Un modelo de roedor inducido por TNBS para estudiar el papel patogénico del estrés mecánico en la enfermedad de Crohn

Resumen

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo de colitis similar a la enfermedad de Crohn en roedores. La inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS, y se observa agrandamiento mecánico en el segmento proximal a la estenosis. Estos cambios permiten estudiar el estrés mecánico en la colitis.

Resumen

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la enfermedad de Crohn (EC) son trastornos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal que afectan aproximadamente a 20 por cada 1,00,000 en Europa y Estados Unidos. La EC se caracteriza por inflamación transmural, fibrosis intestinal y estenosis luminal. Aunque las terapias antiinflamatorias pueden ayudar a controlar la inflamación, no tienen eficacia en la fibrosis y la estenosis en la EC. La patogénesis de la EC no se entiende bien. Los estudios actuales se centran principalmente en delinear los mecanismos desregulados de la respuesta inmune intestinal. Si bien la inflamación transmural asociada a la EC, la fibrosis intestinal y la estenosis luminal representan estrés mecánico en la pared intestinal, el papel del estrés mecánico en la EC no está bien definido. Para determinar si el estrés mecánico desempeña un papel patógeno independiente en la EC, se ha desarrollado un protocolo de modelo de colitis similar a la EC inducido por TNBS en roedores. Este modelo de inflamación transmural y fibrosis inducida por TNBS se asemeja a las características patológicas de la EC en el colon. Es inducida por la instilación intracolonica de TNBS en el colon distal de ratas Sprague-Dawley adultas. En este modelo, la inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS (Sitio I). La distensión mecánica se observa en la porción proximal al sitio de instilación (Sitio P), lo que representa estrés mecánico pero no inflamación visible. La porción colónica distal a la inflamación (Sitio D) no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios distintivos de la expresión génica, la respuesta inmune, la fibrosis y el crecimiento del músculo liso en diferentes sitios (P, I y D), destacando un profundo impacto del estrés mecánico. Por lo tanto, este modelo de colitis similar a la EC nos ayudará a comprender mejor los mecanismos patógenos de la EC, particularmente el papel del estrés mecánico y la expresión génica inducida por el estrés mecánico en la desregulación inmune, la fibrosis intestinal y la remodelación de tejidos en la EC.

Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incluida la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), se caracteriza por una inflamación crónica en el tracto gastrointestinal (GI). Afecta a ~1-2 millones de estadounidenses¹. Los costos anuales estimados para la atención de la EII en los Estados Unidos son de $ 11.8 mil millones. A diferencia de la CU, la EC se caracteriza por inflamación transmural y formación de^{estenosis 2,3}. La formación de estenosis (estenosis) ocurre en hasta el 70% de los pacientes con EC³ y puede ser causada por inflamación transmural (estenosis inflamatoria) o fibrosis intestinal (estenosis fibrótica)^4,5. La fibrosis intestinal se caracteriza por una deposición excesiva de colágeno y otras matrices extracelulares (ECM) con células del músculo liso (SMC) como uno de los principales tipos de células mesenquimales implicadas en el proceso ^3,4. La hiperplasia del músculo liso asociada con hipertrofia es otro cambio histológico significativo en la estenosis fibrótica en la^{EC 6}. Aunque la formación de estenosis en la EC se asocia con inflamación crónica, ningún tratamiento antiinflamatorio es efectivo, excepto el tratamiento quirúrgico ^2,6. Sin embargo, las recurrencias postquirúrgicas son casi del 100%, dado el tiempo suficiente ^2,7. Como respuesta inflamatoria, la fibrosis y la hiperplasia SMC también pueden desarrollarse en condiciones no inflamatorias (es decir, obstrucción intestinal) en el intestino ^8,9; se cree que tanto los mecanismos dependientes de la inflamación como los independientes están involucrados en la formación de^{estenosis 3,4}. Dado que la extensa investigación sobre los mecanismos dependientes de la inflamación no se ha traducido en ninguna terapia efectiva para la formación de estenosis, se necesitan estudios sobre el posible papel de los mecanismos independientes de la inflamación en la fibrosis intestinal.

Como factor no inflamatorio, el estrés mecánico (EM) asociado con edema, infiltración de células inflamatorias, deformación tisular, fibrosis y estenosis 10,11,12,13 se encuentra comúnmente en la EII, especialmente la EC, que se caracteriza por inflamación transmural. El estrés mecánico es más notable en la EC estenótica, donde la estenosis (inflamatoria o fibrótica) en el sitio de inflamación presenta estrés mecánico en el tejido local y conduce a la distensión de la luz en el segmento proximal al sitio de obstrucción^10,14. Estudios previos in vitro han demostrado que el estrés mecánico altera la expresión génica de mediadores inflamatorios específicos (es decir, COX-2, IL-6)^8,14,15 y factores de crecimiento (es decir, TGF-β) en los tejidos gastrointestinales, especialmente las células del músculo liso intestinal (SMC)¹⁶. Estudios recientes también encontraron que la expresión de mediadores profibróticos específicos como el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) es altamente sensible al estrés mecánico^17,18. Se planteó la hipótesis de que el estrés mecánico podría desempeñar un papel patógeno independiente en la inflamación asociada a la EC, la fibrosis y la remodelación de los tejidos. Sin embargo, la importancia patogénica del estrés mecánico en la inflamación intestinal, la fibrosis y la hiperplasia del músculo liso en la EC permanece en gran medida inexplorada. Esto puede deberse en parte a que la inflamación es un proceso más visible y mejor estudiado que el estrés mecánico. Más importante aún, no ha habido un modelo animal bien definido de EII para distinguir el efecto del estrés mecánico del de la inflamación.

El presente trabajo describe un modelo de roedor de colitis similar a la enfermedad de Crohn inducida por inyección intracolínica del reactivo de hapteno ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS)^19,20, que puede servir para estudiar el papel del estrés mecánico en la EC. Se encontró que la instilación de TNBS indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con estrechamiento de la luz (estenosis) en el colon distal. La estenosis conduce a una marcada distensión intestinal (estrés mecánico)^14,15 pero no a una inflamación visible en el segmento colónico proximal al sitio de instilación. Por el contrario, el segmento del colon distal al sitio de estenosis no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios significativos específicos del sitio en la expresión génica, la inflamación, la fibrosis y la hiperplasia SMC en los tres sitios diferentes. Los resultados sugieren que el estrés mecánico, particularmente la expresión génica inducida por el estrés mecánico, puede desempeñar un papel crítico en el desarrollo de fibrosis e hiperplasia en la colitis de Crohn.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas (#0907051C). Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho o hembra, de ~ 8-9 semanas de edad, para el estudio.

1. Preparación animal

1. Ayuna a las ratas durante 24 horas y trátalas con laxante (limpiador intestinal, ver Tabla de materiales) durante la noche.
2. Al día siguiente, anestesiar a las ratas utilizando un sistema de anestesia (ver Tabla de Materiales) exponiéndolas a isoflurano al 2% junto con 1 L/min de oxígeno durante la administración de TNBS. Verifique si hay reflejos o pellizcos de los dedos de los pies para confirmar la anestesia.
3. Prepare una solución fresca de TNBS de acuerdo con el peso corporal.
   NOTA: TNBS - se utilizaron 65 mg/kg de peso corporal en 250 μL de etanol al 40%.
4. Coloque a las ratas en posición supina sobre la mesa de anestesia. Para inducir la colitis, inserte a través del ano un catéter de poliuretano abierto de grado médico durante ~ 7-8 cm desde el borde anal e insértele suavemente TNBS (preparado en el paso 1.3) en el colon¹⁹. Administrar las ratas de control simuladas con 250 μL de solución salina solamente.
5. Después de instilar TNBS o solución salina, mantenga a las ratas en posición supina y ligeramente boca abajo (~ 30 °), con el ano cerrado durante 2 minutos para ayudar a la distribución de TNBS y evitar derrames.
6. Proporcione a las ratas alimentos y agua ad libitum durante 7 días y observe a las ratas diariamente para determinar el peso corporal, la absorción de alimentos, las heces y el estado general de salud.

2. Preparaciones de tejidos

1. El día de la eutanasia, sacrificar a las ratas_usando la inhalación de CO 2 y confirmar la eutanasia con luxación cervical.
2. Abra el abdomen de la rata con tijeras y fórceps de grado quirúrgico.
3. Retire cuidadosamente todo el colon (por encima del canal anal) y transfiera el colon inmediatamente al tampón 1x HBSS helado.
4. Enderece el colon en el búfer y mide la longitud del colon usando una regla. Tome hilo de nylon y rodee el colon para medir la circunferencia externa de los segmentos de colon en control y las ratas tratadas con TNBS. Tome tejidos de espesor completo para histología.
5. Abra el colon a lo largo de la tabla mesentérica y limpie bien el colon con el tampón HBSS. Evaluar el colon para la puntuación de inflamación macroscópica en función de los criterios descritos anteriormente¹⁹ con modificaciones mínimas.
   NOTA: 0 = mucosa normal; 1 = hiperemia localizada pero sin erosiones ni úlceras; 2 = úlcera y estenosis (área afectada < 5 mm); 3 = úlcera grave, cicatriz y estenosis (área afectada > 5 mm).
6. Recolectar muestras de tejido colónico del sitio P (porción 2-3 cm antes del margen oral del sitio de inflamación), el sitio I (sitio de inflamación, típicamente a 4-6 cm del final del colon, donde se inculca TNBS) y el sitio D (porción 1-2 cm distal al margen aboral del sitio de inflamación), respectivamente de ratas tratadas con TNBS.
   NOTA: Se tomó tejido del colon de ~ 1-2 cm de largo de cada segmento. Además, los tejidos del colon de 2 cm de largo (~ 4-6 cm desde el extremo del colon) de las ratas tratadas con solución salina se tomaron como control simulado (S) (Figura 1).
7. Tomar muestras de tejido de cada sitio para la preparación de espesor completo, y si se desea, capas de mucosa/submucosa y muscularis externa, respectivamente, así como^21,22.
8. Primero congele muestras de tejido en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a -80 °C para almacenarlas hasta un año y para fines futuros (es decir, preparaciones de ARN).

3. Evaluación histopatológica de la inflamación intestinal y la fibrosis

1. Fije los tejidos del colon de espesor completo en formalina al 10% durante 48 h, luego transfiera a etanol al 70% durante 24-48 h.
2. Utilice un microtomo para cortar secciones de parafina de 5 μm de espesor para hematoxilina y eosina (H&E) y tinciones tricrómicas de Masson ^6,19,23 (ver Tabla de materiales), respectivamente.
3. Adquiera y vea imágenes con un microscopio vertical equipado con una cámara de alta resolución con software compatible (consulte la Tabla de materiales).
4. Índices de inflamación y fibrosis de grado por dos investigadores independientes, entre ellos un patólogo quirúrgico gastrointestinal según criterios descritos anteriormente ^6,23 con modificaciones. Consulte el Archivo Suplementario 1 para conocer las puntuaciones.
5. Mida el grosor y el número de células de las capas musculares circulares y longitudinales por sección transversal en cuatro vistas de cada espécimen teñido de H&E y tome la media de las cuatro mediciones para cada espécimen.

4. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa

1. Homogeneizar los tejidos de colon extirpados obtenidos del control simulado y de tres sitios (P, I, D) de ratas con colitis TNBS en el reactivo de extracción de un kit de extracción de ARN (ver Tabla de Materiales).
2. Aísle el ARN de cada muestra utilizando el kit. Eluya el gránulo de ARN en 30 μL de agua libre de RNasa.
3. Cuantificar la concentración de ARN y comprobar la pureza utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen (ver Tabla de Materiales).
4. Utilice 1 μg de ARN total para sintetizar ADNc^21,22 utilizando el kit de síntesis de ARN (ver Tabla de Materiales).
5. Analizar y cuantificar los niveles de expresión génica mediante la realización de PCR en tiempo real con 50 ng de ADNc como plantilla, sondas de IL-6 y CTGF utilizando un kit de PCR comercial para el sistema de PCR en tiempo real (ver Tabla de Materiales).
6. Utilizar el rRNA del gen de control 18S para normalizar las muestras y cuantificar la expresión génica relativa utilizando los valores de Cq obtenidos.

5. Análisis estadístico

1. Utilice software de análisis estadístico (ver Tabla de Materiales) para comparar el control simulado y las ratas con colitis TNBS.
2. Considere que el valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo^15,19.
3. Para probar las diferencias entre dos grupos, utilice el análisis de la prueba t de Student y realice una prueba ANOVA si las comparaciones son más de dos grupos^15,19.

Resultados

Visión macroscópica de la colitis similar a la de Crohn inducida por la instilación intracolónica de TNBS
Como se muestra en la Figura 1, la instilación intracolónica de TNBS en ratas indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con pared intestinal engrosada y lumen estrechado (estenosis) en el sitio de instilación en el colon distal (Figura 1A). El sitio de instilación de TNBS se conoce como sitio I. Como resultado de l...

Discusión

La colitis inducida por TNBS se introdujo en 1989 y se ha utilizado como modelo experimental de la enfermedad de Crohn desde entonces 19,20,23. Las características significativas de este modelo en roedores incluyen el desarrollo de una inflamación transmural que se asemeja mucho a las lesiones histopatológicas desarrolladas en la enfermedad de Crohn humana^19,20. Estudios...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Software de control ACT-1 Ver2.63	Nikon	DXM1200F
C1000 Termociclador táctil con módulo de reacción rápida de 96 pocillos	BIO-RAD	1851196
CFX96 Módulo de reacción óptica para sistemas de PCR en tiempo real	BIO-RAD	1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Tinte especial	Dako	AR310
Dako-Agilent Masson's Kit Tricromático ref# AR173	Dako	AR173
DXM1200 Color Digital Cámara HR	Nikon DXM1200
Eucariota 18S rRNA Control Endógeno	ThermoFisher Scientific	4352930E
E-Z Anestesia	E-Z Systems Inc.	EZ-155
GraphPad Prisma 9	GraphPad	9.0.2 (161)
Placas de PCR rígidas de 96 pocillos, perfil bajo, pared delgada, con faldón, blanco/transparente	BIO-RAD	HSP9601
HBSS (Solución salina equilibrada de Corning Hank, 1x sin calcio ni magnesio)	CORNING	21-021-CV
HM 325 Microtomo	Thermo Scientific	23-900-667
Isoflurano	Piramal	NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Sistema de imagen digital	LI-COR	9120
Mastercycler epGradient Termociclador con panel de control 5340 Termociclador	Eppendorf	5341
Catéter abierto de poliuretano de grado médico	Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Espectrofotómetros	Microscopio vertical Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800	Nikon	E800
Nitrocelulosa/Sándwiches de Papel de Filtro Paquete de 50, 0.45 μ m, 7 x 8,5 cm	BIO-RAD	1620215
Polietilenglicol 3350, Laxante Osmótico	Miralax	C8175	Dosis: 17g en 226 mL de agua
RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Columnas de Centrifugado, Tubos de Recolección (1,5 mL y 2 mL), Reactivos y Tampones sin RNasa	QIAGEN	74106
SuperScript III Sistema de síntesis de primera cadena	ThermoFisher Scientific	18080051
Ensayos de expresión génica TaqMan Rn00573960_g1 Sonda CTGF	ThermoFisher Scientific	4331182
Ensayos de expresión génica TaqMan Rn99999011_m1 Sonda IL6	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher Scientific	4444557
Tissue-Tek Prisma H& E Kit de tinción #1	Sakura	6190
Tissue-Tek Prisma Plus Tinción de portaobjetos automatizada	Sakura	6171
TNBS (solución de ácido picrilsulfónico)	SIGMA-ALDRICH	92822