Aquí, presentamos un protocolo para el cribado de la biodiversidad del suelo para buscar cepas de hongos involucradas en la degradación de materiales recalcitrantes. En primer lugar, se aíslan cepas fúngicas capaces de crecer con ácidos húmicos o lignocelulosa. Su actividad se prueba tanto en ensayos enzimáticos como en contaminantes como hidrocarburos y plásticos.
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Artículo de método
Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes
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Resumen
Resumen
La contaminación ambiental es un problema creciente, y la identificación de hongos involucrados en el proceso de biorremediación es una tarea esencial. El suelo alberga una increíble diversidad de vida microbiana y puede ser una buena fuente de estos hongos biorremediativos. Este trabajo tiene como objetivo la búsqueda de hongos del suelo con potencial de biorremediación mediante el uso de diferentes pruebas de cribado. Los medios de cultivo minerales suplementados con sustancias recalcitrantes como única fuente de carbono se utilizaron como pruebas de crecimiento. En primer lugar, las diluciones del suelo se enchaparon en placas de Petri con medio mineral modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa. Las colonias de hongos en crecimiento se aislaron y probaron en diferentes sustratos, como mezclas complejas de hidrocarburos (vaselina y aceite de motor usado) y polvos de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Las pruebas enzimáticas cualitativas se asociaron con las pruebas de crecimiento para investigar la producción de esterasas, lacasas, peroxidasas y proteasas. Estas enzimas están involucradas en los principales procesos de degradación del material recalcitrante, y su secreción constitutiva por las cepas fúngicas examinadas podría tener el potencial de ser explotada para la biorremediación. Se aislaron y probaron más de 100 cepas, y se encontraron varios aislados con buen potencial de biorremediación. En conclusión, las pruebas de detección descritas son un método fácil y de bajo costo para identificar cepas de hongos con potencial de biorremediación del suelo. Además, es posible adaptar las pruebas de detección de diferentes contaminantes, de acuerdo con los requisitos, agregando otras sustancias recalcitrantes a los medios de cultivo mínimos.
Introducción
El suelo es un componente fundamental de la vida en la Tierra y es la base de muchos ecosistemas. Los minerales, la materia orgánica y los microorganismos en el suelo pueden considerarse como un sistema, con asociaciones e interacciones cercanas que ocurren entre ellos. Las interacciones de estos compuestos tienen un impacto importante en los procesos terrestres, la calidad ambiental y la salud de losecosistemas 1. La contaminación del suelo plantea graves problemas ambientales en todo el mundo. La aplicación indiscriminada, a largo plazo y excesiva de sustancias recalcitrantes y tóxicas, como pesticidas, productos derivados del petróleo, plást....
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Protocolo
1. Selección de cepas de hongos capaces de degradar materiales recalcitrantes del suelo
- Preparación de solución antibiótica.
- Ponga penicilina (50 mg/L), estreptomicina (40 mg/L), clortetraciclina (40 mg/L), neomicina (100 mg/L) y cloranfenicol (100 mg/L) en 250 ml de agua estéril desionizada.
- Antes de agregar cloranfenicol a la solución antibiótica, disolverlo en 3 ml de etanol ≥99%.
- Coloque la solución antibiótica en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro de la solución durante 10 minutos. Guárdelo a 4 °C.
- Preparación de medios de crecimiento.
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Resultados
Los métodos de medios selectivos (Sección 1 del protocolo) permitieron cribar la rica biodiversidad del suelo y seleccionar los hongos con alto potencial de biorremediación. Con el ácido húmico y los medios de lignocelulosa, se aislaron más de 100 cepas de hongos. Estos hongos produjeron enzimas involucradas en la biodegradación de materiales recalcitrantes naturales, que tienen una estructura química que se asemeja a muchos contaminantes. Sin embargo, las cepas fúngicas aisladas con los medios selectivos necesitaron un .......
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Discusión
La rica biodiversidad del suelo es una fuente abundante de hongos que poseen numerosas capacidades metabólicas, algunas de las cuales podrían ser candidatos potenciales para la biorremediación. Las pruebas selectivas de medios (Sección 1 del protocolo) son métodos fáciles de realizar y efectivos para aislar hongos capaces de crecer en polímeros complejos naturales como su única fuente de carbono. Los hongos pueden producir hidrolasas extracelulares, inespecíficas y oxidorreductasas30 como las enzi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos a la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) de la Universidad de Pavía y al profesor Solveig Tosi por brindar la oportunidad de este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 96 micropocillos | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Caldo Bushnell-Haas | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Cloroanfenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Clortetraciclina | Sigma-Aldrich | ||
| CoCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3· 6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filtro 0.2 y micro; m | Whatman | 10462200 | |
| ácido gálico | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Biosigma | VBS634 | |
| Viales de vidrio 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| Polietileno de alta densidad (PEAD) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Ácidos húmicos | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocelulosa | / | / | Residuos de producción de bioetanol esterilizados |
| Esparcidor de células en forma de L | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| agitador magnético | A.C.E.F | 8235 | |
| Caldo de extracto de malta | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4· 7H2O | Micropipeta Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 1000 μ L | Gilson | FA10006M | |
| Micropipeta 200 μ L | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2· 4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4· 2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomicina | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicilina | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptona | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Tereftalato de polietileno (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Placas de Petri | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Vaselina (Parafina líquida) | A.C.E.F | ||
| Patata Caldo de Dextrosa | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Poliestireno (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Poliuretano (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 Cloruro | |
| de polivinilo ( PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Tubo de halcón estéril | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Viales de vidrio estéril 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Punto estéril 1000 μ L | Gilson | F172511 | |
| Punto estéril 200 μ L | Gilson | F172311 | |
| Bolsas estériles de polietileno | WHIRL-PAK | B01018 | |
| jeringa estéril | Rays | 5523CM25 | |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Aceite de motor usado | / | / | mezcla compleja de hidrocarburos, aditivos para motores y metales, proporcionada por una empresa privada italiana |
| Viales 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
Referencias
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S.
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Reimpresiones y permisos
