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Análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones LMR/LPR propensos al lupus

DOI:

10.3791/63506

⸱

June 8th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

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El presente protocolo describe un método para rastrear la progresión del lupus en ratones. Se presentan dos procedimientos adicionales para caracterizar la nefritis lúpica basada en la infiltración celular y la deposición de proteínas en los riñones.

Abstract

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El lupus eritematoso sistémico (LES) es un trastorno autoinmune sin cura conocida y se caracteriza por una inflamación persistente en muchos órganos, incluidos los riñones. En tales circunstancias, el riñón pierde su capacidad de limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos, lo que eventualmente conduce a insuficiencia renal. Las mujeres, particularmente las en edad fértil, son diagnosticadas nueve veces más a menudo que los hombres. La enfermedad renal es la principal causa de mortalidad en pacientes con LES. El presente protocolo describe un método rápido y simple para medir los niveles de proteína excretada en la orina recolectada, rastreando la progresión del lupus a lo largo del tiempo. Además, se proporciona un enfoque para aislar células mononucleares renales basado en la selección de tamaño y densidad para investigar la infiltración renal de leucocitos. Además, se ha desarrollado un método inmunohistoquímico para caracterizar la deposición de proteínas en los glomérulos y la infiltración leucocitaria en el espacio tubulointersticial. Juntos, estos métodos pueden ayudar a investigar la progresión de la inflamación crónica asociada con los riñones de ratones MRL / lpr propensos al lupus.

Introduction

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La función principal del riñón es la eliminación de sustancias tóxicas a través de la orina, manteniendo la homeostasis del agua y las sales1. Esta función está amenazada en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), lo que lleva a la llamada nefritis lúpica (LN). LN es una consecuencia de que el sistema inmune ataca el riñón, lo que lleva a una inflamación renal persistente, por lo tanto, pierde su capacidad para limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos. Esto eventualmente conducirá a insuficiencia renal, que puede ser fatal. Durante el proceso nefrítico, las células B circulantes, las células T y....

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Protocol

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El presente protocolo está aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Virginia Tech. Dado que la enfermedad lúpica tiene una mayor incidencia en las hembras, solo se utilizaron ratones MRL / lpr hembra. La recolección de muestras se inició a las 4 semanas de edad y terminó a las 15 semanas. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales) y fueron criados y mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos siguiendo las pautas institucionales.

1. Prueba de proteinuria

  1. Recoja la orina siguiendo los pasos a continuación.
    1. Esteri....

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Results

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El protocolo utiliza múltiples métodos para evaluar los ratones MRL/lpr para la nefritis lúpica. En primer lugar, se describe un procedimiento para estudiar el aumento de los niveles de proteinuria debido a la disfunción renal a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 1, los ratones hembra fueron tratados con sonda oral de 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) como grupo control y probiótico Lactobacillus reuteri como grupo de tratamiento, a una concentr.......

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Discussion

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La LN es una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, y los factores que agravan la enfermedad siguen sin estar claros. La aplicación de este protocolo consiste en caracterizar la función renal utilizando múltiples métodos, incluida la medición de proteinuria, el análisis FACS de leucocitos renales aislados y la tinción por inmunofluorescencia de secciones renales congeladas.

Un punto importante a considerar al recolectar orina es que uno tiene que ser consistente con la h.......

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Disclosures

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Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Acknowledgements

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Agradecemos a la Flow Cytometry Core Facility, al Laboratorio de Histopatología, al Centro de Imágenes Fralin del Instituto Politécnico de Virginia y a la Universidad Estatal por su apoyo técnico. Este trabajo es apoyado por varios NIH y subvenciones internas.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x solución salina tamponada Tris (TBS)Thermo Fisher ScientificJ60764. K2
2-mercaptoetanolThermo Fisher Scientific21985-023
Anti-Humano/Ratón C3CedarlánCL7632F
Anti-Ratón CD138 BV711Biolegend142519
Anti-Ratón CD45 AF700Biolegend103127
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA9418-100G
Colagenasa DSigma-Aldrich11088882001
Microscopio Confocal LSM 880ZeissLSM 880
Tarro CoplinFisher Scientific50-212-281
CryomoldFisher ScientificNC9511236
Medio de gradiente de densidadGE Healthcare17-1440-02Percoll
Agua tratada con DEPCThermo Fisher ScientificAM9906
DNasa ISigma-AldrichD4527
dsDNA-ECInvivoGentlrl-ecdna
Ácido etilendiaminotetraacéticoFisher ScientificS311-500EDTA
EVOS M5000 Sistema de imagen para microscopioThermo Fisher ScientificAMF5000
FACS Fusion ClasificadorBiosciencesFACS Fusion
Suero Fetal Bovino - Premium, Inactivado por CalorR& Sistemas DS11150H
Placas de poliestireno de 96 pocillos FisherbrandPrisma Graphpad Scientific12-565-501
GraphPad N/A
Hank' s Solución salina equilibradaThermo Fisher Scientific14175-079
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
Software ImageJInstitutos Nacionales de SaludN/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.ATCC23272
MEM aminoácidos no esencialesThermo Fisher Scientific11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Ratones (MRL/lpr)Jackson Lab485
Esmalte de uñasN/AN/ACualquier tienda convencional
Compuesto O.C.TTisse-Tek4583
Bolígrafo PAPSigma-AldrichZ377821
Moldes de inclusión desechables Peel-A-WayPolysciencesR-30
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15140-122
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific70011069
Pierce 20x TBS BufferThermo Fisher Scientific28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kitde ensayoThermo Fisher Scientific23236Estándar de albúmina incluido
ProLon Gold Mountant Anti-FadingThermoFisherP36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32BD Biosciences553141FcR
block RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Piruvato de sodioThermo Fisher Scientific11360-070
SpectraMax M5Molecular DevicesN/ASoftMax Pro 6.1
software Filtros de células estériles 100 y micro; MFisher Scientific22363549
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Clorhidrato de vancomicinaGoldbioV-200-1
Zombie AquaBiolegend423102colorante fluorescente para el análisis de citometría de flujo
BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al.

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