Artículo de método
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El protocolo presenta los procedimientos generales en el laboratorio requeridos en las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores. Aquí presentamos los pasos detallados de la amplificación del genoma completo, la selección de fragmentos de ADN, la construcción de bibliotecas, la preparación de plantillas y el flujo de trabajo de secuenciación con resultados representativos.
La secuenciación de próxima generación ha ganado cada vez más importancia en la aplicación clínica en la determinación de variantes genéticas. En la prueba genética preimplantacional, esta técnica tiene sus ventajas únicas en escalabilidad, rendimiento y costo. Para la prueba genética preimplantacional para el análisis de aneuploidías, el sistema de secuenciación de próxima generación (NGS) basado en semiconductores presentado aquí proporciona un enfoque integral para determinar variantes genéticas estructurales a una resolución mínima de 8 Mb. Desde la adquisición de la muestra hasta el informe final, el proceso de trabajo requiere múltiples pasos con un estricto cumplimiento de los protocolos. Dado que varios pasos críticos podrían determinar el resultado de la amplificación, la calidad de la biblioteca, la cobertura de las lecturas y la salida de datos, la información descriptiva con demostración visual distinta de las palabras podría ofrecer más detalles a la operación y manipulación, lo que puede tener un gran impacto en los resultados de todos los pasos críticos. Los métodos presentados en este documento mostrarán los procedimientos involucrados en la amplificación del genoma completo (WGA) de las células de trofoectodermo (TE) biopsiadas, la construcción de bibliotecas genómicas, la gestión del secuenciador y, finalmente, la generación de informes de variantes de número de copias.
La aneuploidía es la anomalía en el número de cromosomas por la presencia de uno o más cromosomas adicionales o la ausencia de uno o más cromosomas. Los embriones que portan algún tipo de aneuploidía, como la pérdida de un cromosoma X (síndrome de Turner), copias adicionales de autosomas, como trisomías del autosoma 21 (síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) y 18 (síndrome de Edwards), o cromosomas sexuales adicionales como 47, XXY (síndrome de Klinefelter) y 47, XXX (síndrome de Triple X), pueden sobrevivir a término con defectos de nacimiento1. La aneuploidía es la causa principal de abortos espontáneos en el primer trimestre y fracaso de ....
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Todos los protocolos y la biopsia del trofoectodermo (TE) (sección 1.1.1.1) aplicados en este estudio fueron revisados y aprobados por el comité de ética de investigación humana del hospital No. 924 el 18 de septiembre de 2017 (NO: PLA924-2017-59). Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.
1. Aislamiento de ADN a partir de biopsia de embrión humano y amplificación genómica completa
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A medida que el plan de secuencias finaliza después del proceso de ejecución en la máquina, el sistema del servidor de secuencias informa del resumen con información descriptiva de los datos generados, el estado del chip, la velocidad de carga del ISP y la calidad de la biblioteca, como se muestra en la Figura 2. En esta demostración de resultados, se obtuvieron datos de 17.6 G en la base total, y la tasa de carga general de ISP fue del 88% en los pocillos totales del chip; el mapa de calor .......
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La aneuploidía cromosómica de los embriones es la causa de una gran proporción de la pérdida del embarazo, ya sea concebido de forma natural o de la fecundación in vitro (FIV). En la práctica clínica de la FIV, se propone que el cribado de la aneuploidía embrionaria y la transferencia del embrión euploide podrían mejorar el resultado de la FIV. La hibridación fluorescente in situ es la técnica más temprana adoptada para la selección del sexo y PGT-A; Sin embargo, esta técnica requiere más experiencia té.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Nos gustaría agradecer al Dr. Zhangyong Ming y al Sr. Rongji Hou por su asesoramiento sobre la aplicación ampliada de LIMS. Este estudio cuenta con el apoyo de los Proyectos Especiales de Investigación del PLA para la Planificación Familiar (17JS008, 20JSZ08), el Fondo del Laboratorio Clave de Investigación de Enfermedades Metabólicas de Guangxi (No.20-065-76) y el Proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología de Salud Ciudadana de Guangzhou (201803010034).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Unidad de filtro de jeringa | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1,5 mL Tubos LoBind de ADN | Eppendorf | 30108051 | |
| tubos de 15 mL | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2,0 mLDNA Tubos LoBind | Eppendorf | 30108078 | |
| tubos de 50 mL | Greiner Bio-One | ||
| 5x Tampón Anstart Taq (Mg2+ Plus) | FAPON& | ||
| nbsp; Reactivo de ADN polimerasa | FAPON | ||
| AMPure XP de Anstart Tap (perlas magnéticas para la unión de ADN) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| tampón de lisis celular | Medical University | Tampón de lisis celular que contiene 40 mM de Tris (pH 8), 100 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 1 mM de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM de sodio pirofosfato, 2 mM β-glicerofosfato, 0,1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| tampón de elución de ADN | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Alcohol etílico | Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou Thermo Fisher Científico | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Reactivos de amplificación del genoma completo desarrollados de forma independiente | Universidad | Los reactivos constan de los siguientes componentes: 1. Lisis Celular 2. Amplificación Solución premezclada 1) Imprimación WGA-P2 (10 μ M) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Tampón Anstart Taq (Mg2+ Plus) 3. Enzima de amplificación 1) Anstart Tap ADN Polimerasa (5 U/μ L) | |
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mencionado en el paso 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Sistema de iones y protones | Life Technologies | 4476610 | |
| Servidor reportero de iones Tecnologías | de vida del | 4487118 | |
| isopropanol | reactivos químicos de Guangzhou | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Kit de preparación de bibliotecas | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Tecnologías de vida de agua sin nucleasas | AM9932 | ||
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3'OneTouch | |
| 2 Tecnologías | vida del | 4474779 | Sistema de amplificación y enriquecimiento de plantillas Tubos |
| de PCR | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Puntas de pipeta | Productos científicos | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Mini centrífuga portátil LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorímetro | Life Technologies | Q33216 | Fluorímetro |
| Tubos de ensayo Qubit Life | Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Kit de ensayo | Life Technologies | Q32851 | |
| Sistema de servidor secuenciador | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Secuenciación Reacciones Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html Este kit contiene los siguientes componentes: 1. Kit de preparación de plantillas Set 1.1 Kit de preparación de plantillas: Emulsión Tampón PCR Emulsión PCR mezcla de enzimas Solución portadora de plantilla 1.2 Soluciones de preparación de plantillas: Preparación de plantillas Aceite de reacción I solución de rotura de emulsionante II Aceite de reacción para preparación de plantillas II Agua sin nucleasas Tween solución Solución de desemulsificación I Solución de lavado de plantillas C1 solución de lavado de perlas C1 solución de resuspensión de perlas Solución de resuspensión de plantillas 1.3 Materiales de preparación de plantillas: Tubo de reactivo I conector Tubo de recolección Pipeta de tubo de reactivo I Placa de amplificación 8 pocillos strip Consejos dedicados Preparación de plantillas adaptador de lavado Filtro de preparación de plantillas 2. Conjunto de kits de secuenciación 2.1 Kit de secuenciación: dGTP dCTP dATP dTTP Solución de enzimas de secuenciación Imprimaciones de secuenciación Plantillas de control de calidad 2.2 Soluciones de secuenciación: Solución de secuenciación II Solución de secuenciación IIII Tampón de recocido Tampón de carga Agente espumante Tabletas de cloro C1 bead 2.3 Materiales de secuenciación: Tubo de reactivo II Tapa del tubo de reactivo Sorbedor de tubo de reactivo II Sorbedor de botellas de reactivos Frascos de reactivos 3. |
| Chip Solución de hidróxido de sodio | Sigma | 72068-100ML | |
| Termociclador | Life Technologies | 4375786 |
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