Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la filamentosa Cyanobacterium Phormidium lacuna

2.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 de febrero de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

En este artículo

Resumen

Phormidium lacuna es una cianobacteria filamentosa que se aisló de las piscinas de rocas marinas. Este artículo describe el aislamiento de filamentos de fuentes naturales, la extracción de ADN, la secuenciación del genoma, la transformación natural, la expresión de sfGFP, la crioconservación y los métodos de motilidad.

Resumen

Las cianobacterias son el foco de la investigación básica y los proyectos biotecnológicos en los que la energía solar se utiliza para la producción de biomasa. Phormidium lacuna es una cianobacteria filamentosa recién aislada. Este artículo describe cómo se pueden aislar nuevas cianobacterias filamentosas de las piscinas de rocas marinas. También describe cómo se puede extraer el ADN de los filamentos y cómo se pueden secuenciar los genomas. Aunque la transformación se establece para muchas especies unicelulares, se informa con menos frecuencia para las cianobacterias filamentosas. Aquí se describe un método simplificado para la transformación natural de P. lacuna. P. lacuna es el único miembro del orden Oscillatoriales para el que se establece la transformación natural. Este artículo también muestra cómo se utiliza la transformación natural para expresar la proteína fluorescente verde supercarpeta (sfGFP). Un promotor endógeno de cpcB indujo aproximadamente 5 veces más fuerte la expresión que los promotores cpc560, A2813 o psbA2 de Synechocystis sp. PCC6803. Además, se estableció un método para la criopreservación de P. lacuna y Synechocystis sp.CPP 6803, y se describen métodos para evaluar la motilidad en un medio líquido y en superficies de agar y plástico.

Introducción

Las cianobacterias son organismos procariotas que utilizan la fotosíntesis como fuente de energía 1,2. La investigación se centra cada vez más en las especies de cianobacterias. Varias cianobacterias se pueden transformar con ADN3. Los genes pueden ser eliminados o sobreexpresados en estas especies. Sin embargo, la transformación está restringida a unas pocas especies 4,5,6,7,8,9,10,11, y puede ser difícil establecer la transformación en cepas de colecciones de cultivo o silvestres 8. Las cepas de la especie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) se aislaron de piscinas de rocas marinas, en las que las condiciones ambientales, como las concentraciones de sal o la temperatura, fluctúan con el tiempo. Estas cianobacterias filamentosas pueden ser utilizadas como organismos modelo para el orden Oscillatoriales12 al que pertenecen.

Durante los ensayos que probaron la transferenciade genes por electroporación 13,14 se encontró que P. lacuna puede ser transformada por transformación natural15. En este proceso, el ADN es absorbido naturalmente por algunas células. En comparación con otros métodos de transformación16,17, la transformación natural tiene la ventaja de no requerir herramientas adicionales que podrían complicar el procedimiento. Por ejemplo, la electroporación requiere cubetas adecuadas, cables intactos y selección del voltaje adecuado. P. lacuna es actualmente el único miembro de Oscillatoriales susceptible a la transformación natural. Debido a que el protocolo original se basa en protocolos de electroporación, todavía incluía varios pasos de lavado que podrían ser innecesarios. Se probaron diferentes enfoques para simplificar el protocolo, lo que llevó al protocolo de transformación que se presenta aquí.

La secuencia del genoma es esencial para futuros estudios moleculares basados en la eliminación o sobreexpresión de genes. Aunque las secuencias del genoma se pueden obtener con máquinas de secuenciación de próxima generación en períodos cortos, la extracción de ADN puede ser difícil y depende de la especie. Con P. lacuna, se probaron varios protocolos. Luego se estableció un método basado en bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) modificado, lo que resultó en una pureza aceptable de los rendimientos de ADN y ADN de cada ciclo de purificación para el trabajo continuo en el laboratorio. El genoma de cinco cepas podría secuenciarse con este protocolo. El siguiente paso lógico de transformación fue establecer la expresión de proteínas en P. lacuna.

El sfGFP utilizado como proteína marcador en este protocolo se puede detectar con cualquier microscopio de fluorescencia. Todos los promotores que se probaron se pudieron utilizar para la expresión de P. lacuna sfGFP. El creciente número de cepas derivadas de la transformación ha dado lugar a la necesidad de un método para almacenar los cultivos. Tales métodos se establecen para Escherichia coli y muchas otras bacterias18. En los protocolos estándar, los cultivos de glicerol se preparan, se transfieren en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. Este método requiere solo unos pocos pasos y es altamente confiable para aquellas especies para las que está establecido. El protocolo estándar no era factible para P. lacuna porque las células vivas no podían recuperarse en todos los casos. Sin embargo, cuando se eliminó el glicerol después de la descongelación, las células de todos los ensayos sobrevivieron. Se presentan métodos simples para el análisis de la motilidad de P. lacuna, que se pueden combinar con mutagénesis knockout para investigar el pili tipo IV o el papel de los fotorreceptores. Estos ensayos son diferentes de los de las cianobacterias unicelulares 19,20,21 y también pueden ser útiles para otros oscilatorios.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Aislamiento del medio natural

NOTA: Se pueden aislar algas verdes, diatomeas, cianobacterias filamentosas y otras microalgas. El protocolo se puede utilizar para cualquier especie de microalga de piscinas de roca que crecen en condiciones de laboratorio. Las cianobacterias filamentosas que pertenecen a Oscillatoriales se pueden reconocer fácilmente por su movimiento y forma filamentosa. La especie se puede identificar en un estado semipuro mediante secuenciación del genoma o secuenciación de ARNr 16S.

  1. Transfiera muestras líquidas de agua de mar de piscinas de rocas marinas (es decir, cavidades en la costa rocosa) a matraces de 50 ml. Para cada matraz, anote el lugar exacto o las coordenadas de la fuente natural. Si es posible, filtre el contenido a través de redes de 50 μm para reducir las cantidades de zooplancton. Conservar las muestras a 4 °C hasta que puedan ser subcultivadas.
  2. Transferir 1 ml de cultivos a placas de Petri de 10 cm que contengan bactoa-agar al 3% en f/2 medio22,23 (ver la Tabla de Materiales). Preparar hasta 20 platos. Cultivar bajo luz blanca de 50 μmol m-2 s-1.
    NOTA: Se pueden utilizar intensidades de luz más altas para el cultivo. La intensidad de hasta 400 μmol m-2 s-1 se puede utilizar para P. lacuna, aunque otras especies podrían ser más sensibles a la luz.
  3. Después de una semana, transfiera las células deseadas a placas de agar fresco usando fórceps estériles. Aislar las células bajo un microscopio binocular en condiciones estériles. Guarde la placa de agar vieja a 4 °C hasta que aparezcan las células y crezcan en la nueva placa de agar.
  4. Repita este paso de transferencia cada semana para eliminar la contaminación. Utilice el ojo desnudo para detectar una gran contaminación y un microscopio con aumento de 400x para comprobaciones adicionales de contaminación.
  5. Si una muestra parece libre de contaminación, analice la contaminación bacteriana o fúngica en las placas de agar. Transfiera una fracción del cultivo con un lazo de inoculación a una placa de agar LB24 (10 cm de diámetro), mantenga la placa a temperatura ambiente y verifique el crecimiento de contaminantes durante 1-3 días.
  6. Si se obtiene una especie de cianobacteria filamentosa estéril, úsela para trabajos de cultivo adicionales. Cultive P. lacuna en líquido o en placas de bacto-agar. Utilice matraces de 250 ml con 50 ml de medio f/2 o medio f/2+ para el cultivo líquido.

2. Extracción de ADN

NOTA: Este método se adopta del 25 al 26

  1. Preparar dos matraces con 50 mL de f/2 medio. Inocular cada uno con ~1 mL de filamentos de P. lacuna de otros cultivos en crecimiento. Mantenga los cultivos durante 7 días o más bajo agitación (rotación horizontal) a 50 rpm bajo luz blanca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C.
  2. Tratar el cultivo con ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 2 min con plena energía. Medir OD a 750 nm; verifique que sea ~ 0.5. Continúe cultivando las culturas si el OD es demasiado bajo.
  3. Recoger los filamentos mediante centrifugación de 5.000 × g, 20 min. Retire el sobrenadante. Transfiera los filamentos con líquido residual a la cámara de una prensa francesa27. Ajuste la presión de la prensa francesa a 20.000 psi y extraiga las células.
    NOTA: La prensa francesa lisará todas las células y liberará el ADN; fuertes fuerzas de cizallamiento producirán fragmentos de ADN de 1.500 pb.
  4. Centrifugar la muestra durante 10 min a 10.000 × g y retirar el sobrenadante.
  5. Añadir 400 μL de tampón de lisis (4 M de urea, 0,1 M de Tris/Cl, pH 7,4) y 50 μL de proteinasa K (10 mg/ml) al pellet. Calentar la muestra a 55 °C durante 60 min con agitación a 550 rpm.
  6. Añadir 1 mL de tampón de extracción de ADN (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M TDT, pH 8) e incubar durante 60 min a 55 °C y 550 rpm. Transfiera las soluciones a los tubos de centrifugación y agregue dos volúmenes de cloroformo/isoamilalcohol (24/1).
  7. Después de agitar, centrífugue la muestra durante 5 min a 9.000 × g. Transfiera la fase acuosa superior a viales de reacción y agregue 1 ml de etanol helado y 50 μL de acetato de sodio 3 M.
  8. Vórtice la muestra y colóquela a -20 °C durante 1 h o más.
  9. Centrifugar durante 5 min a 10.000 × g (4 °C) y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet con etanol al 70%.
  10. Centrifugar la muestra de nuevo. Retire el sobrenadante y seque el pellet durante la noche. Disolver el ADN en agua libre de nucleasas. Mida el espectro de ADN para comprobar si el OD 260 nm/OD 280 nm está entre 1,6 y 1,9.
  11. Analizar el tamaño del ADN en un gel de electroforesis de agarosa28.
  12. Secuenciar el ADN genómico mediante secuenciación de próxima generación durante 300 ciclos, con un ajuste de extremo pareado y una longitud de lectura de 150 bases (consulte las Tablas de materiales).
  13. Realizar el montaje con el programa informático adecuado; véase el ejemplo que figura en la Tabla de materiales.
  14. Envíe el borrador del genoma al servidor RAST para su anotación.
    NOTA: Cargue secuencias de ADN para obtener una anotación completa en unos minutos.

3. Transformación natural y expresión GFP

NOTA: La transformación se basa en un vector plásmido propagado en E. coli; pGEM-T o pUC19 se pueden utilizar como vectores troncales. Las técnicas de clonación se establecen en muchos laboratorios; véanse también los protocolos estándar28 y los artículos sobre vectores de transformación para P. lacuna15,29. Los ejemplos de vectores para la expresión sfGFP se describen en la sección de resultados representativos. Los detalles de cuatro vectores aún no publicados se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

  1. Realice todos los pasos utilizando material estéril en condiciones de laboratorio estériles (banco limpio, cristalería estéril).
  2. Inocular 2 x 50 mL de medio líquido f/2 en dos matraces de 250 mL con 2 x 1 mL de filamentos de P. lacuna de un cultivo en funcionamiento. Cultivar en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) bajo agitación (rotación horizontal, 50 rpm) durante ~5 días a 25 °C.
  3. Prepare ~ 200 μg del ADN del vector de transformación utilizando un kit de preparación midi (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Homogeneizar 100 mL de suspensión de células de P. lacuna (ver tabla de materiales) a 10.000 rpm durante 3 min. Mida OD a 750 nm (valor deseado = 0,35).
  5. Centrifugar la suspensión celular durante 15 min a 6.000 × g. Retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 800 μL (volumen total, incluido el líquido residual y los filamentos) del líquido restante y el medio f/2+ adicional.
  6. Tomar ocho placas de bacto-agar f/2+ (10 cm de diámetro) que contengan 120 μg/ml de kanamicina. Pipetear 10 μg de ADN en el centro de cada placa de agar. Pipetee inmediatamente 100 μL de suspensión celular en el centro de cada placa de agar (en la parte superior del ADN).
  7. Mantenga la placa de agar sin tapa en el banco limpio para permitir que el exceso de líquido se evapore. Cierre la placa y cultive en luz blanca a 25 °C durante 2 días.
  8. Distribuya los filamentos de cada placa de agar con un lazo de inoculación en varias placas frescas de bacto-agar f/2+ que contengan 120 μg/ml de kanamicina. Cultive las placas en luz blanca a 25 °C y revise los cultivos regularmente bajo un microscopio.
  9. Identifique filamentos vivos y transformados después de 7-28 días bajo el microscopio. Busque filamentos verdes sanos (Figura 2) que sean diferentes de otros filamentos. Si se pueden identificar estos filamentos verdes, continúe con el siguiente paso; de lo contrario, mantenga el plato durante otros 7 días.
  10. Use fórceps para transferir estos filamentos vivos identificados a 50 ml de medio líquido f/2+ con 250 μg/ml de kanamicina. Cultivar en luz blanca a 25 °C en un agitador (rotación horizontal, 50 rpm). Observe el crecimiento hasta por cuatro semanas.
  11. Transfiera los filamentos de nuevo al medio de agar que contiene 250 μg/ml de kanamicina y espere a que los filamentos crezcan. Después de varios días, transfiera filamentos individuales a una placa de agar fresco con una mayor concentración de kanamicina, por ejemplo, 500 μg / ml. Mantenga la placa original.
  12. Asegúrese de que los filamentos se propaguen en una alta concentración de kanamicina en cultivo líquido o en agar. Aumentar la concentración de kanamicina de nuevo para acelerar la segregación.
    NOTA: P. lacuna transformada crece en hasta 10.000 μg/ml de kanamicina. Otras especies podrían no tolerar concentraciones tan altas.
  13. Si las células resistentes se cultivan y distribuyen ampliamente sobre una placa, pruebe la integración del inserto en el genoma de P. lacuna mediante la realización de PCR con cebadores externos e internos.
    1. Utilice cebadores que fueron diseñados para la clonación de la inserción como cebadores internos.
    2. Para el diseño de los cebadores externos, seleccione secuencias que sean 5' y 3' del sitio de inserción propuesto en el genoma de P. lacuna pero fuera de la inserción.
    3. Para las reacciones de PCR, use imprimaciones internas y cebadores externos. Utilice la(s) cepa(s) resistente(s) y el tipo salvaje.
      NOTA: Los cebadores internos indican que el inserto está presente; Los cebadores externos muestran que el inserto se inserta en el locus correcto.
  14. Para cada reacción de PCR, coloque ~ 10 mg de los filamentos directamente en los tubos de PCR y realice PCR de acuerdo con los protocolos estándar24. Si no se obtiene ningún producto, varíe la temperatura de recocido y lave los filamentos con agua.
    NOTA: Se pueden usar muchas polimerasas diferentes en la PCR. Las polimerasas estándar, como la polimerasa Taq, tienen una tasa de error más alta que las polimerasas de comprobación de errores, que son más caras. Esta PCR analítica no requiere ninguna polimerasa de comprobación de errores. Sin embargo, se debe probar la polimerasa de comprobación de errores si no se obtiene ningún producto de PCR con una polimerasa estándar.
  15. Analizar los productos de PCR de la línea resistente sobre electroforesis de agarosa24.
    1. Compare las posiciones de la banda con el marcador y compare el tipo salvaje y el transformante. Con imprimaciones internas y externas, busque una banda más grande para el transformador que el tipo salvaje (debido a la inserción del cassette de resistencia) o dos bandas para el transformador: una con el tamaño de la banda de tipo salvaje y otra más grande. Como este último caso indica una segregación incompleta, continúe el cultivo con altas concentraciones de kanamicina.
      NOTA: Para obtener más detalles sobre la PCR y la electroforesis, consulte15,24 u otra literatura estándar.
  16. Para la expresión de GFP: observe filamentos individuales con un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales) a un aumento del objetivo establecido en 40x o 63x. Capture una imagen de transmisión de campo brillante y una imagen de fluorescencia. Utilice los siguientes ajustes para GFP: paso de banda de 470 nm para la excitación, paso de banda de 525 nm para la emisión y un divisor de haz de 495 nm, tiempo de exposición inicial de 500 ms.
  17. Ajuste el tiempo de exposición para obtener señales de fluorescencia claras, evitando intensidades de saturación. Intente utilizar la misma configuración para todas las muestras.
  18. Como los filamentos de tipo salvaje también mostrarán fluorescencia, capture imágenes con la misma configuración que la anterior para esta fluorescencia de fondo.
    NOTA: La cepa que expresa GFP debe tener una señal más alta; de lo contrario, no está expresando GFP.
  19. En función de los tiempos de exposición y las intensidades de píxeles de las imágenes de fluorescencia, calcule y compare el contenido de GFP de los diferentes filamentos.

4. Crioconservación

NOTA: P. lacuna y la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. Se utiliza PCC 6803. El método actual funciona mejor para P. lacuna.

  1. Cultivar P. lacuna o Synechocystissp PCC 6803 durante al menos 10 días en 10 mL de medio f/2+ o BG-11, respectivamente, bajo luz blanca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C bajo agitación (rotaciones horizontales, 50 rpm).
  2. Homogeneizar el cultivo de P. lacuna (ver la Tabla de Materiales) a 10.000 rpm durante 3 min o con un dispositivo de ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 2 min a plena energía. Determine OD 750 nm de cualquiera de las referencias culturales para comprobar si el valor está entre 1 y 7.
  3. Recoger las células por centrifugación a 6.000 × g durante 15 min. Retire el sobrenadante.
  4. Suspender el pellet celular en 800 μL de medio f/2+ o BG-11 (volumen final) y transferirlo a un criovial de 2 mL. Añadir 800 μL de una solución de glicerol al 50% a la suspensión celular. Cierre el vial y mezcle invirtiendo repetidamente.
  5. Transfiera el criovial al nitrógeno líquido y guárdelo en un criobox en un congelador de -80 °C. Anote la posición de la caja dentro del congelador y las coordenadas de la muestra dentro de la caja.
  6. Para la recuperación de las células, saque el criovial y descongele el contenido a temperatura ambiente. Transfiera el contenido a un tubo de reacción de 2 ml.
  7. Lave la muestra dos veces. Para el1er lavado, centrifugar a 6.000 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de medio f/2+ o BG-11. Para elsegundo lavado, recentrífugo a 6.000 × g durante 5 min, retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 2 ml de medio f/2+ o BG-11.
  8. Para comprobar la integridad de estas células que están listas para el cultivo, transfiera el pellet a 9 mL de medio y cultivarlos en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) bajo agitación (55 rpm). Compare los OD 750 nm del cultivo el primer día y después de 1 semana.

5. Motilidad de Phormidium lacuna

NOTA: Se describirán tres ensayos diferentes. La misma cultura se utiliza en todos los casos.

  1. Cultive P. lacuna en medio f/2 bajo agitación horizontal (50 rpm) en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) durante ~5 días hasta que el OD estimado de 750 nm sea de 0.35. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso.
  2. Homogeneizar los filamentos (ver la Tabla de Materiales) a 10.000 rpm durante 3 min o con ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 1 min a potencia máxima y ciclo de 1. Medida OD 750 nm. Si está por encima de 0,35, diluya la fracción con f/2 medio. Utilice esta solución en ensayos de motilidad en los pasos 5.3, 5.4 y 5.5.
  3. Ensayo para el movimiento en medio líquido
    1. Para la observación directa de la motilidad, transfiera 8 ml de medio que contenga P. lacuna (a partir del paso 5.2) a una placa de Petri de 6 cm. Espere unos minutos hasta que la muestra alcance la temperatura ambiente. Cubra la placa de Petri con papel de celofán.
    2. Coloque un portaobjetos de microscopio en la mesa x-y de un microscopio estándar con una cámara. Encienda la luz del microscopio. Idealmente, siempre use la misma configuración eléctrica y óptica para la iluminación. Mueva un objetivo 4x o 10x en el camino de la luz.
    3. Coloque la placa de Petri en la parte superior de la diapositiva. Ajuste filamentos individuales o haces de filamentos por los movimientos x, y y z de la mesa.
      NOTA: Debido a la disposición tridimensional, solo una parte de la sección relevante puede estar enfocada. La lámina de celofán permite ajustar el enfoque sin restricciones.
    4. Observe los movimientos de filamentos individuales o haces. Asegúrese de que la lente del objetivo no toque el líquido. Grabe los movimientos de los filamentos con una cámara de microscopio estándar (consulte el video suplementario S1).
  4. Ensayo para el movimiento en la superficie
    1. Para la observación de la motilidad del filamento en superficies de agar, prepare placas de Petri de 6 cm con f/2 bacto-agar. Asegúrese de que el agar sea lo suficientemente alto como para que la lente del objetivo se acerque a la superficie del agar. Alternativamente, prepare una capa de agar de ~ 3 mm de espesor y registre los filamentos a través del agar (mantenga la placa boca abajo o use un microscopio invertido).
    2. Pipetear 0,5 ml de una solución que contenga P. lacuna (a partir del paso 5.2) sobre la superficie de bacto-agar de una placa de Petri de 6 cm. Permita que el líquido entre en la superficie. Cierre la placa de Petri y observe el movimiento de los filamentos en la superficie utilizando un objetivo de 4x o 10x.
    3. Asegúrese de que se utilizan los mismos ajustes eléctricos y ópticos del microscopio durante toda la grabación y en las grabaciones posteriores.
    4. Capture grabaciones de lapso de tiempo utilizando una cámara ocular y un sistema de minicomputadora. Asegúrese de que el intervalo de tiempo entre las imágenes posteriores sea de 5 s-1 min. Programe el script Linux de la minicomputadora para controlar la grabación de lapso de tiempo. Consulte el archivo complementario 2 para ver un script de ejemplo y el vídeo suplementario S2 como ejemplo.
  5. Ensayo para fototaxis
    1. Para experimentos de fototaxis, prepare soportes de diodos emisores de luz (LED) (aquí, con una impresora 3D) en los que se montan los LED de 5 mm seleccionados para irradiar un área de 20 mm2 de abajo hacia arriba (Figura 3). Si es necesario, use muchos soportes LED en paralelo, conectando cada LED eléctricamente a través de una resistencia y potenciómetro a una fuente de alimentación ajustable. Mida y ajuste las intensidades del LED, dependiendo del experimento. Asegúrese de que toda la configuración esté en una habitación oscura o en un recipiente oscuro cerrado.
    2. Coloque 8 ml del medio que contiene P. lacuna (a partir del paso 5.2) en una placa de Petri de 6 cm. Ajuste la intensidad de la luz del LED. Cierre la placa de Petri con la tapa y colóquela en un soporte LED para que el LED esté en el centro de la placa de Petri.
    3. Después de la duración deseada (generalmente 2 días), capture una imagen de la placa de Petri con una cámara de teléfono inteligente dirigida directamente a la posición del tratamiento de luz. Utilice un panel LED blanco para la irradiación de la muestra. Utilice la configuración manual de la cámara; evitar los reflejos de la luz; ajuste siempre para obtener la misma distancia entre la lente de la cámara y la muestra. Asegúrese de que la configuración de exposición proporcione una imagen adecuada para análisis posteriores utilizando ImageJ.
    4. Cuantifique el diámetro del círculo central de filamentos utilizando el software ImageJ.
      1. Abra ImageJ, haga clic en archivo | Abrir, seleccione el archivo deseado y haga clic en Entrar.
      2. Seleccione el botón Recto (con una línea recta). Pulse el botón izquierdo del ratón para dibujar una línea desde un extremo de la placa de Petri hasta el extremo opuesto. Asegúrese de que la línea pase a través del centro del círculo de filamentos.
      3. Presione Ctrl-K en el teclado o haga clic en Analizar | Trazar perfil en el menú ImageJ. Busque una ventana x-y con intensidades de píxeles trazadas frente a distancia: un perfil 1D de la placa de Petri. Asegúrese de que la intensidad de píxeles más baja esté ligeramente por encima de 0 y el valor más alto por debajo de 255.
      4. Calcule un valor promedio para la intensidad de píxeles fuera del círculo y otro valor promedio para la intensidad de píxeles en el círculo. En la posición y- entre estos valores, calcule los valores x de ambos lados del círculo apuntando con el ratón a estas posiciones. Anote ambos valores y calcule la diferencia.
      5. Obtenga el valor x más alto apuntando el ratón al eje y de la derecha. Nótese que este valor e representa el diámetro de la placa de Petri. Si este diámetro es de 5 cm, calcule el diámetro del círculo central del filamento como d/e × 5 cm.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Siguiendo los métodos mencionados anteriormente, se aislaron 5 cepas diferentes de P. lacuna de los pozos de rocas y se secuenciaron (Figura 1 y Tabla 1). Todos los cultivos fueron estériles después de ~ 1 año de subcultivo excepto P. lacuna HE10JO. Esta cepa todavía está contaminada con Marivirga atlantica, una bacteria marina. Durante las excursiones posteriores a Helgoland, otras cianobacterias filamentosas se aislaron de piscinas de roca, que s...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Aunque muchas cepas de cianobacterias están disponibles en colecciones de cultivo 32,33,34,35,36, todavía hay una demanda de nuevas cianobacterias de la naturaleza porque estas especies están adaptadas a propiedades específicas. P. lacuna se recogió de los pozos de roca y se adapta a las variaciones de las concentraciones de sal y la temperatura

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por el Instituto de Tecnología de Karlsruher.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Medios de cultivo
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Solución de agua dulceSigma AldrichC3061
BG-11 medioMerck73816-250ML
Ácido bóricoMerck10043-35-3H3BO3
Cloruro de calcio dihidratadoCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Matraces de cultivo celular Cellstar con tapón de rosca de filtro, estéril, 250 mLGreiner658190
Matraces de cultivo celular Cellstar con tapón de rosca de filtro, estéril, 50 mLCentrífuga de 601975
LYNX 4000Thermo Scientific75006580y rotor
Centrífuga microstar 17VWR InternationalN/Apara hasta 13.000 rpm
Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Cloroformo : Alcohol isoamílico 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Cloruro de cobalto (II) hexahidratadoMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
sulfato de cobre (II) pentahidratadoMerck7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotinaCarl Roth58-85-5  C10H16N2O3S escalera de
ADN 1 kbNew England BiolabsN3232
Escalera de ADN 100 bpNew England BiolabsN3231
Ayuda de pipeteo eléctrico accujet-pro SBrand GmbH26360para pipeteo 1-25 mL
EtanolVWR64-17-5C2H6O
Ácido etilendiamínico tetraacético sal disódica dihidratadoCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Microscopio de fluorescencia ApoTomeZeiss
Microscopio de fluorescencia Axio Imager 2Zeiss
Prensa francesa de celdas de presiónInstrument CompanyN/A
Sistema de documación en gel Saffe ImageInvitrogen
Sistema de gelelctroporesis Mupid-One/-exuADVANCED
Cristalería, diferente
GlicerolCarl Roth56-81-5C3H8O3
Cloruro de hierro (III) hexahidratadoMerck10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
KanamicinaSigma-Aldrich25389-94-0
Sulfato de kanamicinaCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroilsarcosina, Sal de Sodio (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Caldo (Lennox)Carl RothX964.4
Fuente de luz, tubo fluorescente L18W/954 luz diurnaOSRAMcultivo de cianobacterias
Fuente de luz, panel LED XL 6500K 140 WBloom StarN/A cultivode cianobacterias, hasta 1.000 µ mol m-2 s-1
Cloruro de magnesio hexahidratadoCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Cloruro de manganeso (II) tetrahidratadoServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Microscopio DM750Zeiss
Kit de extracción de plásmidos de preparación Midi NucleoBond Xtra Kit MidiMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Miniordenador Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDpara grabación time-lapse
Cámara ocular EC3Leicapara grabación continua de hasta 30 s
Cámara ocular MikrOkular Full HDBresserpara grabaciones de lapso de tiempo, acoplado a Raspberry Pi miniordenador
Placas de Petri poliestirol, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Placas de Petri poliestirol, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Fotómetro Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Fotómetro Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1.000 y micro; LGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 y micro; LGilsonSKU: FA10004M
Pipetas de plástico de 10 mL, estérilesGreiner607107
Tubo de plástico, estéril, 15 mLGreiner188271
Tubo de plástico, estéril, 50 mLGreiner227261
Bromuro de potasioCarl Roth7758-02-3KBr
Cloruro de potasioCarl Roth7447-40-7KCl
Fuente de alimentación Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
Fuente de alimentación Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicspara proteinasa LED
KPromegaMC500Cde Maxwell Kit de tejido de 16 miRNA AS1470
Q5 polimerasaNew England BiolabsM0491S
Kit de secuenciación NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sistema de secuenciación NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instrumentospara el cultivo
Acetato de sodioCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Cloruro de sodioCarl Roth7647-14-5NaCl
Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratadoCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Fluoruro de sodioCarl Roth7681-49-4NaF
Carbonato de hidrógeno de sodioCarl Roth144-55-8NaHCO3
Molibdato de sodio dihidratadoServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
Nitrato de sodioMerck7631-99-4NaNO3
sulfato de sodioCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Cloruro de estroncio hexahidratadoCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Clorhidrato de tiaminaMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultrasónico UP100H con sonotrodo MS3Hielscher Tecnología de ultrasonidosUP100H
Ultraturrax Trituradora silenciosa MHeidolph Instrumentshomogeneizador
UreaCarl Roth57-13-6CH4N2O
Vitamina B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Solución0,3 y micro; M tiamina-HCl, 2,1 nM de biotina, 0,37 nM de cianocobalamina
Alambiques de agua, tratamiento de aguasVEOLIAELGA_21001
Sulfato de zinc heptahidratadoSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
ADNhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinehace grandes andamios a partir de lecturas cortas de ADN,
para el procesamiento de imágenes (intensidades de píxeles, diámetro del círculo)
>
Agua de mar artificial0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2,4 mM NaHCO3 ,0,84 mM KBr, 0,49 mM H3BO3, 90 y micro; M SrCl2, 72 y micro; M NaF
f/2 -agua de mar artificial en medio líquido, solución de oligoelementos al 0,1 % (v/v), solución vitamínica al 0,05 % (v/v), 0,88 mM NaNO3, 36 & M NaH2PO4 
f/2+ medio líquidof/2-medio, con NaNO3 y NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 y micro; M NaH2PO4
f/2+-agar% (p/v) de bactoagar, agua de mar artificial, solución de oligoelementos al 0,1 % (v/v), solución vitamínica al 0,05 % (v/v), 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4
/2-agar3 % (p/v) de agar bacto, agua de mar artificial, solución de oligoelementos al 0,1 % (v/v), solución vitamínica al 0,05 % (v/v), 0,88 mM NaNO3, 36 & M NaH2PO4Solución de
elementos traza0,36 mM NaH2PO4, 12 y micro; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4, 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 y micro; M MnCl2
0,3 µ M tiamina-HCl, 2,1 nM de biotina, 0,37 nM de cianocobalamina
Greiner American vitamínica tecnologías de agua gatb-minia programa para el ensamblaje de software ImageJ basado en LinuxEntrada de https://rast.nmpdr.org del servidor de anotación RAST: secuencia de ADN del genoma, detecta marcos de lectura abiertos, enumera secuencias de proteínas y sus funciones 3 fSolución vitamínica

Referencias

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515(2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440(2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454(2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Cianobacterias filamentosasmétodo de criopreservaciónextracción de ADNmicroscopía de fluorescenciaensayo de motilidadresistencia a la kanamicinacomparación de promotores
Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la filamentosa Cyanobacterium Phormidium lacuna
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.