Artículo de método

Limpieza óptica de tejidos vegetales para imágenes de fluorescencia

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DOI:

10.3791/63428

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5 de enero de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University, 2Institute for Advanced Research (IAR), Nagoya University, 3Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 4Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

En este artículo

Resumen

Aquí, se describe un método para hacer que los tejidos vegetales sean transparentes mientras se mantiene la estabilidad de las proteínas fluorescentes. Esta técnica facilita la obtención de imágenes profundas de tejidos vegetales despejados sin seccionamiento físico.

Resumen

Es difícil observar directamente la estructura interna de especímenes de plantas de múltiples capas y opacas, sin disección, bajo un microscopio. Además, la autofluorescencia atribuida a la clorofila dificulta la observación de proteínas fluorescentes en las plantas. Durante mucho tiempo, se han utilizado varios reactivos de limpieza para hacer que las plantas sean transparentes. Sin embargo, los reactivos de limpieza convencionales disminuyen las señales fluorescentes; por lo tanto, no ha sido posible observar las estructuras celulares e intracelulares con proteínas fluorescentes. Se desarrollaron reactivos que pueden limpiar los tejidos vegetales mediante la eliminación de la clorofila mientras se mantiene la estabilidad de las proteínas fluorescentes. Aquí se proporciona un protocolo detallado para la limpieza óptica de tejidos vegetales utilizando reactivos de limpieza, ClearSee (CS) o ClearSeeAlpha (CSA). La preparación de los tejidos vegetales despejados implica tres pasos: fijación, lavado y limpieza. La fijación es un paso crucial en el mantenimiento de las estructuras celulares y la estabilidad intracelular de las proteínas fluorescentes. El tiempo de incubación para la limpieza depende del tipo de tejido y la especie. En Arabidopsis thaliana, el tiempo requerido para el aclaramiento con CS fue de 4 días para hojas y raíces, 7 días para plántulas y 1 mes para pistilos. CS también requirió un tiempo relativamente corto de 4 días para hacer que las hojas gametofíticas de Physcomitrium patens fueran transparentes . En contraste, los pistilos en el tabaco y la torenia produjeron pigmento marrón debido a la oxidación durante el tratamiento de CS. CSA redujo el pigmento marrón al prevenir la oxidación y podría hacer que los pistilos de tabaco y torenia fueran transparentes, aunque tomó un tiempo relativamente largo (1 o 2 meses). CS y CSA también fueron compatibles con la tinción utilizando colorantes químicos, como DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) y Hoechst 33342 para ADN y Calcofluor White, SR2200 y Direct Red 23 para la pared celular. Este método puede ser útil para que las imágenes de toda la planta revelen la morfología intacta, los procesos de desarrollo, las interacciones planta-microbio y las infecciones por nematodos.

Introducción

La visualización de las estructuras celulares y la localización de proteínas en organismos vivos es importante para aclarar sus funciones in vivo. Sin embargo, dado que el cuerpo vivo no es transparente, es difícil observar la estructura interna de los organismos vivos sin disección. Especialmente, en el caso de los tejidos vegetales, que son multicapa con células de diferentes formas, el desajuste del índice causado por su estructura y la presencia de pigmentos que absorben la luz es problemático. Por ejemplo, las hojas de las plantas tienen una estructura compleja que les permite utilizar eficientemente la luz que entra en sus cuerpos para la fotosíntesis1, mientras que la estructura también causa un desajuste del índice de refracción, lo que las hace difíciles de observar. Sin embargo, las hojas tienen muchos pigmentos que absorben la luz, como la clorofila, que emiten una fuerte fluorescencia roja y los pigmentos parduscos se producen por oxidación2,3. Estos pigmentos también dificultan las observaciones de microscopía de fluorescencia de montaje completo en las plantas. Por lo tanto, para observar la estructura interna de las plantas, la decoloración y fijación por alcohol y el desbroce con hidrato de cloral se han utilizado durante mucho tiempo para eliminar el desajuste del índice de refracción y la autofluorescencia4,5. Estos métodos convencionales se han adoptado durante muchos años, pero tienen el inconveniente de eliminar la fluorescencia de las proteínas fluorescentes al mismo tiempo6,7. Esto es problemático ya que las proteínas fluorescentes se han vuelto indispensables en las imágenes fluorescentes actuales.

Por lo tanto, ClearSee (CS) y ClearSeeAlpha (CSA) se han desarrollado como reactivos de limpieza óptica para tejidos vegetales. Ambos reactivos reducen la autofluorescencia de la clorofila manteniendo la estabilidad de las proteínas fluorescentes7,8. CSA es particularmente útil cuando se producen pigmentos marrones debido a la oxidación de los tejidos. Usando estos reactivos de limpieza, es posible observar la estructura celular y la localización de proteínas dentro del cuerpo de la planta sin seccionamiento físico.

Protocolo

1. Preparación de soluciones de compensación

  1. Para preparar la solución de CS, disuelva el 10% (p/v) de xilitol, el 15% (p/v) desoxicolato de sodio y el 25% (p/v) de urea en agua destilada en un agitador magnético.
    NOTA: El polvo de desoxicolato de sodio debe pesarse en una cámara de tiro, ya que flota fácilmente en el aire. CS se puede almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad durante más de 1 año.
  2. Para preparar la solución csa, agregue sulfito de sodio (concentración final de 50 mM) a la solución CS obtenida anteriormente.
    NOTA: Agregue sulfito de sodio a la solución de CS justo antes de usarlo, ya que el agente reductor se desactiva fácilmente.

2. Preparación de la solución fijadora

  1. Transfiera 40 ml de agua esterilizada a un tubo cónico y agregue 2 g de paraformaldehído. Añadir 200 μL de 2 N NaOH para aumentar el pH de la solución. Después de cerrar y sellar el tubo con parafilm, incubar a 60 °C con inversiones ocasionales hasta que todo se disuelva.
  2. Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, agregue 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x para ajustar el pH a 7.4. Agregue agua esterilizada para completar el volumen a 50 ml.
    NOTA: Se prefiere una solución fijadora recién preparada. La solución también se puede almacenar a -30 °C durante varios meses.

3. Fijación de muestras

  1. Sumergir muestras de plantas en la solución fijadora en un microtubo (Figura 1A), asegurando que el volumen de la solución fijadora sea más de cinco veces el volumen de la muestra.
  2. Selle el microtubo con una película parapelícula y haga agujeros con una aguja. No deje el tubo abierto debido al riesgo de derrame de la muestra durante la descompresión al vacío.
  3. Coloque el microtubo en un desecador y ajuste lentamente el grado de vacío (~ 690 mmHg) para que las burbujas aparezcan gradualmente a partir de las muestras (Figura 1B-C). Apague la bomba de vacío después de evacuar el desecador. Deje el microtubo sin molestar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  4. Ventile el desecador con cuidado para evitar que se perturben las muestras. Vuelva a encender la bomba de vacío y apáguela después de evacuar el desecador. Deje el microtubo sin molestar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Se debe tener cuidado para evitar daños en las muestras al ventilar el desecador. La penetración de la solución fijadora en las muestras se ve reforzada por dos tratamientos de vacío. El tratamiento de vacío adicional ayuda a penetrar la solución fijadora en muestras más gruesas.
  5. Abra el desecador con cuidado sin golpear la solución fijadora en el microtubo. Usando una micropipeta, retire la solución fijadora y agregue 1x PBS. Después de almacenar durante 1 minuto, reemplace el PBS antiguo con el nuevo PBS 1x (Figura 1D).

4. Compensación

  1. Después de quitar PBS, agregue cinco veces el volumen de muestra de la solución de limpieza.
  2. Selle el microtubo con parafilm y haga agujeros con una aguja. Coloque las muestras en el desecador, evacue como en el paso 3.3 y apague la bomba de vacío. Deje el microtubo sin molestar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
  3. Abra el desecador suavemente. Cierre el microtubo con parafilm y guárdelo a temperatura ambiente en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo de proteínas fluorescentes. Invierta el microtubo cada 1-2 días para acelerar el proceso de limpieza.
  4. Cuando la solución de limpieza se vuelva verde, reemplácela con nuevas soluciones de limpieza hasta que la solución permanezca incolora (Figura 1E-H).

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Figura 1: Procedimiento para el tratamiento del SC. (A) Plántula de Arabidopsis en solución de PFA (paraformaldehído) al 4%. (B) La muestra se coloca en un desecador. (C) La plántula se fija al vacío. (D) La plántula se empapa en la solución de PFA después del tratamiento al vacío. (E) Plántula resultante tratada con solución de limpieza de 3 días. Observe el color verde de la solución de limpieza. (F) La solución de limpieza se reemplaza 3 días después del tratamiento. (G) Plántula tratada con solución de limpieza resultante de 5 días. (H) La solución de limpieza se reemplaza 5 días después del tratamiento. Barras de escala: 1 cm (A,C-H) y 5 cm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Tinción química de tinte

  1. Al microtubo, añadir Hoechst 33342 (concentración final de 10 μg/mL) para la tinción nuclear o Calcofluor White (concentración final de 1 mg/ml) para la tinción de la pared celular y esperar 1 h. Después de retirar la solución de tinte, lave la muestra con una solución de limpieza fresca durante 1 h.
    NOTA: La tinción y el lavado durante la noche pueden mejorar la penetración del tinte fluorescente en los tejidos y reducir la fluorescencia de fondo. Varios colorantes fluorescentes son compatibles con la solución CS como Basic Fuchsin9 (lignina), Auramine O9 (lignina, suberina y cutina), Nile Red9 (suberina), Direct Yellow 969, Direct Red 239 y SR220010,11 (paredes celulares).

6. Observación

  1. Corte la lámina de caucho de silicona con una cuchilla de afeitar para preparar un marco para el espaciador (Figura 2A).
    NOTA: Ajuste el grosor de la lámina de caucho de silicio de acuerdo con el grosor de la muestra. Como las muestras tratadas con solución de limpieza son suaves, se dañarán si se cubren directamente con el vidrio de la cubierta.
  2. Coloque el marco de silicona sobre el vidrio de la cubierta (por ejemplo, 25 x 60 mm) (Figura 2B). Coloque las muestras tratadas dentro del marco y agregue ~ 100 μL de solución de limpieza para eliminar cualquier burbuja en el marco. Cubra con otra cubierta de vidrio (18 x 18 mm o 24 x 24 mm) para evitar la evaporación de la solución de limpieza (Figura 2C).
  3. Observe las muestras bajo un microscopio fluorescente. Después de la observación, devuelva las muestras a la solución de limpieza tomada en un microtubo y guárdelas a temperatura ambiente en la oscuridad.

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Figura 2: Preparación de muestras para observación microscópica. (A) Cortar una lámina de silicona de 0,2 mm de espesor en un marco. (B) Coloque el marco de la hoja de silicona sobre el vidrio de la cubierta. (C) Coloque la muestra tratada con solución de limpieza (marcada por un borde punteado) dentro del marco y cúbrala con un vidrio de cubierta. Barras de escala: 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

CS puede limpiar hojas de varias especies (Figura 3A-H). Es difícil para la solución de CS penetrar en una hoja de arroz porque la superficie de la hoja está cubierta por cera cuticular en esta planta. Sin embargo, después de extraer la cera cuticular sumergiéndola en cloroformo durante 10 s, CS podría limpiar las hojas de arroz (Figura 3H). Sin embargo, CS no pudo penetrar en las hojas de Chamaecyparis obtusa que son menos permeables a CS (Figura 3I, J). En las hojas de crisantemo, se observó pigmentación marrón inducida por la oxidación de polifenoles en las hojas tratadas con CS (Figura 3K, L). Del mismo modo, los pistilos de tabaco y torenia mostraron pigmentación marrón durante el tratamiento de CS (Figura 3M, O). Como el componente de sulfito de sodio en CSA previene la oxidación de polifenoles debido al efecto reductor, CSA podría eliminar los pistilos de tabaco y torenia sin pigmentación marrón (Figura 3N, P).

Las Figuras 4B muestran que el tratamiento con CS redujo el color verde pálido de la hoja de Arabidopsis H2B-mClover (campo brillante) y mejoró la intensidad de fluorescencia de H2B-mClover en comparación con la incubación de PBS (Figura 4A). Además de las plantas con flores, la CS también es aplicable a las plantas de musgo (Figura 4C); después de 4 días de tratamiento con CS, la fluorescencia de H2B-mRFP se detectó claramente para todo el gametóforo con autofluorescencia de clorofila reducida. Las figuras 4D,E muestran imágenes de reconstrucción en 3D del pistilo H2B-mClover en Nicotiana benthamiana despejado con CSA. La profundidad de la muestra fue de 440 μm. Como muestra la imagen de proyección de máxima intensidad codificada en profundidad, CSA permite obtener imágenes profundas de tejidos desafiantes, como los pistilos de tabaco.

CS y CSA también fueron compatibles con la tinción de tinte fluorescente. La Figura 5 muestra que el SC podría usarse simultáneamente para observar la proteína fluorescente (H2B-mClover) y la tinción de colorante fluorescente orgánico (Calcofluor White). Después de la reconstrucción 3D a partir de las imágenes de la pila z, se podía observar cualquier sección.

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Figura 3: Limpieza óptica de hojas y pistilos utilizando soluciones de limpieza. (A-L) Las hojas fijas de varias especies se incubaron en PBS (A, C, E, G, I, K) o CS (B, D, F, H, J, L) durante 8 días y CS (M, O) o CSA (N, P) durante 2 días. (A, B, O, P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Barras de escala: 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes de fluorescencia de tejidos tratados con soluciones de limpieza. (A,B) UBQ10pro::H2B-mLas hojas de Arabidopsis thaliana fueron tratadas con PBS (A) o CS (B) durante 3 días. (C) Los gametóforos frondosos H2B-mRFP de Physcomitrium patens fueron tratados con CS durante 4 días. Los núcleos fueron marcados con H2B-mRFP (verde). El tratamiento con SC redujo la autofluorescencia de clorofila (magenta). La señal H2B-mRFP en la región apical se observó claramente tanto para las imágenes combinadas de H2B-mRFP como para la autofluorescencia o campo brillante. (D,E) El estigma UBQ10pro::H2B-mClover de Nicotiana benthamiana fue tratado en CSA durante 1 mes. La proyección de máxima intensidad (D) y la proyección de máxima intensidad codificada en profundidad (E) se generaron a partir de 88 imágenes de pila z a intervalos de 5 μm. Barras de escala: 100 μm. Las imágenes se tomaron mediante microscopía de campo amplio (A, B), confocal (C) y excitación de dos fotones (D, E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: La tinción de colorante fluorescente es compatible con CS. (A) Hojas tratadas con CS observadas por microscopía de excitación de dos fotones con excitación de 950 nm. La pared celular se tiñe con Calcofluor White (cian). Los núcleos están etiquetados con UBQ10pro::H2B-mClover (amarillo). Las imágenes yz (B) y xz (C) son secciones transversales en la posición indicada por las líneas discontinuas blancas en (A). Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Transparencia del desoxicolato de sodio. (A) Colores de varios desoxicolatos de sodio al 15% (enumerados en la Tabla de Materiales). (B) Espectro de fluorescencia de cada desoxicolato de sodio al 15% con excitación de 380 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este método consiste en la fijación, el lavado y la limpieza. La fijación es un paso crítico en este protocolo. Si la proteína fluorescente no se observa después de la fijación de PFA, no se observará después del tratamiento con solución de limpieza. La penetración de la solución de PFA en los tejidos es crítica, pero no se recomienda el tratamiento de alto vacío porque puede destruir la estructura celular. Las condiciones de vacío y los períodos de fijación deben optimizarse para cada tipo de tejido y especie. Se recomienda verificar las proteínas fluorescentes incluso después de la fijación. Aunque las muestras generalmente se fijaron durante 30-60 minutos a temperatura ambiente, se pueden fijar a 4 ° C durante más tiempo (durante la noche o más).

Como se muestra en la Figura 6A, algunos desoxicolatos de sodio tenían un color amarillo pálido cuando se disuelven. Tales soluciones de desoxicolato de sodio mostraron una fuerte autofluorescencia en la región de 400-600 nm después de la excitación a 380 nm (Figura 6B). Esta autofluorescencia evita la limpieza óptica y las imágenes de fluorescencia. Los usuarios deben verificar el color de la solución de desoxicolato de sodio, ya que la calidad del reactivo puede diferir debido a la pureza, la variación de lote a lote u otras razones.

Las soluciones de limpieza utilizadas aquí tienen altas concentraciones de desoxicolato de sodio, lo que podría destruir la estructura de la membrana. El marcador de membrana plasmática (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) se observó incluso después del tratamiento con SC7. Sin embargo, podría ser mejor reducir la concentración de desoxicolato de sodio, dependiendo de la estructura y el tejido de interés. De hecho, se obtuvieron imágenes con mayor claridad para pistilos de Arabidopsis con CS modificado, en los que la concentración de desoxicolato de sodio se reduce a la mitad; sin embargo, las concentraciones reducidas de desoxicolato de sodio requirieron tiempos de tratamiento prolongados (por ejemplo, 1 mes para arabidopsis pistilos).

El SC puede reducir la autofluorescencia roja (>610 nm) para eliminar la clorofila en las muestras tratadas. Sin embargo, la autofluorescencia del rango de 500-600 nm (amarillo a naranja) se mantuvo incluso en muestras tratadas con CS7. Se cree que esta autofluorescencia se deriva de la pared celular y otros componentes celulares, como la lignina12,13. Por lo tanto, es difícil hacer que los tejidos, como los tallos con paredes secundarias desarrolladas, sean completamente transparentes mediante el tratamiento de CS.

Se han desarrollado varios reactivos de limpieza además de los utilizados aquí para observar proteínas fluorescentes en plantas utilizando microscopía fluorescente14,15,16,17. En comparación con estos métodos, CS y CSA eliminan la clorofila y reducen la autofluorescencia, haciendo que los tejidos de las plantas sean más transparentes. Recientemente, Sakamoto et al. desarrollaron un método mejorado, iTOMEI, para la fijación, la limpieza del detergente y el montaje para ajustar el desajuste del índice de refracción18. En las plántulas de Arabidopsis, iTOMEI limpió el tejido dentro de las 26 h.

CS es aplicable a una amplia gama de especies de plantas, como Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, barley22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, maize26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soybean33, strawberry34, wheat35, y Wolffiella hyalina36. Para tejidos más gruesos, el SC también puede hacer que las secciones del vibratoma sean transparentes37,38. Este método permitió estudiar la estructura celular y los patrones de expresión génica en plantas37,38. Además, también se observaron infecciones por nematodos20,39, infecciones fúngicas y simbiosis19,40,41 en el interior de los tejidos tratados con SC. Por lo tanto, este método es útil para imágenes de tejido completo de micro a macroescalas y podría ayudar a descubrir nuevas interacciones entre varias células, tejidos, órganos y organismos.

Divulgaciones

ClearSee se comercializa (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japón). La Universidad de Nagoya posee una patente (JP6601842) sobre el reactivo de compensación ClearSee. D. Kurihara es el inventor de la patente. Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 to T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 to D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 to D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) y la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (programa PRESTO (JPMJPR15QC a Y.M., JPMJPR18K4 a D.K.)). Los autores están agradecidos con el Live Imaging Center del Instituto de Biomoléculas Transformadoras (WPI-ITbM) de la Universidad de Nagoya por apoyar los estudios microscópicos y Editage (www.editage.com) para la edición en inglés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Calcofluor WhiteSigma-AldrichF3543Abrillantador Fluorescente 28; 100 mg/mL en H2O
ClearSee10% (p/v) de xilitol, 15% (p/v) de desoxicolato de sodio, 25% (p/v) de urea
Cubreobjetos de vidrio (18 veces; 18 No.1)MATSUNAMIC018181
Cubierta de vidrio (24 veces; 24 No.1)MATSUNAMIC024241
Cubierta de vidrio (25 veces; 60 No.1)MATSUNAMIC025601
DesecadorAS One1-5801-11
Hoechst 33342DOJINDO346-079511 mg/mL en aguja de H2O
TERUMONN-2238S
ParafilmBemisPM-996
ParaformaldehídoNacalai Tesque26126-25
Fosfato tamponado solución salina, pH 7.4
Lámina de caucho de siliconaAS One6-9085-12
Desoxicolato de sodioIndustria química de TokioC0316Figura 6_1; Lote PSGYK-QB
Desoxicolato de sodioKishida Chemical260-71412Figura 6_2; Lote C05543H
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750Figura 6_3; Lote SLBS7362
Desoxicolato de sodioSigma-Aldrich30970Figura 6_4; Lote BCBW0612
Desoxicolato de sodioNacalai Tesque10712-96Figura 6_5; Lote M5R3403
Desoxicolato de sodioFUJIFILM Wako Pure Chemical194-08311Figura 6_6; Lote LKL0648
Hidróxido de sodioNacalai Tesque31511-05
Sulfito de sodioFUJIFILM Wako Pure Chemical190-03411
UreaFUJIFILM Wako Pure Chemical211-01213
Bomba de vacíoBUCHIV-700
XilitolFUJIFILM Wako Pure Chemical248-00545

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