Análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones LMR/LPR propensos al lupus

La función principal del riñón es la eliminación de sustancias tóxicas a través de la orina, manteniendo la homeostasis del agua y las sales¹. Esta función está amenazada en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), lo que lleva a la llamada nefritis lúpica (LN). LN es una consecuencia de que el sistema inmune ataca el riñón, lo que lleva a una inflamación renal persistente, por lo tanto, pierde su capacidad para limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos. Esto eventualmente conducirá a insuficiencia renal, que puede ser fatal. Durante el proceso nefrítico, las células B circulantes, las células T y los monocitos se reclutan en el riñón, secretando quimiocinas, citoquinas y autoanticuerpos formadores de complejos inmunes. En última instancia, esto resulta en daño de las células endoteliales, lesiones membranosas, atrofia tubular renal y fibrosis².

Los ratones propensos al lupus MRL / Mp-Fas^{lpr (MRL} / lpr) son un modelo clásico de ratón que exhibe signos clínicos similares al lupus que se asemejan al LES humano³. Este modelo ha sido fundamental para comprender una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, la nefritis lúpica (LN)⁴. Tanto en el LES humano como en el ratón, la LN se caracteriza por una inflamación gradual desencadenada por la deposición renal de complejos inmunes, seguida de la activación del complemento, el reclutamiento de células inflamatorias y la pérdida de la función renal⁵. El depósito del complejo inmune es el primer paso para inducir la producción de quimiocinas y citoquinas por las células renales intrínsecas, lo que expande la respuesta inflamatoria al reclutar células inmunes⁶. El protocolo actual presenta varias técnicas para seguir la progresión de la enfermedad renal que analizan la infiltración celular y la deposición de complejos inmunes.

La orina recolectada cada semana permite la detección y visualización del curso temporal de la proteinuria antes, durante y después del inicio del lupus. La proteinuria como biomarcador puede determinar la progresión biológica de la LN. Otras ventajas de esta técnica son que no es invasiva, rentable y fácil de implementar⁷. Cuando el riñón está funcionando perfectamente, el nivel de proteinuria es consistentemente bajo; sin embargo, en ratones LMR/LPR, después de las 8-9 semanas de edad, se observa un aumento gradual del nivel de proteinuria, que finalmente es lo suficientemente alto como para causar insuficiencia renal⁸. Múltiples tiras de reactivos y reactivos colorimétricos están disponibles comercialmente para monitorear el problema. Sin embargo, el ensayo de Bradford es barato y muy preciso para determinar la aparición de proteinuria y el curso de la nefritis lúpica. Este ensayo es rápido y el reactivo no se ve afectado por la presencia de disolventes, tampones, agentes reductores y agentes quelantes de metales que pueden estar en su muestra 9,10,11.

Un aspecto importante a considerar es la infiltración celular en el riñón. Estos infiltrados promueven la patogénesis al desencadenar la secreción de factores solubles como las citoquinas para empeorar la inflamación¹². Para comprender mejor qué poblaciones celulares están presentes en los infiltrados, un método útil es aislar leucocitos¹³. Aquí, la detección de la infiltración renal de las células B se utiliza como ejemplo. El procedimiento comienza con un proceso de digestión con desoxirribonucleasa (DNasa) y colagenasa, seguido de una separación de gradiente de densidad que elimina desechos, glóbulos rojos y granulocitos densos. La razón para aislar las células B (CD19+) y las células plasmáticas (CD138⁺) es que los riñones lúpicos pueden concentrar estas células¹⁴. Se sugiere que la presencia de células B en pequeños agregados en el riñón puede indicar expansión clonal y, en consecuencia, producción de inmunoglobulina (Ig). Se sabe que las células plasmáticas también están presentes en estos agregados¹⁵. Una vez que se han aislado los leucocitos, se puede utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para analizar las células de interés al teñir con diferentes anticuerpos conjugados con fluorescencia.

La inmunofluorescencia es uno de los métodos de detección de inmunohistoquímica (IHC) que permite la visualización fluorescente de proteínas en muestras de tejido renal de 4 μm de espesor. Otros métodos de detección de IHQ dependen de la naturaleza de los analitos, la química de unión y otros factores¹⁶. La inmunofluorescencia es un método de identificación rápida que expone el antígeno a su anticuerpo homólogo marcado con un fluorocromo específico (o un colorante fluorescente). Cuando se excita, produce luz que un microscopio de fluorescencia puede detectar. Esta técnica puede ser utilizada para observar la deposición del complemento C3 e IgG2a¹⁷. La activación excesiva de la cascada del complemento podría estar asociada con una respuesta inmune incontrolada y pérdida de función¹⁸. La deposición inmune de autoanticuerpos anti-ADN bicatenario (anti-dsDNA) en el riñón es una preocupación importante¹⁹, donde aquellos con isotipo IgG2a se han asociado con LN²⁰. Específicamente, los anticuerpos anti-dsDNA exhiben más patogenicidad y afinidad con los materiales nucleares, formando complejos inmunes²¹. Cuando la IgG2a está presente, la cascada del complemento, incluyendo C3, se activa para eliminar los complejos inmunes²². Los marcadores C3 e IgG2a se pueden cuantificar individualmente o superpuestos para establecer su correlación.

En particular, la medición de la creatinina sérica es otra técnica confiable que se puede usar junto con hematuria microscópica y biopsias renales para diagnosticar LN²³. Sin embargo, la presencia de proteinuria es un fuerte indicador de daño glomerular. En ese sentido, el monitoreo del nivel de proteinuria durante el lupus puede detectar la aparición de la enfermedad y complementar otros métodos para diagnosticar el lupus. Además, los complejos inmunes depositados en los glomérulos pueden inducir una respuesta inflamatoria, activar el sistema del complemento y reclutar más células inflamatorias. Otro punto destacable de este protocolo es la infiltración de células B en el riñón. Esto, junto con las células T infiltradas, amplifica las respuestas inmunes locales que desencadenan el daño orgánico. Es importante destacar que la clasificación de LN no solo se basa en los cambios morfológicos glomerulares observados en microscopía, sino también en los depósitos inmunes observados con inmunofluorescencia. Por lo tanto, en este protocolo, se ofrecen métodos precisos y rentables para el análisis de la función renal en entornos de laboratorio.

El presente protocolo está aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Virginia Tech. Dado que la enfermedad lúpica tiene una mayor incidencia en las hembras, solo se utilizaron ratones MRL / lpr hembra. La recolección de muestras se inició a las 4 semanas de edad y terminó a las 15 semanas. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales) y fueron criados y mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos siguiendo las pautas institucionales.

1. Prueba de proteinuria

1. Recoja la orina siguiendo los pasos a continuación.
   1. Esterilice la campana rociando etanol al 70%. Coloque una lámina de plástico estéril sobre la superficie. Prepare puntas, tubos de 1,5 ml y una pipeta para recoger unos 20 μL del líquido.
      NOTA: Las puntas y los tubos deben ser estériles y sin ningún tratamiento previo.
   2. Tome la jaula y rocíe etanol al 70% antes de ponerla dentro de la capucha.
   3. Sostenga el mouse con una mano y use la otra mano para masajear suavemente el área ventral de arriba a abajo.
   4. Use un tubo o pipeta de 1.5 ml para recolectar la orina directamente, o si la muestra cae, recójala de la lámina de plástico. Use guantes, sábanas y puntas nuevas para cada muestra.
      NOTA: Si esto no funciona, use un vaso de precipitados estéril para aislar al ratón, luego recoja la orina del vaso de precipitados después de que el ratón orine.
   5. Vuelva a colocar el ratón en la jaula. Saque otro ratón y repita los pasos 1.1.3-1.1.4.
      NOTA: Siempre limpie la lámina de plástico y el vaso de precipitados con etanol al 70% después de recolectar la muestra para cada ratón. Se necesitan al menos cinco ratones por grupo para la significación estadística. Las muestras de orina pueden almacenarse a -80 °C hasta su uso durante un máximo de 12 meses.
2. Cuantificar las proteínas por el método de Bradford²⁴.
   1. Permita que las muestras de orina, la albúmina estándar y el reactivo Bradford alcancen la temperatura ambiente (RT) manteniéndolas fuera del congelador durante 10-20 minutos.
      NOTA: El reactivo Bradford y el estándar de albúmina se incluyen en un kit disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales). La concentración inicial del estándar de albúmina es de 2 mg/ml. Las diluciones seriadas (1:2 seis veces) deben hacerse con agua.
   2. Agregue el reactivo Bradford a una placa de 96 pocillos (200 μL/pocillo), sin diluir.
   3. Pipetear 5 μL de muestra de orina sin diluir por pocillo y usar la punta para pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar correctamente.
   4. Agregue estándares (400, 200, 100, 50, 25, 12.5 mg / dL) por duplicado. Deje un par de pozos como espacios en blanco.
      NOTA: La adición de muestras y estándares debe hacerse rápidamente.
   5. Déjelo reposar durante 5-10 minutos en RT.
   6. Lea la placa a 595 nm en un lector de placas según el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).

2. Aislamiento de las células renales

1. Eutanasia al ratón con_CO2 (caudal: 30%-70% volumen/min, para lograr la inconsciencia o la muerte) en una cámara seguida de luxación cervical. Proceda con la disección para recolectar ambos riñones. Coloque un riñón y medio en un medio C10 helado. Poner la otra mitad del riñón en OCT (paso 3.1.1).
   NOTA: C10 está hecho con RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1 mM de piruvato de sodio, 1% de 100x aminoácidos no esenciales MEM, 10 mM de HEPES, 55 μM de 2-mercaptoetanol y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de materiales).
2. Cortar los riñones en tamaño de grano (1-2 mm³ piezas) y digerir en 5 mL de tampón de digestión que contenga 1 mg/mL de colagenasa y 0,2 mg/ml de DNasa I (ver Tabla de materiales) en medio RPMI 1640 que contiene 10 mmol/L de HEPES durante 1 h con agitación suave continua a 37 °C.
   NOTA: Agregue 1 ml de tampón de digestión en un tubo estéril de 2 ml y use tijeras estériles para cortar el riñón.
3. Añadir 10 ml de 1x PBS helado que contenga 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 10 min en hielo. Luego vortex la suspensión dos veces.
4. Filtrar la suspensión celular a través de un colador de 100 μM y lavar con 10 ml de HBSS-full.
   NOTA: HBSS-full contiene 5 mM de EDTA, 0.1% BSA y 10 mM de HEPES.
5. Centrífuga a 350 x g durante 10 min a RT.
6. Prepare una solución de percoll isotónico (SIP) al 30%, 37% y 70%.
   NOTA: Mezcle 1 parte de volumen de 10x PBS y 9 partes de volumen de Percoll para preparar SIP (ver Tabla de materiales); use HBSS-full para diluir SIP al 30%, 37% y 70% SIP.
7. Resuspender las células en 5 mL de 30% SIP y cargar 37% de 5 mL (arriba) y 70% de 5 mL (abajo), haciendo gradiente SIP, lentamente con una pipeta paster.
8. Centrífuga con Up9 down0 (o freno 0) a 1000 x g durante 30 min a RT.
9. Recoger leucocitos de la interfaz 37%-70% y resuspenderlos en 5 mL de C10.
10. Centrifugar a 350 x g durante 10 min a 4 °C.
11. Resuspender el pellet celular en 3 ml de tampón FACS. Las células están listas para la tinción del FACS.
    NOTA: El tampón FACS contiene 1x PBS y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA).
12. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante (SN), dejando unos 50 μL.
    NOTA: Para eliminar el sobrenadante, vierta o pipete cuidadosamente la solución lejos del sólido o use un vacío semiautomático para aspirar el sobrenadante.
13. Agregue 50 μL de bloque FcR (consulte la Tabla de materiales) por tubo (prediluido 1/50 en 1x PBS); Mezclar e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 minutos.
14. Añadir 2 ml de tampón FACS para lavar.
15. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar SN, dejando unos 50 μL.
16. Agregue 20 μL del colorante fluorescente apropiado (diluya 1/100 con 1x PBS, consulte la Tabla de materiales) y déjelo reposar durante 15-30 minutos en hielo.
17. Agregue 50 μL de mezcla de anticuerpos 15 por tubo: CD138-BV711 (1/200 en 1x PBS) y CD45-AF700 (1/200 en^1x PBS) (ver Tabla de materiales).
18. Incubar en hielo en la oscuridad durante 15-30 minutos y añadir 3 ml de tampón FACS.
19. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar SN, dejando unos 50 μL. Resuspender en 200 μL de 1x PBS. Esto ahora está listo para ser analizado por citometría de flujo.

3. Tinción inmunofluorescente

1. Realice la recolección de muestras.
   1. Incruste el medio riñón en el criomold plástico pequeño con el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) (consulte la Tabla de materiales).
   2. Agregue hielo seco en una caja de espuma de poliestireno (consulte la Tabla de materiales) y coloque cuidadosamente el criomold sobre el hielo seco. Asegúrese de que los criomoldes estén colocados planos.
      NOTA: El compuesto OCT tarda 3-4 minutos en solidificarse y volverse blanco.
   3. Saque el criomold y envuélvalo en papel de aluminio. Almacénelo a -80 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: Esto se puede almacenar a -80 ° C durante al menos 1 año.
2. Realizar seccionamiento y fijación de la muestra.
   1. Cortar las muestras en secciones de 4 μm, esperar al menos 2-3 h para que se sequen y luego fijar con acetona fría (a 4 °C) durante 10 min.
      NOTA: Tenga cuidado al usar acetona, que requiere una campana química especializada.
   2. Después de fijar los portaobjetos, secar al aire durante 0,5-1 h y almacenarlos durante un corto período de tiempo a -20 °C, o durante mucho tiempo a -80 °C.
3. Manchar las muestras.
   1. Vuelva a fijar los portaobjetos en acetona fría durante 5-10 min.
   2. Deje que las secciones se calienten a RT. Use un bolígrafo PAP (consulte Tabla de materiales) alrededor de la sección y deje que se seque.
      NOTA: El esmalte de uñas también se puede usar. Este paso evita que la dilución de anticuerpos flote por todo el portaobjetos.
   3. Coloque los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) en el frasco de Coplin (consulte la Tabla de materiales) durante 20 minutos, coloque el frasco en la coctelera y agite suavemente.
   4. Vierta 1x TBS y llene el frasco con 1x TBS, 5% BSA y 0.1% Tween 20. Incubar durante 20 minutos en la coctelera, agitar suavemente.
   5. Saque los portaobjetos y seque la parte inferior de los portaobjetos. Si es necesario, seleve los portaobjetos en seco. Agregue 100 μL de anticuerpos conjugados²⁵ C3-FITC (1/100) e IgG2a-PE (1/100) a la sección (ver Tabla de materiales). Incubar a RT en una cámara humidificada durante 1 h.
   6. Lave la sección 3 veces en 1x TBS, 5% BSA y 0.1% Tween 20 durante 10 min en la coctelera.
   7. Seque las guías y monte la sección con un reactivo antidecolorante (consulte la Tabla de materiales) y luego un cubreobjetos.
   8. Guarde los portaobjetos a 4 °C hasta que los vea bajo el microscopio (por ejemplo, microscopio confocal o microscopio de sistema de imágenes). Cuantifique imágenes usando software y reste señales de fondo al comparar la intensidad de fluorescencia entre regiones.
   9. Para el análisis de imágenes utilizando el software ImageJ (consulte Tabla de materiales), describa la región deseada.
   10. Establezca parámetros estándar haciendo clic en Analizar, luego Establecer medidas y Área de medida para obtener los resultados.
   11. Transfiera los datos obtenidos de las ventanas de medida a una hoja de cálculo.
       NOTA: Se puede seleccionar un área pequeña de la imagen como fondo; No debería tener fluorescencia.
   12. Una vez hecho esto, haga clic en Analizar para medir la región y transferir los datos nuevamente a la hoja de cálculo anterior.
   13. Repita los pasos 3.3.11-3.3.12 para varias regiones.
   14. Calcule la fluorescencia media como fluorescencia celular corregida (CCF) = densidad integrada - (región celular seleccionada x fluorescencia media de fondo).
   15. Calcule para cada región y analice los datos utilizando el software de gráficos y estadísticas (consulte la Tabla de materiales).

El protocolo utiliza múltiples métodos para evaluar los ratones MRL/lpr para la nefritis lúpica. En primer lugar, se describe un procedimiento para estudiar el aumento de los niveles de proteinuria debido a la disfunción renal a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 1, los ratones hembra fueron tratados con sonda oral de 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) como grupo control y probiótico Lactobacillus reuteri como grupo de tratamiento, a una concentración de 109 ufc/ml, dos veces por semana. El tratamiento comenzó a las 3 semanas de edad y terminó a las 15 semanas de edad. El grupo de ratones tratados con L. reuteri tuvo una progresión de proteinuria más agresiva que el grupo control.

Figura 1: Detección de niveles de proteína en la orina de ratones MRL/lpr a lo largo del tiempo. n = 5 ratones por grupo. La estadística se realizó con la prueba de regresión lineal simple. *P < 0,05, **P < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 2 muestra el análisis FACS de los leucocitos renales aislados. Los ratones fueron tratados con vancomicina (2 g / L) o vancomicina más E. coli dsDNA (80 μg) en este experimento . La vancomicina se administró junto con el agua potable durante el período de tiempo indicado. Se administró un sonda oral de ADN bacteriano a los ratones tratados con vancomicina una vez a la semana durante cuatro semanas consecutivas a las 4, 5, 6 y 7 semanas de edad. Se esperaba que E. coli dsDNA desencadenara la infiltración renal de las células plasmáticas que conduce a una función renal comprometida, pero no se encontraron diferencias significativas.

Figura 2: Análisis de células plasmáticas en leucocitos renales aislados. (A) Estrategia de activación secuencial: células totales, células individuales, células vivas, células CD45+ y, finalmente, células CD138+. (B) Porcentaje de células plasmáticas después del tratamiento con van (Vancomicina) o van + ADN (Vancomicina + E. coli dsDNA) durante 3 semanas (n ≥ 5 ratones por grupo). No se observó significación estadística ('ns'). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 3 muestra la tinción por inmunofluorescencia del complemento C3 e IgG2a en secciones renales LMR/lpr femeninas. En este experimento, se comparó el efecto de los factores ambientales con respecto a la deposición renal de C3 e IgG2a. Los ratones internos fueron criados en la instalación de animales durante varias generaciones, y se compararon con ratones comprados recientemente a un proveedor. El análisis inmunohistoquímico no mostró diferencias entre las diferentes instalaciones.

Figura 3: Detección de complemento C3 e IgG2a en secciones renales mediante tinción por inmunofluorescencia. (A) Imágenes representativas de secciones renales teñidas con anti-C3-FITC (verde) y anti-IgG2a-PE (rojo). (B) Comparación de la fluorescencia celular corregida (CCF) entre los dos grupos (n ≥ 5 ratones por grupo). Barra de escala = 100 μM. No se observó significación estadística ('ns'). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.