Artículo de método

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal

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DOI:

10.3791/63471

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23 de diciembre de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

En este artículo

Resumen

Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.

Resumen

El transporte axonal mantiene la homeostasis neuronal al permitir el tráfico bidireccional de diversos orgánulos y cargas. Las interrupciones en el transporte axonal tienen consecuencias devastadoras para las neuronas individuales y sus redes, y contribuyen a una gran cantidad de trastornos neurológicos. Como muchas de estas condiciones involucran mecanismos autónomos y no autónomos celulares, y a menudo muestran un espectro de patología en todos los subtipos neuronales, los métodos para identificar y analizar con precisión los subconjuntos neuronales son imperativos.

Este artículo detalla los protocolos para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias en nervios ciáticos de ratones anestesiados. Se proporcionan instrucciones graduales para 1) distinguir las neuronas motoras de las sensoriales in vivo, in situ y ex vivo mediante el uso de ratones que expresan selectivamente proteínas fluorescentes dentro de las neuronas motoras colinérgicas; y 2) evaluar por separado o simultáneamente el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias. Estos enfoques intravitales complementarios facilitan la obtención simultánea de imágenes de diferentes cargas en distintos axones nerviosos periféricos para monitorear cuantitativamente el transporte axonal en la salud y la enfermedad.

Introducción

El sistema nervioso periférico (SNP) conecta el sistema nervioso central (SNC) a sus objetivos distales, permitiendo la transmisión de señales eferentes para ejercer control motor y señales aferentes para proporcionar retroalimentación sensorial. Utilizando la multitud de avances en genética de ratones, los científicos han desarrollado diferentes modelos de ratones para investigar muchas enfermedades / síndromes que afectan al SNP 1,2,3. Como la mayoría de las patologías neurodegenerativas son multifactoriales con contribuciones celulares autónomas y no autónomas 4,5, desenredar las patologías específicas de células / neuronas puede proporcionar información crucial y novedosa sobre los mecanismos de la enfermedad.

Con este fin, el desarrollo de ratones transgénicos con cromosomas artificiales bacterianos (BAC)6 ha permitido la expresión endógena selectiva de proteínas fluorescentes en subconjuntos específicos de neuronas. Por ejemplo, están disponibles ratones bac-transgénicos, que expresan proteína fluorescente verde (GFP) en neuronas colinérgicas7 o glicinérgicas8, o una variante de proteína fluorescente roja (tdTomato) en neuronas parvalbúmina-positivas9. Alternativamente, la expresión neuronal selectiva de proteínas fluorescentes se puede lograr a través de la tecnología Cre-loxP 10. Por ejemplo, las cepas de ratón que expresan Cre-recombinasa en subconjuntos de neuronas (por ejemplo, colina acetiltransferasa (ChAT)-Cre) se pueden criar con ratones que expresan una proteína fluorescente (por ejemplo, tdTomato o GFP) de un locus constitutivo (por ejemplo, Gt(ROSA)26Sor) bajo el control de un represor transcripcional flanqueado por sitios loxP11 (por ejemplo, generando ratones que expresan tdTomato solo en neuronas colinérgicas). De hecho, utilizando la recombinación de Cre-loxP, se han generado ratones transgénicos que expresan proteína fluorescente amarilla en axones del tracto corticoespinal descendente12.

Además, los avances recientes en la edición de genes CRISPR/Cas9, como ORANGE, permiten el etiquetado fluorescente de múltiples proteínas neuronales endógenas, con una expresión alcanzable a resolución a nanoescala13. Además, en combinación con cepas de ratón que expresan Cre, ORANGE-CAKE se puede utilizar para etiquetar múltiples proteínas endógenas en neuronas individuales13. Alternativamente, el rastreo neuronal mediado por virus también permite el etiquetado de subconjuntos neuronales y se puede lograr con combinaciones dirigidas de serotipos virales y / o promotores específicos de células 14,15,16,17.

Además de los métodos de marcado neuronal, las líneas de ratón también se han diseñado para expresar proteínas reporteras dirigidas a orgánulos específicos, como las mitocondrias que expresan la proteína fluorescente cian (Mito.CFP)18 o los autofagosomas que expresan GFP (LC3.GFP)19. Además, las líneas de ratón han sido diseñadas para evaluar la dinámica del calcio específicamente en las neuronas (por ejemplo, Thy1.GCaMP)20,21. En conjunto, con el avance de tales modelos, las nuevas aplicaciones experimentales permiten a los científicos hacer preguntas biológicas y patológicas más precisas sobre el SNC y el SNP.

El papel principal de los nervios motores periféricos es transmitir señales eléctricas al músculo esquelético para provocar movimiento. Además, y ocurriendo en escalas de tiempo más largas, los mensajes neuroquímicos y fisiológicos en forma de orgánulos diversos (por ejemplo, mitocondrias, endolisosomas, endosomas de señalización) atraviesan la red citoesquelética de manera unidireccional o bidireccional para ayudar a mantener la homeostasis neuronal 22,23,24. Las deficiencias en el transporte axonal tienen consecuencias desastrosas para la salud neuronal y están relacionadas con muchas enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativas25. A nivel molecular, las deficiencias en el transporte axonal pueden interrumpir los eventos fisiológicos que regulan la señalización sináptica y la plasticidad, la transcripción de genes y la traducción local en todo el axón26,27. Si bien existe una multitud de herramientas para estudiar estos eventos en células/neuronas cultivadas28,29, se requiere evaluar la dinámica del transporte axonal y los eventos biológicos ligados axonales in vivo para confirmar conocimientos clave sobre los procesos fisiológicos y patológicos30.

A lo largo de los años, el Laboratorio Schiavo ha optimizado los protocolos para hacer diversas preguntas sobre el transporte axonal 31,32,33,34,35,36. Estos experimentos se han expandido a partir del descubrimiento de que un fragmento atóxico marcado fluorescentemente de neurotoxina tetánica (HCT) se internaliza en terminales axónicos en el músculo esquelético a través de interacciones con nidogens y polisialogangliósidos37. Una vez internalizada, la HCT se transporta retrógradamente en endosomas de señalización rab7 positivos que contienen neurotrofina y que están destinados a los cuerpos celulares de las neuronas motoras y sensoriales 38,39,40,41. Paralelamente, los avances en la tecnología de imágenes han permitido el análisis en tiempo real de haces nerviosos periféricos y axones individuales en ratones vivos anestesiados30. La primera incursión en la evaluación de la dinámica del transporte axonal in vivo en patología reveló deficiencias presintomáticas en el transporte de endosomas de señalización y mitocondrias en el modelo de ratón SOD1G93A de esclerosis lateral amiotrófica (ELA)35. Es importante destacar que es poco probable que estos defectos representen simplemente consecuencias secundarias de la neurodegeneración, dado el hallazgo de que la pérdida de neuronas motoras puede ocurrir en ausencia de perturbaciones de transporte axonal en un modelo de ratón de la enfermedad de Kennedy42 y un modelo FUS mutante heterocigoto de ELA43. Tales déficits de transporte axonal se pueden remediar en ratones con ELA utilizando inhibidores de quinasas específicas33 o receptores del factor de crecimiento34. Además, el tratamiento de las neuronas con un bloqueador específico de la histona desacetilasa altera el transporte mitocondrial in vivo36. Más recientemente, informamos que la modulación dependiente de BDNF del transporte axonal está desregulada en distintos subtipos de neuronas motoras en ratones conELA 44.

Mediante el uso de un conjunto de herramientas en constante expansión para evaluar la dinámica del transporte axonal 28,29, este protocolo de video describe varias aplicaciones que permitirán una mayor comprensión de diferentes escenarios biológicos y patológicos. En primer lugar, los ratones transgénicos que expresan selectivamente proteínas fluorescentes en las neuronas colinérgicas (es decir, las neuronas motoras) se utilizan para discriminar entre axones motores y sensoriales tanto in vivo como ex vivo. La HCT marcada fluorescentemente se carga en endosomas de señalización en tres líneas transgénicas para diferenciar la dinámica de transporte axonal en distintas neuronas periféricas. El siguiente protocolo experimental detalla un enfoque de fluorescencia multiplex para evaluar el transporte mitocondrial específicamente en neuronas motoras mediante la cría de ratones ChAT.tdTomato con ratones Mito-CFP. Finalmente, se proporcionan instrucciones sobre cómo obtener imágenes simultáneas de mitocondrias y endosomas de señalización dentro del mismo axón in vivo.

Protocolo

Todos los manejos y experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) (1986) y fueron aprobados por el Comité de Ética del University College London - Queen Square Institute of Neurology.

1. Animales

  1. Alojar a todos los animales en jaulas ventiladas individualmente en un ambiente de temperatura y humedad controladas y mantenerlos en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua.
  2. Utilice ratones machos y hembras de las siguientes cepas transgénicas: 1) ratones heterocigotos Tg (Chat-EGFP) GH293Gsat / Mmucd, conocidos como ratones ChAT.eGFP; 2) heterocigoto B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J, denominado HB9. Ratones GFP; y 3) ratones heterocigotos B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J, denominados ratones Mito.CFP.
  3. Generar ratones ChAT.tdTomato cruzando ratones homocigotos B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/J, denominados ratones ChAT.Cre, con ratones homocigotos B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, denominados ratones Rosa26.tdTomato.
  4. Generar ChAT.tdTomato::Ratones Mito.CFP cruzando ratones heterocigotos ChAT.tdTomato con ratones heterocigotos Mito.CFP.

2. Inyecciones intramusculares de fluorescente HCT

  1. Preparación previa a la cirugía
    1. Exprese HCT (HCT441, residuos 875-1315) fusionado a una etiqueta mejorada rica en cisteína en bacterias como una proteína de fusión de glutatión-S-transferasa según 45. Etiquete HCT con AlexaFlour555 C2 maleimida31, dialícelo en tampón de diálisis helado (10 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, pH 7.4), congélelo en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C. Antes de realizar experimentos in vivo , primero pruebe HCT in vitro para una absorción y transporte exitosos en neuronas primarias.
    2. Diluir HCT fluorescente (por ejemplo, HCT-555) a una concentración final y experimentalmente consistente que oscile de 2,5 a 10 μg/μL en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en un tubo de 0,2 ml. En este paso, agregue más compuestos / factores a la solución de HCT si es necesario (por ejemplo, factor neurotrófico derivado del cerebro).
      NOTA: El volumen final debe ser apropiado para el tamaño del músculo (s) de interés. Por ejemplo, prepare un volumen de inyección de 3-4 μL para el músculo tibial anterior (TA) y ~ 1 μL para el músculo sóleo más pequeño. Mantenga la concentración de trabajo de HCT entre 2,5 y 10 μg/μL independientemente del volumen final.
    3. Mezcle la solución de HCT con una pipeta o vórtice, y gire brevemente hacia abajo a baja velocidad usando una centrífuga de escritorio para recoger el líquido y eliminar burbujas grandes. Proteja el HCT de la luz y el transporte en hielo.
    4. Use una micropipeta de vidrio tirado para inyecciones intramusculares óptimas en músculos más pequeños (por ejemplo, sóleo) o para inyecciones intrasciales del nervio. Tire de las micropipetas de vidrio graduadas (según 46) antes de la cirugía.
      NOTA: Para habilitar el pipeteo y restringir el flujo hacia arriba y hacia afuera de la parte posterior de la micropipeta, rompa cuidadosamente una pequeña pieza de la punta afilada con fórceps finos bajo un microscopio de disección. Tenga cuidado de desechar el extremo roto en el contenedor apropiado.
    5. Esterilizar y limpiar todas las herramientas quirúrgicas antes de su uso.
  2. Cirugía-inyecciones intramusculares
    1. Prepárese para la cirugía asegurando una cortina quirúrgica estéril en una estera térmica a 37 ° C. Coloque y enfoque el microscopio de operación. Para que comience la cirugía, desempaque en la cortina quirúrgica las herramientas quirúrgicas preesterilizadas, la cinta quirúrgica, los hisopos de algodón estériles, el etanol al 70% (v / v) en agua, solución salina estéril, suturas y una aguja Hamilton o micropipetas de vidrio tirado.
    2. Asegúrese de que la máquina anestésica tenga suficiente oxígeno e isoflurano durante la duración del procedimiento quirúrgico. Dirija el flujo de anestesia a la cámara de inducción y encienda la máquina anestésica.
      1. Para empezar, utilice un caudal de oxígeno de 1-2 L/min y 5% de isoflurano. Coloque el ratón en la cámara de inducción para iniciar la anestesia. Cuando el reflejo de enderezamiento está ausente, reduzca la anestesia a 2-3% de isoflurano, dirija el flujo de anestesia a la boquilla y transfiera el ratón a la boquilla ubicada en un área separada del espacio quirúrgico.
    3. Asegúrese de que los reflejos de abstinencia corneal y del pedal estén ausentes antes de afeitar el área de piel que cubre el músculo (s) que se inyectará. Cuando esté completo, retire la mayor cantidad posible de piel afeitada del ratón usando el lado pegajoso de la cinta quirúrgica y coloque el mouse en básculas de pesaje para registrar su peso prequirúrgico.
    4. Aplique cuidadosamente el lubricante para los ojos con un hisopo de algodón y transfiera el ratón y la boquilla al área quirúrgica.
      NOTA: Trate de limitar la cantidad de piel afeitada que también se transfiere al área quirúrgica. Use cinta quirúrgica para asegurar la cabeza a la boquilla para evitar que el ratón se deslice. Usando un hisopo de algodón separado, aplique etanol en la región afeitada para esterilizar y reducir la contaminación de la piel.
    5. Coloque el cuerpo de acuerdo con el músculo a inyectar. Por ejemplo, para el TA, coloque el mouse sobre su espalda y estire la extremidad posterior a ~ 10 ° desde la línea media. Alternativamente, para inyecciones de sóleo, coloque al animal de lado y extienda la extremidad posterior a ~ 45 ° desde la línea media. Cuando la extremidad posterior esté en la posición correcta, use cinta quirúrgica en todo el pie para evitar movimientos no deseados durante la cirugía.
      NOTA: Los procedimientos de inyección para los músculos TA, gastrocnemio y sóleo se han detallado previamente32.
    6. Antes de hacer una incisión, confirme que la anestesia es suficiente probando el reflejo de extracción del pedal. Controle la anestesia continuamente y manténgala durante todo el procedimiento quirúrgico con una evaluación regular de la respiración y el reflejo de abstinencia.
    7. En este punto, extraiga la solución HCT de trabajo en la jeringa hamiltoniana o en la micropipeta de vidrio tirada.
    8. Haga una pequeña incisión sobre el músculo o músculos de interés en el área (s) que corresponde (s) con las regiones de la placa terminalmotora 46,47,48. Perfore la fascia externa en el músculo e inyecte lentamente el HCT según 32. Deje la jeringa/micropipeta en su posición durante 5-10 s antes de retirarla lentamente.
    9. Cierre las incisiones con 1-2 suturas y transfiera el ratón a una jaula de recuperación aislada. Monitoree al ratón después de la cirugía durante un mínimo de 30 minutos, antes de devolverlo a la jaula doméstica. Cuando el ratón se haya recuperado con éxito y se complete el monitoreo postquirúrgico, devuelva la jaula a las condiciones normales de alojamiento.

3. Transporte axonal in vivo

  1. Exponer el nervio ciático
    1. Ajuste la cámara ambiental del microscopio a 37 °C al menos 1 h antes de la toma de imágenes.
    2. Prepárese para exponer el nervio ciático organizando la cortina quirúrgica, las herramientas, la cinta, los hisopos de algodón estériles, el etanol al 70% y la solución salina estéril alrededor del área quirúrgica. Asegúrese de que la máquina anestésica tenga suficientes reservas de oxígeno e isoflurano durante un máximo de 2 h por ratón. Cree una cuña de parapelícula o cinta invisible cortándola en un rectángulo estrecho (por ejemplo, ~ 1 cm de ancho para ratones más grandes) con una punta en ángulo y colóquela debajo del nervio ciático expuesto para ayudar al proceso de obtención de imágenes. Coloque la cámara de inducción encima de una alfombra térmica y configúrela a la temperatura corporal.
      NOTA: Cuatro horas es tiempo suficiente para que la HCT haya sido absorbida y transportada retrógradamente desde el sitio de la inyección hasta el nervio ciático; por lo tanto, un solo ratón puede ser preparado para la reanestesia después de este tiempo.
    3. Dirija el flujo de anestesia a la cámara de inducción, encienda la máquina anestésica con una tasa de flujo de oxígeno de 1-2 L / min y 3-4% de isoflurano, y coloque al ratón en la cámara de inducción para iniciar la anestesia.
      NOTA: Como el experimento de transporte axonal in vivo es un procedimiento terminal, no hay necesidad de lubricar los ojos.
    4. Cuando el reflejo de enderezamiento está ausente, reduzca la anestesia al 2-3% de isoflurano, dirija el flujo de anestesia a la boquilla y transfiera el ratón a la boquilla. Use cinta quirúrgica para asegurar la cabeza a la boquilla, extienda la extremidad posterior objetivo a ~ 45 ° desde la línea media y use cinta quirúrgica sobre el pie para mantener esta posición.
      NOTA: La anestesia reducida es ventajosa en este punto, ya que puede limitar el impacto de los artefactos respiratorios durante el proceso de obtención de imágenes.
    5. Asegúrese de que los reflejos de abstinencia corneal y de pedaleo estén ausentes, y luego use tijeras para cortar la piel que recubre el nervio ciático32 (es decir, un área grande que se extiende desde la médula espinal central hasta la extremidad posterior media-inferior). Retire el músculo bíceps femoral suprayacente, así como cualquier otra musculatura y tejido conectivo que esté cerca del nervio ciático. Evite dañar el nervio ciático y los vasos sanguíneos circundantes, especialmente aquellos ubicados cerca del aspecto lateral de la rótula / aspecto proximal de la cabeza gastrocnemio lateral.
    6. Cuando el nervio ciático intacto esté lo suficientemente expuesto, aplique solución salina estéril precalentada en el área alrededor del nervio ciático para evitar la desecación. Use fórceps curvos para interrumpir el tejido conectivo profundo y coloque la "cuña" de parapelícula preparada previamente debajo del nervio. Cuando esté completo, coloque algodón empapado en solución salina en el área expuesta y mueva el ratón a la cámara de inducción colocada en la parte superior de la alfombra de calor (establecida a 37 ° C), que aún debe llenarse con isoflurano en O2.
  2. In vivo imágenes axonales
    1. Coloque una cubierta de 22 x 64 mm en el escenario del microscopio personalizado y asegure su posición con cinta. Seleccione y aplique aceite de inmersión al objetivo y, a continuación, conecte la etapa del microscopio al microscopio invertido. Eleve lentamente el objetivo sumergido en aceite hasta que se haga contacto entre el aceite y el vidrio de cubierta.
      NOTA: Los objetivos de inmersión en aceite dic de 40x, 1.3 apertura numérica (NA) Plan-Apochromat o 63x, 1.4 NA DIC Plan-Apochromat se pueden utilizar para obtener imágenes del transporte in vivo en el nervio ciático.
    2. Mueva la boquilla anestésica a la etapa del microscopio y asegure las mangueras de anestesia con cinta adhesiva para evitar la alteración de la anestesia. Retire el algodón del nervio ciático y transfiera el ratón de la cámara de inducción a la boquilla, con el nervio expuesto mirando hacia la cubierta. Use cinta quirúrgica para asegurarse de que la cabeza del ratón esté fijada a la boquilla y mantenga el nivel más bajo y efectivo de anestesia. Levante suavemente el ratón por la cola y agregue solución salina estéril a la cubierta cerca del nervio ciático expuesto para restringir la desecación y ayudar a la obtención de imágenes.
      NOTA: Cierre todas las puertas de la cámara ambiental para asegurarse de que el área permanezca a temperatura corporal.
    3. Usando los oculares, localice el nervio ciático, determine el punto focal óptimo y seleccione un área de interés que contenga orgánulos axonales móviles.
      NOTA: Anteriormente se ha descrito una explicación detallada de este proceso32.
    4. Cambie al software de la computadora haciendo clic en el botón Adquisición (o equivalente) y seleccione un área de interés. Utilice un zoom digital para obtener un aumento total de >80x y gire el área seleccionada para visualizar horizontalmente los axones (por ejemplo, carga retrógrada móvil de derecha a izquierda y carga anterógrada en movimiento de izquierda a derecha).
      NOTA: Los parámetros de direccionalidad dependen del usuario, pero deben permanecer coherentes a lo largo de los experimentos.
    5. Optimice la intensidad de la señal ajustando parámetros como la intensidad del láser (0.2 - 1%), apertura estenopeica (1 AU - max), ganancia (Master) (700 - 1000), desplazamiento digital (-50 - 0) y ganancia digital (1.0 - 4.0). Para reducir la influencia potencial de la fototoxicidad, mantenga la intensidad del láser en ≤ 1% siempre que sea posible, con una intensidad máxima del láser del 2%. Cambie todos los demás parámetros antes de ajustar la intensidad del láser para una detección óptima de la señal.
    6. Haga clic en el cuadro Regiones (o equivalente), seleccione una región rectangular de interés y, a continuación, en el Modo de adquisición (o equivalente), establezca el tamaño del fotograma en un mínimo de 1024 x 1024 píxeles y comience la adquisición de lapso de tiempo de 100-1.000 fotogramas.
      NOTA: La velocidad de adquisición de fotogramas deseada depende del usuario (por ejemplo, el transporte se puede evaluar con velocidades de fotogramas entre 0,1 y 6 s) y se puede ajustar con parámetros de software, como la región de interés, el tiempo de velocidad de escaneo, el promedio de adquisición y la direccionalidad del láser. Por ejemplo, para obtener una velocidad de fotogramas más lenta, aumente la altura / anchura de la región de interés, adquiera velocidades de escaneo más lentas, aumente el promedio de adquisición y use la direccionalidad de un solo láser, y viceversa para una velocidad de fotogramas más rápida. La velocidad de adquisición de fotogramas debe seguir siendo consistente en conjuntos de datos comparables porque las imágenes a diferentes frecuencias pueden causar inconsistencias. Las cargas rápidas, como los endosomas de señalización, requieren una velocidad de fotogramas más rápida (por ejemplo, 0,1-3 s) en comparación con orgánulos más lentos como las mitocondrias, que se pueden analizar utilizando una velocidad más lenta (por ejemplo, 2,5-6 s).
    7. Trate de capturar un mínimo de 10 cargas móviles de un mínimo de tres axones por ratón.
      NOTA: Sobre la base de cálculos de potencia de dos muestras y dos caras (con una potencia estándar de 0,8 (1−β) y una tasa de error de tipo I del 5% (α)), los tamaños de muestra de 6-8 son suficientes para identificar las diferencias de transporte axonal entre los modelos de tipo salvaje y de enfermedad35,43.
    8. Una vez que se completen las imágenes, eutanasia al ratón inmediatamente mientras está bajo anestesia (por ejemplo, dislocación cervical). El tejido post mortem, como los músculos y los nervios ciáticos, también se puede cosechar para su posterior análisis.

Resultados

Este documento detalla un protocolo versátil que amplía el kit de herramientas de transporte axonal in vivo en modelos de roedores. La Figura 1 demuestra que los axones de las neuronas motoras se pueden diferenciar tanto de los axones de las neuronas sensoriales como de las células de Schwann mediante el uso de ratones transgénicos. La Figura 1A muestra la expresión de eGFP en axones motores colinérgicos de un ratón ChAT.eGFP vivo y anestesiado. La Figura 1B utiliza un método alternativo para lograr la expresión de tdTomato en un nervio recién extirpado (es decir, sin procesamiento de tejido adicional) de un ratón ChAT.tdTomato. Por lo tanto, el uso de cepas transgénicas como ChAT.eGFP, ChAT.tdTomato o Hb9.GFP permite el etiquetado específico del axón del motor in vivo.

Alternativamente, los axones también se pueden identificar inyectando trazadores/marcadores (por ejemplo, HCT31,32 o virus que codifican eGFP15) en los músculos esqueléticos. La Figura 2 destaca dicha aplicación, representando ocho axones positivos para ChAT.eGFP que expresan de manera robusta que contienen endosomas de señalización HCT-555 positivos (flechas blancas), ~ 4 h después de la inyección de la sonda en el músculo TA. Usando este diseño experimental, pudimos identificar las neuronas α motoras inervantes de TA, que son predominantemente fatigables rápidamente44. Otros cinco axones ChAT.eGFP con una expresión eGFP menos robusta (Figura 2A, asteriscos naranjas) estaban parcialmente desenfocados y era probable que se ubicaran un poco más profundo dentro del nervio ciático.

Además, identificamos endosomas de señalización HCT-555 positivos en axones sensoriales negativos para eGFP (flechas amarillas). Como tal, utilizando este paradigma experimental, se puede evaluar y comparar específicamente el transporte axonal de los endosomas de señalización en las neuronas motoras versus sensoriales in vivo. De hecho, utilizando esta cepa reportera transgénica, descubrimos que el transporte de endosomas de señalización en axones motores positivos para ChAT.eGFP es más rápido que en axones sensoriales negativos para ChAT.eGFP, que se pueden diferenciar de manera confiable utilizando anchos de axones43.

Hemos identificado previamente axones de neuronas motoras utilizando el ratón ChAT.eGFP in vivo43. Ahora informamos que HB9. Los ratones GFP también se pueden utilizar para lograr la identificación de axones de neuronas motoras in vivo. De hecho, la Figura 3 presenta una serie de imágenes de lapso de tiempo de HB9. Axones GFP que contienen endosomas de señalización HCT-555 positivos que se mueven retrógradamente. Tenga en cuenta que, a diferencia de la expresión impulsada por ChAT, GFP tiene un patrón más punteado /granular en HB9. Axones GFP; la razón de esto no está clara.

Anteriormente hemos descrito cómo monitorizar in vivo la dinámica mitocondrial en los nervios ciáticos mediante inyecciones intrasciaticas del colorante dirigido a las mitocondrias, tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE)32,36. Para diferenciar de manera confiable las mitocondrias motoras versus sensoriales, el ratón Mito.CFP, que expresa CFP bajo el promotor Thy1 18, se puede cruzar con ratones transgénicos que expresan un gen reportero fluorescente en tipos neuronales específicos. De hecho, al criar ratones Mito.CFP con ratones ChAT.tdTomato (conocidos como ChAT.tdTomato::Mito.CFP), pudimos visualizar mitocondrias específicamente en axones motores, como se muestra en la Figura 4. En este ejemplo multiplex vivo, se pudieron visualizar cinco axones ChAT.tdTomato, cuatro de los cuales contienen mitocondrias CFP positivas. Además, también se pudo identificar el nodo de Ranvier (flecha blanca en el panel iii). Además, los nodos de Ranvier son claramente detectables en ChAT.eGFP, HB9. Ratones GFP y Mito.CFP (no se muestran). Estas cepas de doble transgénico permiten imágenes intravitales de lapso de tiempo de ratones vivos anestesiados para monitorear el contenido mitocondrial específico de la neurona motora y la dinámica del transporte axonal.

Finalmente, los endosomas de señalización y las mitocondrias se pueden visualizar simultáneamente dentro de los mismos axones in vivo inyectando HCT en los músculos de ratones Mito.CFP (Figura 5). Las inyecciones intramusculares de HCT-555 se realizaron en el músculo TA en un ratón Mito.CFP ~ 4 h antes de la imagen. Tanto las mitocondrias (paneles i) como los endosomas de señalización (ii paneles) se visualizaron simultáneamente en axones específicos del músculo (es decir, axones que inervan la AT). De hecho, se pueden observar orgánulos en movimiento anterógrados (triángulos amarillos) y retrógrados (triángulos y círculos verdes), así como orgánulos estancados (triángulos y círculos naranjas). Usando este paradigma experimental, se pueden evaluar las complejas interacciones funcionales entre las mitocondrias axonales y los endosomas de señalización in vivo. En general, demostramos varios enfoques experimentales diferentes para evaluar el transporte axonal de endosomas de señalización y / o mitocondrias, específicamente en neuronas motoras colinérgicas in vivo.

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Figura 1: Axones motores del nervio ciático. (A) Imagen representativa de un solo plano de axones motores positivos para eGFP obtenidos in vivo de un ratón ChAT.eGFP. (B) Imagen representativa de un solo plano de axones motores tdTomato-positivos en un nervio ciático extirpado de un ratón ChAT.tdTomato. Las distinciones en el calibre del axón son el resultado de las diferencias en la edad y el tamaño del ratón. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: eGFP = proteína fluorescente verde mejorada; ChAT = colina acetiltransferasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Transporte axonal in vivo de endosomas de señalización en neuronas motoras y sensoriales del nervio ciático vivo de un ratón ChAT.eGFP. (A-C) Imágenes representativas de axones colinérgicos que expresan eGFP (A) y que contienen endosomas de señalización HCT-555 positivos (B), y la fusión (C). Las flechas blancas resaltan un axón motor positivo para eGFP que contiene endosomas de señalización HCT-555 positivos, las flechas cian identifican un axón motor que carece de endosomas de señalización positivos para HCT-555, y las flechas amarillas resaltan un axón sensorial negativo para eGFP que transporta endosomas de señalización positivos para HCT-555. Los asteriscos naranjas identifican los axones motores con una expresión eGFP más débil. Barra de escala = 25 μm. Abreviaturas: eGFP = proteína fluorescente verde mejorada; ChAT = colina acetiltransferasa; HCT-555 = dominio de unión a la toxina tetánica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Serie de imágenes de lapso de tiempo que representan el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización en neuronas motoras vivas de una HB9. Ratón GFP. (A-D) Imágenes de lapso de tiempo tomadas cada 3 s que representan axones de neuronas motoras que expresan proteína fluorescente verde (i) y que contienen endosomas de señalización HCT-555 positivos (ii) y la fusión (iii). Cada círculo del mismo color identifica el mismo endosoma en movimiento a través de diferentes marcos. El movimiento retrógrado es de derecha a izquierda. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; HCT-555 = dominio de unión a la toxina tetánica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Transporte axonal in vivo de mitocondrias en neuronas motoras nerviosas ciáticas vivas de un ChAT.tdTomato:: Mito.CFP: ratón. (A-C) Imágenes representativas de axones motores tdTomato-positivos (A), que contienen mitocondrias CFP-positivas (B), y la fusión (C). Las imágenes insertadas i-iii contienen un aumento mayor de cada panel. La flecha blanca representa un nodo sospechoso de Ranvier. Barras de escala = 25 (A-C) y 10 μm (i-iii). Abreviaturas: ChAT = colina acetiltransferasa; CFP = proteína fluorescente cian. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Serie de imágenes de lapso de tiempo que representan el transporte axonal concurrente in vivo de mitocondrias y los endosomas de señalización en neuronas motoras nerviosas ciáticas vivas de un ratón Mito.CFP. (A-C) Imágenes de lapso de tiempo tomadas cada 3 s que representan el transporte axonal de ambas mitocondrias (i) y los endosomas de señalización (ii) dentro del mismo axón del nervio ciático (iii). Los triángulos amarillos identifican cargas que se mueven anterógradamente, los círculos / triángulos verdes identifican cargas que se mueven retrógradamente y los círculos / triángulos naranjas identifican cargas estacionarias. El movimiento anterógrado es de izquierda a derecha, mientras que el movimiento retrógrado está en la dirección opuesta. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: HCT-555 = dominio de unión a la toxina tetánica; CFP = proteína fluorescente cian. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este protocolo detalla los pasos para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias en axones intactos del nervio ciático del ratón. De hecho, se proporciona una configuración experimental que permite a los usuarios 1) distinguir las neuronas motoras de las sensoriales in vivo, in situ y ex vivo mediante el uso de ratones que expresan proteínas fluorescentes mensajeras expresadas selectivamente en las neuronas motoras; 2) evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización específicamente en axones de neuronas motoras utilizando tres ratones transgénicos diferentes; 3) investigar el transporte axonal in vivo de mitocondrias específicamente en axones de neuronas motoras; y 4) evaluar simultáneamente la dinámica de transporte in vivo de los endosomas de señalización y las mitocondrias dentro del mismo axón. Este enfoque tiene un gran potencial para investigar el transporte axonal en condiciones basales y se puede utilizar para evaluar perturbaciones patológicas en diferentes enfermedades que afectan a los nervios motores y sensoriales periféricos.

Utilizando paradigmas experimentales anteriores como base31,32, aquí tenemos formas novedosas y robustas de diferenciar el transporte axonal que ocurre en neuronas motoras versus sensoriales utilizando ratones reporteros transgénicos. Utilizando el ratón Mito.CFP, este enfoque se ha desarrollado aún más para evaluar el transporte mitocondrial in vivo evitando las inyecciones de nervios intrasociales de TMRE36. Esto evita posibles daños neuronales y perturbaciones en el transporte axonal causadas por la inyección intranerve de la sonda. Además, este protocolo permite la visualización del transporte axonal de múltiples orgánulos en axones motores que inervan los músculos con distintas propiedades fisiológicas (por ejemplo, músculos fatigables de contracción rápida frente a músculos resistentes a la fatiga de contracción lenta). Como tal, la dinámica de transporte axonal de endosomas y/o mitocondrial de señalización se puede evaluar en diferentes subconjuntos de neuronas α motoras44. Además, el transporte axonal de esos orgánulos en entornos patológicos también puede evaluarse mediante cruzamiento con modelos de ratón de diferentes enfermedades neurodegenerativas 1,2,3.

El kit de herramientas de transporte axonal se está expandiendo continuamente28,29, y se han desarrollado protocolos ex vivo para evaluar la dinámica de transporte utilizando explantes de cuerno ventral de ratón cultivados49 o preparaciones de músculo nervioso de ratón extirpadas50. Además, el desarrollo de protocolos para evaluar el transporte axonal en neuronas51 corticales derivadas de células madre pluripotentes humanas inducidas (hiPSC) o neuronas motoras espinales derivadas de hiPSC52 ha permitido la investigación de neuronas humanas con mutaciones causantes de enfermedades. Tales protocolos de vanguardia en tejido de ratón y células humanas pueden proporcionar información crítica sobre la función neuronal, facilitar el descubrimiento de nuevas enfermedades pathomecanicistas en modelos de enfermedades neurodegenerativas y usarse para probar moléculas y estrategias terapéuticas.

Es necesario seguir varios pasos críticos para la implementación exitosa de estas técnicas, y se han proporcionado algunas notas importantes en la sección de protocolo. Los principales requisitos para las imágenes intravitales son el microscopio confocal invertido con inserto de etapa personalizado y el equipo para mantener la anestesia y la temperatura óptima. De hecho, se necesita un sistema anestésico móvil especializado para 1) la inducción de la anestesia, 2) la disección / procesamiento de tejidos (es decir, la exposición del nervio ciático) y 3) el mantenimiento de la anestesia durante las imágenes intravitales (como se detalló anteriormente en 31,32). Especialmente cuando se utilizan objetivos de aumento más altos (por ejemplo, 40x o 63x), la profundidad de la anestesia puede afectar la calidad de la imagen, ya que la anestesia más profunda induce grandes respiraciones "gaseosas" que resultan en cambios frecuentes en el enfoque. Sin duda, estos grandes movimientos tendrán un impacto en los análisis posteriores al transporte de imágenes (por ejemplo, el seguimiento de cargas utilizando los complementos de Fiji TrackMate53 o KymoAnalyzer54), ya que los movimientos respiratorios producen artefactos en videos de lapso de tiempo que pueden hacerlos inadecuados para el seguimiento automatizado o requerir una evaluación que consuma más tiempo. Además, también hemos observado artefactos de imágenes causados por arterias pulsantes dentro del nervio ciático, que solo se pueden resolver eligiendo una región de imagen diferente. El microscopio debe estar equipado con una cámara ambiental capaz de mantener una temperatura corporal constante, ya que la temperatura y el pH influyen en el transporte axonal55. Además, se debe evitar la aplicación de analgésicos postoperatorios, ya que pueden alterar la dinámica de transporte56. Si el diseño experimental es longitudinal y requiere imágenes repetidas (por ejemplo,57), los protocolos de disección deben ajustarse adecuadamente para ser mínimamente invasivos y pueden requerir una aprobación ética / licencia adicional.

Es necesario tener en cuenta ciertas consideraciones experimentales . En primer lugar, la mayoría de los protocolos detallados en este documento implican el uso de ratones transgénicos que poseen proteínas reporteras fluorescentes en mitocondrias o axones de neuronas motoras. Cada una de estas líneas de ratón debe ser criada e imaginada como hemi-/heterocigoto. Las excepciones, sin embargo, son las líneas de ratón ChAT.Cre y Rosa26.tdTomato que se pueden mantener por separado como homocigotos, con la descendencia de hemicigoto resultante que permite la expresión de tdTomato en neuronas colinérgicas después de la recombinación de Cre-loxP . Cuando se cruzan ratones hemic-/heterocigotos transgénicos (por ejemplo, Mito.CFP) con otros ratones hemi-/heterocigotos transgénicos (por ejemplo, ChAT.eGFP), es necesario considerar cuidadosamente la estrategia de reproducción, ya que obtener el número deseado de progenie doble mutante puede llevar mucho tiempo. Además, al criar la generación F1 de ratones ChAT.Cre y Rosa26.tdTomato (es decir, ChAT.tdTomato) con cepas transgénicas adicionales (por ejemplo, Mito.CFP), se debe esperar aún menos ratones que porten los transgenes triples deseados. Además, también se debe considerar la superposición potencial de fluoróforos cuando se crían ratones de dos reporteros con propiedades de longitud de onda cercanas (por ejemplo, Mito-CFP-excitación: 435 nm, emisión: 485 nm, criados con ChAT.eGFP-excitación: 488 nm, emisión: 510 nm), aunque puede ser posible superar este problema con la desmezcla espectral58.

Esta técnica tiene algunas limitaciones a considerar. En este trabajo y en nuestros protocolos anteriores31,32, hemos demostrado cómo se pueden utilizar varios marcadores codificados genéticamente y diferentes métodos de tinción para etiquetar y rastrear distintos orgánulos in vivo. Sin embargo, no todas las sondas son adecuadas para este enfoque experimental. Evaluamos las inyecciones en ta o músculo sóleo de la subunidad beta de la toxina del cólera (CTB)-488 (0,5-1,5 μg/μL ~4 h antes de la obtención de imágenes), una sonda utilizada rutinariamente para etiquetar cuerpos celulares de neuronas motoras en experimentos in vivo de trazadores retrógrados 59,60. Sin embargo, cuando se inyectó solo o se inyectó conjuntamente con HCT-555, el etiquetado CTB-488 fue deficiente a pesar de usar concentraciones similares a las utilizadas para el rastreo exitoso de la neurona motora retrógrada. Por lo tanto, concluimos que, a pesar de que CTB es un excelente marcador in vitro de endosomas de señalización en cultivos neuronales61, HCT sigue siendo la sonda estándar de oro para identificar endosomas de señalización in vivo en axones de nervios ciáticos.

Utilizando diferentes rutas, también probamos sondas utilizadas rutinariamente para etiquetar lisosomas, como LysoTracker verde DND-26, y marcadores de hidrolasas lisosomales activas, como BODIPY-FL-pepstatina A para Catepsina D62 y Magic Red para Catepsina B, pero sin éxito. Probamos la administración intramuscular de BODIPY-FL-pepstatina A (2,5 μg en la TA ~ 4 h antes de la imagen), así como la inyección del nervio intraciático de 2 μL de LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatina A (10 μM) o Magic Red (1/10) 30-60 min antes de la imagen. A pesar de que estas sondas resaltan el nervio, no pudimos encontrar orgánulos claramente marcados. Las sondas se acumularon alrededor de los axones, probablemente retenidas por las células de Schwann. Por lo tanto, el etiquetado fallido de los lisosomas puede deberse a una entrega deficiente de la sonda en las neuronas, aunque no se puede descartar la existencia de concentraciones más adecuadas. Dado que el etiquetado TMRE funciona en condiciones similares (es decir, inyecciones de nervios intrasciáticos), la intensidad del etiquetado puede depender del colorante y debe probarse para cada marcador de forma independiente. Sin embargo, concluimos que apuntar a los lisosomas in vivo con estas sondas no es factible en las concentraciones indicadas anteriormente.

Los métodos de anestesia pueden alterar distintas lecturas fisiológicas (por ejemplo, función de la cóclea63 y electrofisiología cortical64); sin embargo, actualmente se desconoce si la anestesia influye en el transporte axonal in vivo en el nervio ciático. Dada la actividad neuromuscular reducida bajo anestesia inducida por isoflurano, es posible que la cinética del transporte difiera en comparación con el estado de vigilia. Sin embargo, el único estudio in vivo que ha investigado directamente esto reveló que el transporte de vesículas de núcleo denso en proyecciones talamocorticales no difiere entre ratones anestesiados y despiertos65. Además, debido a que las distinciones en el transporte entre ratones de tipo salvaje y modelo de enfermedad son detectables bajo anestesia35,43, está claro que la exposición al isoflurano no impide la identificación de perturbaciones en la señalización del endosoma o el tráfico mitocondrial.

Este protocolo tiene otras aplicaciones potenciales, que se han descrito a continuación. La cría de los ratones transgénicos descritos en este protocolo (por ejemplo, Mito.CFP, ChAT.eGFP) con modelosde ratón de enfermedad neurodegenerativa 1,2,3 permitirá investigaciones específicas de subtipos y/o cargas neuronales. Además, las líneas Cre66 de ratón recientemente desarrolladas también permitirían la visualización de proteínas reporteras fluorescentes en distintas poblaciones de axones sensoriales. Por ejemplo, los ratones Rosa26.tdTomato se pueden cruzar con un neuropéptido que expresa el receptor Y-2 (Npy2r). Cre mouse para permitir la fluorescencia de tdTomato en nociceptores mielinizados de fibra A67. Además, el control temporal también se puede lograr mediante el uso de sistemas Cre inducibles (por ejemplo, tamoxifeno)68. Otra aplicación potencial se basa en la disponibilidad de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en las células de Schwann. De hecho, los ratones S100-GFP69 y PLP-GFP70 permiten obtener imágenes in vivo y / o in situ de las células de Schwann y han estado a la vanguardia de la investigación involucrada en la migración de células de Schwann durante la regeneración nerviosa periférica.

Además de estas aplicaciones y complementando al ratón Mito.CFP está la disponibilidad de varias líneas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en distintos orgánulos, como mitocondrias y autofagosomas. Por ejemplo, la investigación del transporte mitocondrial in vivo podría ser posible con el ratón mito::mKate271 o el ratón mitoDendra fotoconvertible57. Además, el transporte de mitofagosomas in vivo puede ser posible utilizando el ratón mito-Keima sensible al pH72 y el ratón mito-QC73 para análisis de mitofagia. Además, las dificultades de marcado lisosomal que encontramos pueden superarse mediante el uso de ratones que expresan LAMP1-GFP, con la advertencia de que LAMP1 también está presente en orgánulos endocíticos distintos de los lisosomas74.

En resumen, hemos proporcionado nuevas formas de evaluar el transporte axonal in vivo de varios orgánulos en axones nerviosos periféricos específicos de diversos ratones transgénicos. La imagen concurrente de diferentes orgánulos será particularmente importante, dados los recientes hallazgos de interacciones axonales y corretaje de orgánulos como mitocondrias y endosomas75,76. Creemos que los métodos presentados serán útiles para mejorar la comprensión de la fisiología basal de los axones in vivo y desenredar importantes mecanismos pathomecanismos que impulsan la neurodegeneración de los nervios periféricos.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por compartir los ratones ChAT-eGFP, ChAT.Cre y Rosa26.tdTomato, y a Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por compartir el HB9. Ratón GFP. Nos gustaría agradecer a Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers y Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca junior no clínica de la Asociación de Enfermedades de la Neurona Motora (Reino Unido) (Tosolini / Oct20 / 973-799) (APT), los Premios wellcome Trust senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z y 223022 / Z / 21 / Z) (GS), un premio de la Fundación del Instituto de Investigación de demencia del Reino Unido (GS); y un Premio al Desarrollo Profesional del Consejo de Investigación Médica (MR/S006990/1) (JNS).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PCR de 0,2 mL
70% (v/v) de etanol en agua
AlexaFlour555 C2 maleimidaThermoFisher ScientificA-20346También puede utilizar AlexaFlour-488 o -647 Maleimide
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomate)Hze/JLaboratorio Jackson7909Rosa26.tdRatones
tomate B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J ratonesLaboratorio Jackson5029HB9. Ratones GFP
B6. Ratones Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/JLaboratorio Jackson7967Mito.CFP ratones
B6; 129S6-Chattm2(cre)Ratones Lowl/JLaboratorio Jackson6410ratones ChAT.Cre
Ordenador con software de control de microscopio y adquisición de imágenesZeissZen
Hisopo
Centrífuga
Microscopio
Ojo
Pinza curva finaDumont
Pinza recta finaDumont
(22 x 64 mm, espesor n.º 1)
Micropipeta de vidrio graduada con marcas de microlitros y émboloDrummond Scientific5-000-1001-X10
Cortapelos
Jeringa de microlitro Hamilton (701 N, volumen 10 μ L, tamaño de la aguja 26 s G, punta biselada, aguja L 51 mm)Merck20779
HcT-441N/AN/AConsulte Restani et al., 2012 para obtener más detalles
Almohadilla
inmersión para imágenes fluorescentes a 37 & grados; C
Microscopio confocal invertido con cámara ambientalZeissLSM 780La mayoría de los confocales invertidos deben ser adaptables
Isoflurano
Vaporizador/máquina de anestesia de isoflurano con cámara de inducción y estabilizador de
CintaCinta invisible Extractor
de micropipetas
ParafilmParafilm
Solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 1,8 mM KH2PO4– HCl, pH 7.4
Factor neurotrófico recombinante derivado del cerebro humano (BDNF)Peprotech450-02BDNF que se puede coinyectar con HcT-555 Hoja de
bisturí
Tijeras de resorte pequeñoDumont
Microscopio
Paño
Sutura
Cinta
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd ratonesMMRRC000296-UCDChAT.eGFP
Mezclador de vórtice
Tubo de destiladade algodónde sobremesade disecciónlubricante Cubreobjetos de vidrio Dumont térmica Aceite de máscara mágica de solución salina Dumont de cirugía/operaciónquirúrgicoquirúrgicaquirúrgica

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