustos, debe considerarse durante el muestreo, tratamiento y preparación del material parásito-huésped. Aquí se describen dos enfoques diferentes para introducir soluciones de contraste en el parásito y / o plantas huésped, centrándose en el análisis del haustorio. Este órgano promueve la conexión y la comunicación entre las dos plantas. Siguiendo un enfoque simple, los detalles de la organización del tejido del haustorio se pueden explorar tridimensionalmente, como se muestra aquí para las especies parásitas eufitoides, vid y muérdago. La selección de agentes contrastantes específicos y los enfoques de aplicación también permiten la observación detallada de la propagación del endoparásito dentro del cuerpo del huésped y la detección de la conexión directa de vaso a vaso entre el parásito y el huésped, como se muestra aquí para un parásito de raíz obligado. Por lo tanto, el protocolo discutido aquí se puede aplicar a la amplia diversidad de plantas con flores parásitas para avanzar en la comprensión de su desarrollo, estructura y funcionamiento.
Introducción
La tomografía microcomputarizada de rayos X de alta resolución (micro-TC) es un método de imagen en el que se registran múltiples radiografías (proyecciones) de una muestra desde diferentes ángulos de visión y luego se utilizan para proporcionar una reconstrucción virtual de la muestra1. Este objeto virtual puede ser analizado, manipulado y segmentado, permitiendo la exploración no destructiva en tres dimensiones2. Inicialmente diseñado para análisis médicos y más tarde para aplicaciones industriales, el micro-CT también ofrece la ventaja de visualizar órganos y tejidos internos sin necesidad de procedimientos invasivos<....
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Protocolo
1. Selección de muestras de plantas parásitas
- Recolectar todo el haustorio de la planta parásita, incluido el tallo / raíz del huésped adjunto y los segmentos de los extremos proximal y distal del órgano huésped parasitado; La longitud ideal de cada segmento equivale al doble del diámetro del haustorio.
NOTA: Para los haustorios laterales, incluya parte del tallo/raíz madre del parásito a partir del cual se formó el haustorio (Figura 1A, B, D). Para los endoparásitos, recolecte un segmento del tallo/raíz del huésped en el que los signos del parásito sean visibles (Figura ....
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Resultados
El haustorio de plantas parásitas es un órgano complejo que comprende diferentes tejidos y tipos celulares que se entrelazan y conectan con los tejidos de otra planta, utilizada como huésped20. La micro-tomografía computarizada se puede aprovechar para comprender mejor esta compleja estructura de una manera no destructiva y tridimensional cuando se analizan haustorios pequeños (Figura 1A-C) y grandes (Figura 1D, E
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Discusión
El uso de soluciones de metales pesados para mejorar el contraste del tejido vegetal se ha convertido en un paso crucial en la preparación de muestras para el análisis de micro-TC. Varios compuestos comúnmente disponibles en los laboratorios de micromorfología vegetal han sido probados por Staedler et al., quienes recomiendan el uso de fosfotungato como el agente más efectivo para penetrar muestras y aumentar el índice de contraste8. Los resultados obtenidos aquí en el análisis del haustorio de
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Me gustaría agradecer al Dr. Simone Gomes Ferreira (Laboratorio de Microtomografía, Universidad de Sao Paulo, Brasil) y al Dr. Greg Lin (Centro de Sistemas a Nanoescala, Universidad de Harvard, EE.UU.) por su ayuda primordial y la capacitación indispensable del usuario para diferentes sistemas de microtomografía y software de análisis de datos. También agradezco al personal del Invernadero EEB de la Universidad de Connecticut (EE.UU.), especialmente a Clinton Morse y Matthew Opel por proporcionar los ejemplares de Viscum mínimo. El Dr. John Wenzel brindó la oportunidad y una gran ayuda para el muestreo de Pyrularia pubera. Carolina Bastos, Yasmin Hir....
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Materiales
P. pubera
utilizado para el escaneo de microscopio de rayos X 3D + A2:D22 Zeiss Versa 620 Se utiliza para escanear las especies CT-Pro Software Nikon versión XT 3.1.11 Se utiliza para la reconstrucción tridimensional de escaneos Software CT-Vox Bruker . software
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de microscopio de rayos X 3D (XRM) | Zeiss Versa 620 | Pyrularia pubera | |
| versión 3.3.1 | Se utiliza para el análisis y la adquisición de imágenes y vídeos | ||
| Software Dragonfly | Sistemas de investigación de objetos - versión ORS | Se utiliza para el análisis y la adquisición de imágenes y vídeos | |
| Viales de vidrio | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Vendido por VWR - EE. UU.; asegúrese de que los viales sean capaces de soportar el vacío a aprox. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | versión XT 3.1.11 | Se utiliza para controlar el sistema de HMXST225 Nikon X-Tek |
| Solución de yodo 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Vendido por VWR - EE. UU |
| Nitrato de plomo II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Vendido por SPLab |
| Escáner de microtomografía | Bruker | Skyscan1176 | Se utiliza para escanear las especies C. americana, S. martianus, y S. fungiforme |
| Escáner de microtomografía | Nikon | X-Tek HMXST225 | Se utiliza para escanear las especies V. mínimo |
| NRecon software | Bruker | versión 1.0.0 | Se utiliza para la reconstrucción tridimensional |
| Hidrato de ácido fosfotúngstico al 3% en solución acuosa | Ciencias de la microscopía electrónica | 101410-756 | Vendido por VWR - EE. UU |
| .Película de plástico (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Vendido por VWR - USA |
| Bolsa de plástico para sueros 500 mL | Taylor | 3478 | Vendido por Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| Tubo de PVC 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Vendido por VWR - Estados Unidos |
| Sistema de escaneo | Nikon X-Tek HMXST225 | utiliza para escanear Viscum minimum | |
| Sistema de escaneo | Bruker Skyscan 1176 | utilizado para escanear C. americana | |
| Scout-and-ScanTM | Zeiss | versión 16 | Se utiliza para controlar el sistema Zeiss Versa 620 y para la reconstrucción tridimensional de escaneos |
| Válvula de tres vías | ToToT | DMTWVS-5 | Vendido por Amazon |
| USA Jeringa de dos partes | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Usado sin el émbolo |
| Cámara de vacío | Binder | 80080-434 | Vendido por VWR - USA; incluye bomba y tubos de conexión Software |
| VG Studio Max | Volume Graphics | versión 3.0 | Se utiliza para el análisis y la adquisición de imágenes y vídeos |
Referencias
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), ....
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Reimpresiones y permisos
