Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN

Summary

La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .

Abstract

La cromatina es una estructura de orden superior que empaqueta el ADN eucariota. La cromatina sufre alteraciones dinámicas según la fase del ciclo celular y en respuesta a estímulos ambientales. Estos cambios son esenciales para la integridad genómica, la regulación epigenética y las reacciones metabólicas del ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación. El ensamblaje de la cromatina es crucial para la dinámica de la cromatina y es catalizado por las chaperonas de histonas. A pesar de los extensos estudios, los mecanismos por los cuales las chaperonas de histonas permiten el ensamblaje de la cromatina siguen siendo esquivos. Además, las características globales de los nucleosomas organizados por las chaperonas de histonas son poco conocidas. Para abordar estos problemas, este trabajo describe una técnica única de imagen de una sola molécula llamada cortina de ADN, que facilita la investigación de los detalles moleculares del ensamblaje de nucleosomas por parte de las chaperonas de histonas. La cortina de ADN es una técnica híbrida que combina la fluidez lipídica, la microfluídica y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) para proporcionar una plataforma universal para la obtención de imágenes en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. Utilizando la cortina de ADN, se investiga la función de la chaperona de histonas de Abo1, la ATPasa AAA+ que contiene bromodominios de Schizosaccharomyces pombe , y se revela el mecanismo molecular subyacente al ensamblaje de histonas de Abo1. La cortina de ADN proporciona un enfoque único para estudiar la dinámica de la cromatina.

Introduction

El ADN eucariota está empaquetado en una estructura de orden superior conocida como cromatina ^1,2. El nucleosoma es la unidad fundamental de la cromatina, que consiste en aproximadamente 147 pb de ADN envuelto alrededor de las histonas del núcleo octamérico ^3,4. La cromatina desempeña un papel fundamental en las células eucariotas; por ejemplo, la estructura compacta protege el ADN de factores endógenos y amenazas exógenas⁵. La estructura de la cromatina cambia dinámicamente de acuerdo con la fase del ciclo celular y los estímul....

Protocol

1. Preparación de la celda de flujo

1. Prepare un portaobjetos de sílice fundida limpio que contenga patrones de nanozanjas siguiendo el informe publicado anteriormente²⁵.
   1. Taladre dos orificios de 1 mm de diámetro en un portaobjetos de sílice fundida limpio (Figura 1A) con una broca recubierta de diamante (consulte la Tabla de materiales).
   2. Deposite 250 nm de aluminio grueso (Al) en el portaobjetos utilizando pulverización catódica^{de CC 32} (ver Tabla de Materiales) con 10 mTorr de gas argón.
   3. Aplicar una cap....

Results

Este trabajo describe el procedimiento para la preparación de la celda de flujo para el ensayo de cortina de ADN (Figura 1A). El ensayo de cortina de ADN facilitó el estudio del ensamblaje del dímero de la histona H3-H4 en el ADN por Abo1. En primer lugar, se comprobó la formación de la cortina de ADN tiñendo las moléculas de ADN con YOYO-1, un colorante intercalante. Se mostraron líneas verdes en matrices paralelas, lo que indica que YOYO-1 se intercaló en moléculas de ADN, que estaban bien.......

Discussion

Como técnica de imagen de una sola molécula, la cortina de ADN se ha utilizado ampliamente para sondear las reacciones metabólicas del ADN⁴³. La cortina de ADN es un sistema híbrido que concatena la fluidez lipídica, la microfluídica y el TIRFM. A diferencia de otras técnicas de una sola molécula, la cortina de ADN permite la visualización en tiempo real de alto rendimiento de las interacciones proteína-ADN. Por lo tanto, la técnica de cortina de ADN es adecuada para sondear el mecanismo detrás de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL jeringa Luer-lock	BecktonDickinson	301321
1' x 3' vidrio deslizante de silca fundida	G. Finkenbeiner		pulgada x 3 pulgadas rectangular y 10 mL de espesor
jeringa Luer-lock	BecktonDickinson
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)	Avanti	850375	Este es un componente del material lipídico biotinilado
18:1 Tapón de biotinilo PE	Avanti 870273		Este es un componente del material lipídico biotinilado
18:1 PEG2000 PE	Avanti	880130	Este es un componente del material lipídico biotinilado
Jeringa Luer-Lock de 3 mL	BecktonDickinson	302832
Válvula de inyección de muestras de 6 vías	IDEX	MX serie II
950K PMMA	All-resist	671.04
Acetona	SAMCHUN	A1759
Adenosina 5'-trifosfato sódico sódico hidrato (ATP)	Sigma	A2383
Aluminio (Al)	TASCO, Corea del Sur	LT50AI414	Diámetro 4 pulgadas, espesor 1/4 de pulgada
Filtro centrífugo Amicon Ultra, MWCO 10 kDa	Millipore	Z648027
Ampicilina	Mbcell	MB-A4128	Antibióticos
AZ 300 MIF revelador	Merck	10454110521	Se utiliza para eliminar el aluminio
Cuchilla	DORCO	DN52	12 mm x 6 m
Tricloruro de boro (BCl3)	UNIONGAS		Pureza: >99.99%
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A7030
Catalasa	Sigma	C40-1g	Este es un componente de 100x gloxiy stock
Cloro (Cl2)	UNIONGAS		Pureza: >99.99%
Cinta transparente de doble cara	3M	313770
D-(+)-glucosa	Sigma	G7528
DC sputter	Sorona	SRM-120	Se utiliza para la deposición de aluminio en una corredera
Broca recubierta de diamante	Eurotool	DIB-211.00	Se utiliza para hacer agujeros en una corredera de sílice
fusida DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
Prisma de paloma	Corea Electro-Optics Co. Ltd.	1906-106	Prisma de paloma de sílice fundida hecho a medida con recubrimiento antirreflectante
Taladro	Dremel	Dremel 3000	Se utiliza para hacer agujeros en un portaobjetos de sílice fusada
Litografía de frijol electrónico	Nanobeam Ltd.	NB3
Ácido etileno-diamina-tetraacético (EDTA)	Sigma	EDS-1KG
Accesorios de apriete con los dedos	IDEX	F-300	Se conecta con "PFA Tubing Natural" para formar un tubo luer-lock
Tuerca macho sin brida	IDEX	P-235	Se conecta con "PFA Tubing Natural" para formar tubos luer-lock
Liofilizador, HyperCOOL	Labogene	HC3110	Se utiliza para liofilizar proteínas líquidas
Glucosa oxidasa	Sigma	G2133-50KU	Este es un componente de 100x gloxinio
clorhidrato de guanidinio	Acros Organics	364790025
jeringa Hamilton	Hamilton Company	80065	Esta jeringa se utiliza para la inyección de muestras
Hellmanex III	Sigma	Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg	Cytiva	28-9893-36	Utilizado para FPLC (exclusión de tamaño)
Agitador de placa caliente	Corning	PC-420D
Ácido clorhídrico	Sigma	H1759	Tris-HCl
	ZEISS	444970-9000-000
Grabado iónico reactivo por plasma acoplado inductivamente	Top Technology Ltd.	FabStar
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	Glentham Life Sciences	GC6586-100g	Se utiliza para la inducción de la actividad de la β-galactosidasa
Fago lambda ADN	NEB	N0311
LB caldo	BD difco	244610	Medios para el crecimiento de células E. coli
Adaptador Luer 10-32	IDEX	P-659	Esto conecta luer-lock jeringa y tubo
Cloruro de magnesio hexahidratado	biorreactivos	BP214
Metil isobutil cetona (MIBK)	KAYAKU ADVANCED MATERIALS		Se utiliza para el desarrollo de soluciones
Microscopio (Eclipse Ti2)	Nikon	Eclipse Ti2	Microscopio de fluorescencia invertida
Microscopio cubreobjetos de vidrio	MARIENFELD	101142	22 x 50 mm (n.º 1)
Portaobjetos para microscopio	DURAN GROUP	DU.2355013	Portaobjetos borde rectificado de vidrio 45 grados, liso 26 x 76 mm
Nanoport	IDEX	N-333-01
Lente objetivo	Nikon	CFI Plan Apochromat VC 60XC WI	Tipo de inmersión: agua, aumento: 60x, corrección: 18, distancia de trabajo: 0,29 (0,31-0,28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS E. coli químicamente competente	Thermo Fisher Scientific	C6060-03	Célula competente para la sobreexpresión de proteínas
Oxígeno (O2)	NOBLEGAS, Corea		Pureza: >99.99%
Tubo de PFA natural	IDEX	1512L	Está conectado con "accesorios apretados con los dedos" para formar un tubo Luer-lock
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)	Roche	11359061001	Inhibidor
de la proteasaSephacryl S-200 Alta resolución	Cytiva	17-0584-01	Utilizado para FPLC (exclusión de tamaño)
Válvula de cierre	IDEX	P-732
Acetato de sodio	Sigma	791741
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma	S3014
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma	s5881
Spectra/Por tubo de membrana porosa molecular, MWCO 6-8 kDa	Spectrum laboratories	132660
Estreptavidina	Thermo Fisher Scientific	S888
Tetralfluoruro de azufre (SF4)	NOBLEGAS, Corea		Pureza: >99.99%
Bomba de jeringa	KD Scientific	78-8210
Tetrafluorometano (CF4)	NOBLEGAS, Corea		Pureza: >99.99%
TritonX-100	Sigma	T9284
Trizma base		Sigma T1503	Utilizado para Tris-HCl
TSKgel SP-5PW	TOSOH	14715	Utilizado para FPLC (intercambio iónico)
Montaje de la unión	IDEX	P-760	Esto conecta tubos
Urea	Sigma	U5378
Horno de vacío	Jeio Tech	OV-11
YOYO-1	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Este colorante de intercalación se diluye en DMSO
β-mercaptoetanol (BME)	Sigma	M6250