Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

Resumen

Aquí, describimos un conjunto de métodos para caracterizar la interacción de proteínas con membranas de células o microvesículas.

Resumen

En el cuerpo humano, la mayoría de las principales reacciones fisiológicas involucradas en la respuesta inmune y la coagulación de la sangre proceden en las membranas de las células. Un primer paso importante en cualquier reacción dependiente de la membrana es la unión de la proteína en la membrana de fosfolípidos. Se ha desarrollado un enfoque para estudiar la interacción de las proteínas con las membranas lipídicas utilizando proteínas marcadas fluorescentemente y citometría de flujo. Este método permite el estudio de las interacciones proteína-membrana utilizando células vivas y vesículas de fosfolípidos naturales o artificiales. La ventaja de este método es la simplicidad y disponibilidad de reactivos y equipos. En este método, las proteínas se etiquetan utilizando colorantes fluorescentes. Sin embargo, se pueden utilizar proteínas autofabricadas y disponibles comercialmente, marcadas fluorescentemente. Después de la conjugación con un colorante fluorescente, las proteínas se incuban con una fuente de la membrana de fosfolípidos (microvesículas o células), y las muestras se analizan por citometría de flujo. Los datos obtenidos se pueden utilizar para calcular las constantes cinéticas y el equilibrio K_d. Además, es posible estimar el número aproximado de sitios de unión a proteínas en la membrana de fosfolípidos utilizando perlas de calibración especiales.

Introducción

Las biomembranas separan el contenido interno de las células animales y el espacio extracelular. Tenga en cuenta que las membranas también rodean las microvesículas formadas durante el ciclo de vida de la célula y los orgánulos. La membrana celular está compuesta predominantemente de lípidos y proteínas. Las proteínas de membrana realizan funciones de señalización, estructurales, de transporte y adhesivas. Sin embargo, la bicapa lipídica también es esencial para la interrelación de la célula animal con el espacio extracelular. Este artículo propone un método para estudiar la interacción periférica de las proteínas externas con la membrana lipídica.

Protocolo

1. Etiquetado de proteínas fluorescentes

1. Preparación de materiales
   1. Prepare 1 M Tampón de bicarbonato de sodio, pH 9.0, guárdelo a 4 ° C y úselo dentro de una semana.
   2. Prepare 1.5 M de tampón de clorhidrato de hidroxilamina, pH 8.5, inmediatamente antes de su uso.
   3. Preparar una solución de 10 mg/ml de colorante fluorescente (ver la Tabla de Materiales) en dimetilsulfóxido.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar durante un mes a -20 °C en la oscuridad.
   4. Preparar soluciones de anticuerpos purificados u otras proteínas a 1-10 mg/ml.
      NOTA: Evite los tampones que contengan iones de amoni....

Resultados

El método de citometría de flujo descrito en este documento se utiliza para caracterizar la unión de las proteínas de coagulación plasmática a las plaquetas activadas. Además, se aplicaron vesículas de fosfolípidos PS:PC 20:80 como sistema modelo. Este artículo se centra principalmente en las vesículas artificiales de fosfolípidos como ejemplo. Los parámetros del citómetro, en particular, la tensión del tubo fotomultiplicador (PMT) y la compensación deben seleccionarse para cada dispositivo específico, el objeto de estud.......

Discusión

El método propuesto se puede adaptar para una caracterización aproximada de la interacción de proteínas con membranas de fosfolípidos de diversas fuentes y composiciones. La citometría de flujo cuantitativa descrita aquí concede a la resonancia de plasmón de superficie (SPR) en varios parámetros. En particular, tiene una menor sensibilidad y resolución de tiempo y requiere un etiquetado fluorescente de proteínas. El etiquetado fluorescente puede conducir a un cambio en la conformación y la pérdida de actividad de muchas .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific	A37573	colorante fluorescente
Apirasa de patatas	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
albúmina sérica bovina	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
Cloruro de calcio, anhidro, en polvo, ≥ 97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Espectrómetro de fluorescencia Cary Eclipse	Agilent
D-(+)-Glucosa	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindocarbocianina Perclorato)	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
Sal disódica EDTA	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		software de adquisición de datos de citometría
FlowJo	Tree Star		software de citómetro para análisis de datos
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Human Factor X	Investigación enzimática	HFX 1010
Clorhidrato de hidroxilamina	Panreac	141914.1209
L-&alfa;-fosfatidilcolina (Cerebro, Porcino)	Avanti Lípidos Polares	840053P
L-&alfa;-fosfatidilserina (Cerebro, Porcino) (sal sódica)	Avanti Lípidos Polares	840032P
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-Extrusora	Avanti Lípidos polares	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Software estadístico
Tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS), grado biotecnológico	VWR Ciencias de la vida AMRESCO	97062-732
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandina E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01 medio de filtración en	gel para la purificación de proteínas
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	medio de filtración en gel para la purificación de plaquetas
Bicarbonato de sodio	Corning	61-065-RO
Cloruro de sodio	Sigma	Aldrich S3014-500G
Fosfato de sodio monobásico	Sigma Columnas de	S3139-250G
con membrana 0.2 y micro; m	Sartorius	VS0171
Citrato trisódico dihidratado	Sigma Aldrich	S1804-1KG