Detección de acumulación y reparación de brechas post-replicativas en células humanas utilizando el ensayo de fibra de ADN

Davi J. Martins; Stephanie Tirman; Annabel Quinet; Carlos F. M. Menck

doi:10.3791/63448

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Artículo de método

Detección de acumulación y reparación de brechas post-replicativas en células humanas utilizando el ensayo de fibra de ADN

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DOI:

10.3791/63448

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3 de febrero de 2022

Davi J. Martins^*¹ , Stephanie Tirman^*² , Annabel Quinet² , Carlos F. M. Menck¹

¹Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, ²Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos dos modificaciones del ensayo de fibra de ADN para investigar las brechas de ADN de cadena simple en la replicación del ADN después de la inducción de la lesión. El ensayo de fibra S1 permite la detección de huecos post-replicativos utilizando la endonucleasa S1 específica de ssDNA, mientras que el ensayo de llenado de huecos permite la visualización y cuantificación de la reparación de huecos.

Resumen

El ensayo de fibra de ADN es un método simple y robusto para el análisis de la dinámica de la bifurcación de replicación, basado en la inmunodetección de análogos de nucleótidos que se incorporan durante la síntesis de ADN en células humanas. Sin embargo, esta técnica tiene una resolución limitada de unos pocos miles de kilobases. En consecuencia, las brechas de ADN monocatenario post-replicativo (ssDNA) tan pequeñas como unos pocos cientos de bases no son detectables por el ensayo estándar. Aquí, describimos una versión modificada del ensayo de fibra de ADN que utiliza la nucleasa S1, una enzima que escinde específicamente el ssDNA. En presencia de brechas de ssDNA post-replicativas, la nucleasa S1 apuntará y cortará las brechas, generando tractos más cortos que se pueden usar como lectura para las brechas de ssDNA en bifurcaciones en curso. Estas brechas post-replicativas de ssDNA se forman cuando el ADN dañado se replica discontinuamente. Se pueden reparar a través de mecanismos desacoplados de la replicación del genoma, en un proceso conocido como llenado de huecos o reparación post-replicativa. Debido a que los mecanismos de llenado de brechas involucran la síntesis de ADN independientemente de la fase S, las alteraciones en el esquema de etiquetado de fibras de ADN también se pueden emplear para monitorear los eventos de llenado de brechas. En conjunto, estas modificaciones del ensayo de fibra de ADN son estrategias poderosas para comprender cómo se forman y llenan los vacíos post-replicativos en el genoma de las células humanas.

Introducción

Los trabajos seminales han proporcionado evidencia de la acumulación de brechas post-replicativas de cadena simple (ssDNA) tras el tratamiento con agentes dañinos para el ADN en bacterias¹ y células humanas ^2,3. Durante la replicación de plantillas de ADN dañadas, la maquinaria de síntesis de ADN puede eludir las lesiones mediante el empleo de ADN polimerasas de síntesis de translesión específicas o a través de mecanismos de cambio de plantilla. Alternativamente, el replisoma también puede simplemente omitir la lesión dejando un espacio de ssDNA detrás, para ser reparado más tarde. Más ....