Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.
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Artículo de método
Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo
En este artículo
Resumen
Resumen
La rizosfera alberga una comunidad microbiana altamente compleja en la que las raíces de las plantas son constantemente desafiadas. Las raíces están en estrecho contacto con una amplia variedad de microorganismos, pero los estudios sobre las interacciones transmitidas por el suelo aún están detrás de los realizados en los órganos sobre el suelo. Aunque algunas estrategias de inoculación para infectar plantas modelo con patógenos de raíces modelo se describen en la literatura, sigue siendo difícil obtener una visión general metodológica completa. Para abordar este problema, se describen con precisión tres sistemas diferentes de inoculación radicular que se pueden aplicar para obtener información sobre la biología de las interacciones raíz-microbio. A modo de ejemplo, las especies de Verticillium (a saber, V. longisporum y V. dahliae) se emplearon como patógenos modelo invasores de raíces. Sin embargo, los métodos se pueden adaptar fácilmente a otros microbios colonizadores de raíces, tanto patógenos como beneficiosos. Al colonizar el xilema de la planta, los hongos vasculares transmitidos por el suelo como Verticillium spp. exhiben un estilo de vida único. Después de la invasión de la raíz, se propagan a través de los vasos del xilema acropétalo, llegan al brote y provocan síntomas de enfermedad. Se eligieron tres especies de plantas representativas como huéspedes modelo: Arabidopsis thaliana, colza de importancia económica (Brassica napus) y tomate (Solanum lycopersicum). Se dan protocolos paso a paso. Se muestran resultados representativos de ensayos de patogenicidad, análisis transcripcionales de genes marcadores y confirmaciones independientes por parte de constructos reporteros. Además, se discuten a fondo las ventajas y desventajas de cada sistema de inoculación. Estos protocolos probados pueden ayudar a proporcionar enfoques para preguntas de investigación sobre las interacciones raíz-microbio. Saber cómo las plantas hacen frente a los microbios en el suelo es crucial para desarrollar nuevas estrategias para mejorar la agricultura.
Introducción
Los suelos naturales están habitados por un número asombroso de microbios que pueden ser neutros, dañinos o beneficiosos para las plantas1. Muchos patógenos de plantas son transmitidos por el suelo, rodean las raíces y atacan el órgano subterráneo. Estos microorganismos pertenecen a una amplia variedad de clados: hongos, oomicetos, bacterias, nematodos, insectos y algunos virus 1,2. Una vez que las condiciones ambientales favorecen la infección, las plantas susceptibles se enfermarán y los rendimientos de los cultivos disminuirán. Los efectos del cambio climático, como el calentamiento ....
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Protocolo
1. Medios para cultivos de hongos y sistemas de inoculación de plantas
- Caldo líquido de dextrosa de patata (PDB): Preparar 21 g/L de PDB en agua ultrapura en un matraz termoestable.
- Caldo líquido de dextrosa Czapek (CDB): Prepare 42 g/L CDB en agua ultrapura en un matraz termoestable.
- Medio para el sistema de inoculación de placas de Petri: Preparar un matraz termoestable con 1,5 g/L murashige y Skoog medio (MS) y 8 g/L de agar en agua ultrapura.
NOTA: Evite el azúcar en este medio, ya que conducirá a un crecimiento excesivo de hongos después de la inoculación. - Medio para el sistema de inoculación a base de v....
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Resultados
Siguiendo el protocolo, las plantas fueron cultivadas e inoculadas con V. longisporum (cepa Vl4325) o V. dahliae (aislado JR218). Se diseñaron varios escenarios para demostrar la efectividad y resaltar algunas capacidades de los protocolos dados. Se muestran resultados representativos.
La inducción expresional de genes implicados en la biosíntesis antimicrobiana de indol-glucosinolato (IG) es un indicador fiable para la.......
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Discusión
Debido a las tremendas pérdidas de rendimiento causadas por los fitopatógenos transmitidos por el suelo1, se requiere una mejora de las estrategias agrícolas o las variedades de cultivos. La limitada comprensión de la patogénesis de las enfermedades transmitidas por el suelo dificulta el desarrollo de plantas más resistentes. Es necesario explorar los mecanismos patológicos subyacentes, para lo cual se requiere una plataforma metodológica robusta. Los procedimientos de inoculación reportados han d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen a Tim Iven y Jaqueline Komorek por su trabajo previo en estos métodos, al grupo de Wolfgang Dröge-Laser (Departamento de Biología Farmacéutica, Universidad de Würzburg, Alemania) por proporcionar el equipo y los recursos necesarios para este trabajo, y a Wolfgang Dröge-Laser, así como a Philipp Kreisz (ambos de la Universidad de Würzburg) por la revisión crítica del manuscrito. Este estudio fue apoyado por la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | todos los sistemas descritos requieren el software Gelrite |
| Arabidopsis thaliana de tipo salvaje | NASC | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software para determinar las áreas foliares |
| Brassica napus de tipo salvaje | véase Floerl et al., 2008 | de la colza de ciclo rápido | ACaacc |
| Cefotaxima sódico | Duchefa | C0111 | |
| Matraz de artimañas 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Matraz Erlenmeyer con cuatro deflectores |
| Tubos de recolección 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Caldo de dextrosa Czapek mediano | Duchefa | C1714 | |
| Cámara digital | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desecador ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Junta con tapa para contener cloro gaseoso |
| Microscopio de fluorescencia | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | cinta no tejida 2,5 cm x 9,2 m |
| MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Sulfato de magnesio-heptahidratado |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS incluyendo vitaminas |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Cámaras de crecimiento Percival | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-placas | Sarstedt | 82.1473.001 | tamaño Ø xH: 92 y veces; 16 mm |
| Vasos de plástico (500 mL, transparente) | Pro-pac, caja de ensaladax | 5070 | tamaño: 108 y veces; 81 y veces; 102 mm |
| Filtro de celulosa plisada | Hartenstein | FF12 | nivel de retención de partículas 8– 12 y mu; m |
| poly klima cámara de crecimiento | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Caldo de patata dextrosa medio | SIGMA Aldrich | P6685 | para |
| microbiología Macetas | Pö ppelmann GmbH | TO 7 D o TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9,5 cm |
| PromMYB51::YFP | véase Poncini et al., 2017 | MYB51 línea reportera | YFP (es decir, 3xmVenus con NLS) |
| Tubos de reacción 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Rendimiento probado |
| Agitador rotativo (orbital) | Edmund Bü hler | SM 30 C control | |
| Arena (arena para pájaros) | Pet Bistro, Mü ller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum tipo silvestre | véase Chavarro-Carrero et al., 2021 | Tipo: Moneymaker | |
| Thoma cámara de conteo de células | Marienfeld | 642710 | profundidad 0,020 mm; 0,0025 mm2 |
| Agua ultrapura (Milli-Q agua purificada) | MERK | IQ 7003/7005 | agua obtenida después de la purificación |
| Verticillium dahliae | véase Reusche et al., 2014 | aislado JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise y von Tiedemann, cepa | Vl43 |
Referencias
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J.
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Reimpresiones y permisos
